ESTUDIO INTEGRAL Y SISTEMAS DE DETECCION DEL AGENTE CAUSAL DE LA PUDRICION BLANCA DEL AJO: SCLEROTIUM CEPIVORUM Resumen ejecutivo Los objetivos y avances de este proyecto fueron: a) obtener marcadores moleculares específicos del genoma de Sclerotium cepivorum, los cuales ya se tienen; b) validar los marcadores moleculares en muestras de suelo y semillas en muestras de campo. Se enfrentaron muchos problemas para obtener la reproducibilidad de los resultados de las amplificaciones, porque hubo mucha interferencia con los restos orgánicos de las muestras de suelo; c) purificar proteínas involucradas en el desarrollo del hongo, para que sirvan como marcadores moleculares con el fin de determinar la presencia del patógeno en suelo y semilla, para lo cual se purificó la proteína de desarrollo Sc1. El análisis de su secuencia peptídica presento homología con una proteína hipotética registrada en el genoma de Sclerotinia sclerotiorum. Se cuenta ya con el marco de lectura abierto para continuar con la estrategia de RNA de interferencia con el fin de disminuir los niveles de expresión de la proteína Sc1 y ver su efecto en la formación del esclerocio; d) observar el efecto sobre la formación de esclerocios en los diferentes aislados de la región al utilizar inhibidores de la enzima encargada de la síntesis de poliaminas. Los resultados obtenidos permiten detectar cepas que son más sensibles a los inhibidores que otras, ya que se observaron desde la inhibición total de la formación de esclerocios, hasta una inhibición del 50%; e) observar el efecto sobre el crecimiento y la formación de esclerocios de los diferentes aislados de la región al utilizar un agente de biocontrol. Al respecto, se determinó el efecto de un agente de biocontrol mejorado genéticamente y se encontró que ninguno de los aislados es resistente al efecto del agente biocontrolador; también se detectó que la presencia del agente inhibe la formación de los esclerocios y polariza la presencia de éstos. En la búsqueda de marcadores moleculares específicos para Sclerotium cepivorum, se utilizó el DNA de una cepa control de Sclerotium cepivorum (cepa Sc), y se probaron 136 iniciadores inespecíficos, de los cuales se conservaron los que dieron un patrón claro de amplificación a 50°C y que el tamaño de las bandas amplificadas fuera de un rango entre 300 a 2,000 pares de bases (PB). Para la caracterización de proteínas involucradas en el desarrollo del esclerocio, se caracterizó molecularmente una proteína llamada Sc1, cuya presencia se detectó en el esclerocio, aun cuando todavía no es claro el papel que tiene en el desarrollo o en la viabilidad del hongo. Sin embargo, se tiene como antecedente la purificación de esta proteína denominada Sc1, la cual se presenta cuando empieza la formación del esclerocio. Con el fin de obtener anticuerpos contra del proteínas del esclerocio, se obtuvieron anticuerpos contra las isoformas 1 y 2, para lo cual se purificó una mayor cantidad de proteína, se sometió a electroforesis en doble dimensión como se describió anteriormente, se cortaron las manchas correspondientes a las proteínas, se mezclaron con 0.5 ml de adyuvante de Freund y se homogenizaron para inyectar un conejo de raza Nueva Zelanda con cada una de las proteínas, las inyecciones se repitieron cada 15 días hasta completar un total de cinco inmunizaciones. A partir de la tercera inmunización se sangraron a los conejos para medir la producción de anticuerpos por medio de la técnica de ELISA, utilizando como segundo anticuerpo chivo anti-conejo acoplado a peroxidada. Los conejos se sangraron totalmente, se recuperó el suero el cual se tituló para los anticuerpos de interés. Estos anticuerpos podrán utilizarse para la localización intracelular de las proteínas, así como para determinar si ambas son antigénicamente similares. Para determinar la composición de la pared celular de Sclerotium cepivorum, se obtuvo micelio y esclerocios de S. cepivorum creciendo al hongo en medio Vogel y PDA (agar dextrosa papa) respectivamente. Tanto el micelio como los esclerocios se resuspendieron en Tris-HCl 10 mM de pH 7, se sometieron a rompimiento balístico en un homogenizador Braun. En cuanto a la implementación de un método rápido para la obtención de DNA a partir de semillas de ajo contaminadas con Sclerotium Cepivorum, se estuvieron probando diferentes estrategias para obtener DNA de buena calidad a partir ajos contaminados. Se probaron tres métodos rápidos de extracción de DNA que involucran la utilización de polietilenglicol 2000 y un método físico, utilizando ondas de baja energía (microondas). El DNA obtenido se puede utilizar para la técnica de PCR, utilizando los iniciadores ya probados para que se acorte el tiempo de detección del hongo patógeno en semillas. La última etapa correspondió a la determinación de la interacción de la cepta mutante Δtvk-1 del hongo biocontrolador Trichoderma virens con Sclerotium cepivorum Berk, para lo cual se utilizó la cepa mutante de una MAPK de Trichoderma virens, llamada Δtvk-1, ya que está reportado que tiene incrementada su capacidad de mico parasitismo, la cual se confrontó con aislados representativos de toda la colección del laboratorio. Demanda o problemática que atiende Avanzar en la elaboración de un método de diagnóstico simple, rápido y eficiente que pueda detectar la presencia del hongo Sclerotium en el suelo y en la semilla. Profundizar los estudios genómicos que lleven a la detección de ese agente causal de la pudrición blanca del ajo. Resultados obtenidos y/o descripción. Características de la tecnología generada Se tienen las bandas de amplificación detectadas y clonadas, así como la secuencia de todas las bandas y el diseño de cuando menos cuatro nuevos iniciadores específicos. Falta probarlos con las demás cepas y organismos presentes en suelo. Identificación de las bandas que co-migran con el mismo peso molecular de la proteína Sc1 y se obtuvieron anticuerpos contra éstas. Estos anticuerpos permitirán detectar la presencia de la proteína en los esclerocios y en el micelio. Se caracterizaron los aislados con respecto al grupo de anastomosis, sensibilidad a un agente de biocontrol y a un agente químico. Impactos Destaca la creación de un nuevo método de detección molecular a partir de muestras de suelo, ya que los métodos que se han reportado para obtener DNA de muestras de suelo utilizan compuestos muy contaminantes, por tal motivo se trabajó en el diseño de una técnica que permita detectar a Sclerotium cepivorum en suelo sin generar muchos residuos contaminantes del medio ambiente. Costos estimados de la aplicación de los resultados y/o tecnología generada No se puede estimar el costo, en virtud de que los estudios genómicos son parte de un quizá largo proceso científico. Ámbito de aplicación Comunidad científica nacional. Información adicional o comentario Sclerotium cepivorum es un hongo fitopatógeno de las plantas del género Allium. En el ajo produce una enfermedad conocida como “pudrición blanca”, la cual impacta en la producción de esta hortaliza en la región del Bajío, ocasionando pérdidas económicas importantes para los productores de la región. La estructura de resistencia y reproducción de Sclerotium cepivorum son los esclerocios, los cuales permanecen viables en el suelo hasta por 20 años y pueden diseminarse de un campo de cultivo a otro muy fácilmente. Clave del proyecto: SAGARPA 2005-C01-11919 Sistema Producto y/o línea estratégica de atención: Sistema Producto Ajo; fitomejoramiento. Investigador: doctora PATRICIA PONCE NOYOLA Institución: