Reunión 1: Hermosillo, Sonora a Jueves 5 de Septiembre, 2013

Reunión 1:
Hermosillo, Sonora a Jueves 5 de Septiembre, 2013.
Asistentes:
Dra. Adriana Muhlia
Q.B. Sandra Araujo Bernal
cI.B. Ofelia Alejandra Méndez
Asunto a Tratar:
-Diseño de Sondas Taqman y primers para los genes de las enzimas antioxidantes del camarón blanco
Litopenaeus vannamei.
GUIA Y CRITERIOS PARA DISEÑAR LOS PRIMERS Y LAS SONDAS:
1. Evitar diseñar primers en la región no traducida (UTR por sus siglas en ingles).
2. Elegir la secuencia de referencia, de preferencia algo reportado en el GenBank. Si es gen hay que
tener bien localizados los intrones y exones, si es ARNm no hay problema.
3. Es preferible diseñar los primers en el extremo 3` de la secuencia- porque la eficiencia de
síntesis del ADNc va a ser mayor en este extremo del transcrito.
4. SONDA TAQMAN
-Las sondas deben tener entre 18 y 30 pb de longitud y nunca ser menores de 13 pb. Las sondas
de mayor tamaño son menos eficientes en el opacamiento, pues están muy lejos el fluoróforo
del opacante y son más costosas.
- Las sondas deben tener una Tm de 68-70 ° C, osea 10 °C más que los primers, lo cual asegura
que la sonda esta completamente hibridada durante la extensión de los primers.
-Si la sonda va a ser marcada con FAM, esta no debe empezar con una G, si es posible la G debe
estar al menos 2 pb lejos del extremo 5´-.
-La sonda debe tener más Cs que Gs (cuando menos 2), esto reduce las interacciones entre las
G.
-Las sondas no debe tener secuencias corridas de un mismo nucleótido, especialmente no más
de 4 GGs consecutivas.
-El extremo 5´- de la sonda, debe estar lo mas cerca posible del primer forward
5. PRIMERS
-Diseñar los primers, lo mas cerca posible de la sonda, sin que se sobrelapen.
-Los primers deben tener una TM entre 58 y 60 °C y debe ser igual o muy parecida entre ellos.
-La longitud de los primers debe ser mayor de 17 pb (17- 25pb, idealmente)
-El contenido G+C debe estar entre el 30 y el 80%. Las secuencias con un porcentaje mayor a
80% no se desnaturalizan adecuadamente.
-Los primers no deben tener secuencias corridas de un mismo nucleótido, especialmente no más
de 4 GGs consecutivas.
-Los últimos nucleótidos del extremo 3´- no deben tener más de 2 GGs o CCs.
-El tamaño de los amplicones no debe exceder las 300 pb (idealmente entre 50 y 150 pb), los
amplicones mas pequeños dan resultados mas consistentes.
-Los primers no deben formar dimeros ni estructuras secundarias.
Se pidió cotización del diseño y síntesis de las sondas taqman para los genes: catalasa (CAT), superoxido
dismutasa de manganeso (MnSOD), glutatión-peroxidasa (GPX), tiorredoxina (TRX), citocromo c oxidasa
subunidad II (COX2) y la proteína ribosomal L8, con los proveedores comerciales Sigma Genosys y
Applied, con los criterios descritos previamente.
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Dra. Adriana Muhlia A.
Q.B. Sandra Araujo Bernal
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cI.B. Ofelia Alejandra Méndez R.