Seminario 1 - Facultad de Medicina

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA, PARASITOLOGÍA E
INMUNOLOGÍA
MICROBIOLOGÍA II
SEMINARIO 1
DIAGNÓSTICO
MICROBIOLOGICO
OBJETIVOS
CONOCER EL ALGORITMO DEL
DIAGNÓSTICO MICROBIOLOGICO
CONOCER DIFERENTES
PROCEDIMIENTOS DEL DIAGNOSTICO
MICROBIOLOGICO.
INTERPRETAR PARAMETROS DE
SENSIBILIDAD (S), ESPECIFICIDAD (E),
VALOR PREDICTIVO POSITIVO (VPP) Y
VALOR PREDICTIVO NEGATIVO (VPN)
DIAGNÓSTICO MICROBIOLOGICO
ENFERMO
DIAGNÓSTICOS
DIFERENCIALES
INFECCION?
SIGNOS
SÍNTOMAS
¿ENFERMEDAD Y?
¿ENFERMEDAD Z?
estudios para Y
estudios para Z
DIAGNOSTICO
PRESUNTIVO
ESTUDIO
MICROBIOLOGICO
DIAGNOSTICO DE
CERTEZA
TRATAMIENTO
DIAGNÓSTICO MICROBIOLOGICO
SELECCION DE LA MUESTRA
–Toma de muestra
TRANSPORTE Y CONSERVACION
PROCESAMIENTO/ DIAGNOSTICO.
Diagnóstico
Microbiológico
Directo
Indirecto
DIAGNÓSTICO MICROBIOLOGICO
Especificidad y sensibilidad
Son parámetros matemáticos.
Los cálculos se basan en casos positivos y negativos.
Reflejan la correcta (verdadera) o incorrecta (falsa
identificación):
Del microorganismo.
De los componentes del microorganismos (antígenos,
ácidos nucleicos).
De la respuesta inmune frente a la infección
Sensibilidad (S): la probabilidad que el paciente con una
infección determinada por el método de referencia sea
positivo por prueba en estudio.
Que buscamos nosotros
Alta sensibilidad: Una prueba POSITIVA en individuos
infectados.
Sensibilidad=VP/(VP+FN)
VN
FP
FN
VP
Mide la proporción (%) de
infectados que son identificados con
el test en estudio
Especificidad (E): la probabilidad (%) de clasificar
correctamente a un individuo como no infectado
(determinada por el método de referencia) sea negativo
por la prueba en estudio.
Que buscamos nosotros
Alta especificidad: Una prueba NEGATIVA en
individuos no infectados.
VN
FN
FP
VP
Especificidad =VN/(VN + FP)
Mide la proporción (%) no
infectados que son identificados por
el test en estudio
Valor predictivo positivo (VPP)
ANTE UN RESULTADO POSITIVO
¿ Cuál es la probabilidad de que el
individuo padezca la infección ? VPP
VN
FP
FN
VP
VPP=VP/(FP + VP)
Cuanto mayor es el valor,
mayor
PROBABILIDAD de
que un individuo con prueba
positiva posea la infección
Valor predictivo negativo (VPN)
ANTE UN RESULTADO NEGATIVO
¿ Cuál es la probabilidad de que el
individuo no presente la infección ?
VPN
VN
FP
FN
VP
VPN=VN/(VN + FN)
Cuanto mayor es el valor, mayor PROBABILIDAD de
que un individuo no presente la infección
Prevalencia
• Describe el número de casos actuales de una
infección/enfermedad en la población en el
momento de la observación.
Cociente entre infectados/enfermos ( verdaderos
positivos) y el total de la población expresado
en %.
• En una población de 2.800.000 habitantes,
se realizan test diagnósticos de referencia y
se comparan con un nuevo test diagnóstico
para HIV, los resultados son los siguientes:
5970 como verdaderos positivos y 30 como
falsos negativos; 13.970 como falsos
positivos y 2.780.030 verdaderos negativos.
• ¿Cual es la prevalencia de la infección, la
sensibilidad, especificidad VPP y VPN del
nuevo test?
CAPACIDAD PREDICTIVA DE UNA PRUEBA
DIAGNOSTICA
PRUEBA
RESULTADO DE
LA PRUEBA
DIAGNOSTICA
POSITIVO
NEGATIVO
TOTAL
DE
POSITIVO
NEGATIVO
TOTAL
5970
13.970
19.940
30
6000
2.780.030
2.794.000
2.780.060
2.800.000
S=VP/(VP+FN)
S=
E=VN/(VN + FP)
E=
VPP=
VPP=VP/(FP + VP)
REFERENCIA
VPN=VN/(VN + FN) VPN=
Prevalencia=
CAPACIDAD PREDICTIVA DE UNA PRUEBA
DIAGNOSTICA
PRUEBA
RESULTADO DE
LA PRUEBA
DIAGNOSTICA
POSITIVO
NEGATIVO
TOTAL
DE
REFERENCIA
POSITIVO
NEGATIVO
TOTAL
5970
13.970
19.940
30
6000
2.780.030
2.794.000
2.780.060
2.800.000
S=VP/(VP+FN)
S= 99,50
E=VN/(VN + FP)
E= 99,50
VPP= 29,94
VPP=VP/(FP + VP)
VPN=VN/(VN + FN) VPN=100
Prevalencia= 0,21%
• En otra población de 2.800.000 habitantes,
se realizan test diagnósticos de referencia
para HIV y se compara con el mismo nuevo
test diagnóstico, los resultados son los
siguientes: 796.000 como verdaderos
positivos y 4000 como falsos negativos;
10000 como falsos positivos y 1.990.000
verdaderos negativos.
• ¿Cual es la prevalencia de la infección la
sensibilidad, especificidad VPP y VPN del
nuevo test?
CAPACIDAD PREDICTIVA DE UNA PRUEBA
DIAGNOSTICA
PRUEBA
RESULTADO DE
LA PRUEBA
DIAGNOSTICA
POSITIVO
NEGATIVO
TOTAL
DE
REFERENCIA
POSITIVO
NEGATIVO
TOTAL
796.000
10.000
806.000
4.000
800.000
1.990.000
2.000.000
1.994.000
2.800.000
S=VP/(VP+FN)
S=
E=VN/(VN + FP)
E=
VPP=VP/(FP + VP) VPP=
VPN=VN/(VN + FN) VPN=
Prevalencia=
CAPACIDAD PREDICTIVA DE UNA PRUEBA
DIAGNOSTICA
PRUEBA
RESULTADO DE
LA PRUEBA
DIAGNOSTICA
POSITIVO
NEGATIVO
TOTAL
DE
REFERENCIA
POSITIVO
NEGATIVO
TOTAL
796.000
10.000
806.000
4.000
800.000
1.990.000
2.000.000
1.994.000
2.800.000
S=VP/(VP+FN)
S= 99,50
E=VN/(VN + FP)
E=99,50
VPP=VP/(FP + VP) VPP= 98,76
VPN=VN/(VN + FN) VPN= 99,80
Prevalencia= 28,57%
Compare los resultados de S, E, VPP
y VPN con prevalencia distintas
• En este cuadro de doble entrada ¿cuál es el
elemento mas importante para considerar que los
resultados obtenidos del nuevo test son ciertos?
Compare los resultados de S, E, VPP
y VPN con prevalencia distintas
Patrón de oro o Gold Standart
• En este cuadro de doble entrada ¿cuál es el
elemento mas importante para considerar que los
resultados obtenidos del nuevo test son ciertos?
TOMA DE MUESTRA
Preparación del paciente
Recolección
Transporte
Conservación
CONCEPTOS BASICOS PARA LA TOMA DE
MUESTRA
Elegir el material que mejor represente el proceso
infeccioso.
Tomar la muestra en el momento adecuado y en lo
posible antes de que el paciente reciba antimicrobianos.
Obtener la muestra evitando contaminarla con la flora
normal del paciente.
Tamaño de la muestra adecuado.
Evitar el agregado de ATB que inhiban el desarrollo.
Utilizar un recipiente estéril y adecuado para su
conservación y transporte
Identificar la muestra correctamente.
Enviar al laboratorio lo más rápidamente posible.
TOMA Y CONSERVACION DE LAS
MUESTRAS
Las muestras para estudios microbiológicos requieren la
utilización de medios de transporte:
Para Cultivo:
Mantener viables los microorganismos en la muestra.
Evitar la proliferación de contaminantes.
La mayoría de estos microorganimos son sensibles a la
desecación y en algunos casos a la temperatura.
Por ello necesitamos de
LOS MEDIOS DE TRANSPORTES
Medios de transportes de las muestras
Los medios de transporte que se utilizan con mayor
frecuencia son:
Medio de Stuart
Medio de Cary Blair
Medio para anaerobios (PRAS)
Medio para Chlamydia
Medio para Mycoplasma
Formol
PVA (fenol-alcohol-formol)
Medio de transporte para virus
Parasitología
QUE HAGO CON LA MUESTRA? I
¿COMO LA CONSERVO? Bacterio- Micología
MATERIAL
ALMACENAMIENTO
CONSERVACION
Liquidos de punción
Recipiente estéril
Temperatura ambiente
Biopsias
Recipiente estéril (SF)
Temperatura ambiente
Medio de transporte*
Temperatura ambiente
Recipiente estéril
Heladera
Recipiente estéril
Heladera
Materia fecal
Orina
Secreciones vaginales,
oculares
Aspirado nasofaríngeo
Exudados de fauces
Esputo/aspirado
traqueal/BAL
Medio de transporte*
Recipiente estéril
Heladera
Hemocultivos
Frasco para hemocultivo
Temperatura ambiente
Materiales para cultivo de
germenes anaerobios
Medio conservación para
anaerobios
Temperatura ambiente
*Stuart; Cary Blair
Temperatura ambiente
QUE HAGO CON LA MUESTRA? II
¿COMO LA CONSERVO? Virología
MATERIAL
ALMACENAMIENTO
CONSERVACION
Líquidos de punción
(amniótico, LCR)
Recipiente estéril
Jeringa
Refrigerado
Biopsias
Recipiente estéril con MT∗
∗
Refrigerado
Hisopado en MT*
Refrigerado
Recipiente estéril
Refrigerado
Orina
Recipiente estéril
Refrigerado
Secreciones vaginales
Secreciones oculares
Exudados de fauces
Hisopo en Medio de
transporte*
Refrigerado
Aspirado nasofaríngeo/
traqueal/BAL
Recipiente estéril
Sangre y Medula ósea
Aspirado en tubos con EDTA
Refrigerado
Piel
Hisopo (contenido de
vesículas) o escarificación de
base de la lesión en MT *
Refrigerado
Materia fecal
*MT: Medio de transporte
Refrigerado
MEDIOS DE
TRANSPORTE
Envase de boca
ancha
Frascos para
hemocultivos adultos
y pediátricos
Biopsias, tejidos, orinas,
líquidos, esputos,
secreciones bronquiales.
Port-A-Cul vial
Port-A-Cul tubo
Raspados de heridas,
escaras, abscesos,
úlceras, pequeñas biopsias y
tejidos
Tubos esteriles
tapón verde
Isolator adulto-10
I. pediátrico-1,5
Líquidos y exudados
obtenidos por aspiración
Líquidos estériles
Tubos de trasportes de
Chlamydias
Hisopo con medio
de Stuart
Abscesos
y heridas
Viales y tubos
con atmósfera
anaerobia
MEDIOS DE
TRANSPORTE
Medio de trasporte
para virus
Escamas en
placas de Petri o
portaobjetos
Coproparasitológico
seriado contiene
fijador o en fresco
Test de Graham o
escobillado anal
Aspirado nasofaríngeo
Pelos tracción con
pinzas
CONDICIONES QUE PROVOCAN EL
RECHAZO DE UNA MUESTRA
Identificación de la muestra..
Inadecuada/o Tubos de recolección.
Transporte.
- Sustancias interferentes.
Volumen
adecuado
Falla en la recuperación del
patógeno
Orden para un estudio microbiológico
MUESTRA
•Muestra de un
sitio estéril
Agente
etiológico
•Muestra con flora
acompañante
–Ej: materia fecal, esputo, etc.
¿ Como se evita la
contaminación de la
muestra ?
Conservando y tomando en
condiciones adecuadas evitando
la proliferación de la biota
normal
DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
DIRECTO
Observación
Microscópica
En Fresco
Detección de
Antígenos y/o
AN
Con
coloraciones
Gram
Ziehl Neelsen
Giemsa
Kinyoun
Cultivo
Técnicas
especiales
Sólidos
Semi-sólidos
Líquidos
Selectivos
Diferenciales
De enriquecimiento
Fluorescencia
Inmunofluorescencia
Campo oscuro
Contraste de fase
Métodos Directos
OBSERVACION MACROSCOPICA DE LA MUESTRA
Ascaris
lumbricoides
Pthirus pubis
Proglótides
de Taenia
Eliminación
espontánea por el ano
(+
+ de 12
prolongaciones
uterinas)
Enterobius vermicularis
granos
Métodos Directos
Microscopía Óptica
Examen en fresco: glóbulos rojos, glóbulos blancos, células
epiteliales, piocitos, cilindros, cristales de Charcot-Leyden.
Paracoccidioides pseudohifas
brasiliensis
Giardia lamblia
levaduras,
Ascaris lumbricoides
Cryptococcus
neoformans
Filamentos y artroconidios
dermatofitos
Trichuris trichiura
Enterobius
vermicularis
Strongyloides
stercoralis
Larva rabditoides
Tinta china
KOH al 40%
Métodos Directos
Microscopía Óptica
Con coloración
Levaduras y
pseudohifas
Gram positivas
Gram
Positivos
Bacilos Gram positivos
Gram
Negativos
En racimo
En cadena
Staphylococcus Streptococcus spp
Streptococcus
pneumoniae
Métodos Directos
Microscopía Óptica
Con coloración Ziehl Neelsen
Cryptosporidium parvum
Requiere de 5000 a 10.000
bacterias por ml
Con coloración Kinyoun
Isospora belli
Kinyoun
Cyclospora cayetanensis
(ooquistes)
LIMITE DE DETECCION DE LA
BACILOSCOPIA
INOCULO (n° de bacilos/ml % PROBABILIDAD de
de esputo)
baciloscopía positiva
100
30
2000
58
30.000
96
100.000
100
Métodos Directos
Microscopia de fluorescencia
Autofluorescencia
en Isospora belli
Hifas
Fluorescencia con
auramina
de Mycobacterium
tuberculosis
Calcofluor
P. jirovecii
Gram: Sensibilidad
• 10 5 UFC/ml de muestra
Ojo!!! No todas las bacterias se tiñen
• La coloración fluorescente con naranja de
acridina aumenta la sensibilidad a 104
UFC/ml.
Virus sincicial respiratorio
Cryptosporidium
parvum
virus herpes
simplex
Treponema
pallidum
Métodos Directos
Campo Oscuro Microscopia
Treponema pallidum
Óptica
Fluorescencia
Diagnóstico de certeza
Impregnación argéntica
Treponema
Treponema pallidum
inmunofluorescencia directa
Leptospira interrogans
200x
Métodos Directos
Tripomastigotes
Trypanosoma cruzi
TINCION GIEMSA
Hemo
histoparasitosis
Amastigotes
Leishmania spp
Pneumocystis
jirovecii
Trofozoítos anulares
Plasmodium falciparum
Hongos
Histoplasma
caspsulatum
Métodos Directos
Eventos del virus que conducen a daño en la célula del
hospedero
Diagnostico de Tzanck
Giemsa
Virus Herpes
simplex
Coilocitos en una muestra de citología
exfoliativa del cuello uterino: método de
Papanicolaou.
IMPORTANCIA DE LA MORFOLOGIA
CLINICA
Reconocimiento fisiopatológico de la entidad clínica.
Presunción del foco etiológico.
Elección de la terapia inicial y modificación de la
empírica .
Diagnóstico rápido de ciertas infecciones.
MICROBIOLOGICA
Elección del esquema inicial de identificación.
Elección de las pruebas de sensibilidad antibiótica y
los antimicrobianos a ensayar.
Elección de los medios de cultivo.
Diagnóstico de infecciones por microorganismos
dificiles de cultivar.
Métodos Directos
Cultivo Acelulares o axénicos vs. celulares
¿Para que se cultiva?
•Aislar
–Identificar: serotipificar (Ag O, H, K)
–Conocer el patrón de sensibilidad antimicrobiana
–Realizar la caracterización intraespecífica
Conductas individuales
MICROORGANISMO PATÓGENO
Conductas colectivas
IDENTIFICACION DEL AISLAMIENTO
Aislamiento en placa de cultivo
Identificación
Pruebas bioquímicas
API
Talo levaduriforme:
aspectos morfológicos:
Utilización de azúcares,
compuestos orgánicos
Medios
cromogénicos
Temperatura de
incubación 28°C y
37°C
Talo micelial: aspectos
morfológicos:
macroscópicos y
microscópicos
Nuevo desarrollo: MALDI-TOF
- Detección del espectro
de proteínas de bacterias
y hongos.
- Acorta los tiempos de
identificación y
pruebas de resistencia.
- Principio:
espectrometría de masa
Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight Mass Spectrometry
¿Cómo se evidencia la presencia de un agente viral
en un cultivo celular?
Efecto o Acción Citopática (ECP o ACP)
Fundamentalmente en Investigación
Tiempo variable. Tardío para Dx.
No todos los virus producen ACP.
No todos los virus pueden replicar en
cultivo.
La misma ACP puede ser producida por
diferentes virus
Laborioso y costoso
Inmunoflurescencia con Ac.
monoclonales (IF)
Cultivo en shell vial
Métodos Directos
Detección de componentes del microorganismos o genoma
Detección de Antígenos y/o Ácidos nucleicos
IFD
IFI
Aglutinación
ELISA
Técnicas
Moleculares
PCR
(cuali –
cuantitativas)
Métodos Directos
Detección de componentes del microorganismos
Detección de Streptococcus β hemolítico. Específico y rápido 15 a
20 min.
Aglutinación de látex para Ag capsulares de
St. pneumoniae
H. influenzae
en orina
N. meningitidis
suero o LCR
Métodos Directos
Detección de componentes del microorganismos
Componentes de la capsula
negativo
positivo
En LCR,
suero,
orina
GXM (glucuronosilomanano) y
GalXM (galactoxilomanano )
Aglutinación de partículas látex
Componentes de la pared
PANFUNGICO
β (1–3) glucano (suero) ELISA.
TEST CROMOGENICO
Galactomanano (suero y LBA)
Infección fúngica invasora
Infección fúngica
invasora por Aspergillus
Métodos Directos
Detección de componentes del microorganismos
Detección de
Antígenos de rotavirus
Rotavirus , adenovirus
calicivirus , astrovirus
HIV, VSR, HBV
ELISA
Métodos Directos
Detección de antígenos intracelulares por
inmunohistoquímica
CMV
Detección en PMN de
sangre
HSV– 1
Métodos Directos
Detección del genoma o secuencias nucleótidicas específicas
PCR
(pesquisa de ácidos nucleicos)
Métodos Directos
PCR para detección de los genes env y gag de HIV en
linfomononucleares en diagnóstico pediátrico
Beta actina
gag env
Métodos Directos
ENCEFALITIS
HERPÉTICA
Métodos Indirectos
Utilidad de las pruebas inmunológicas
Para que emplearlas ?
Identificar pacientes con infección por distintos microorganismos.
Ej. HIV, T. cruzi, Histoplasma capsulatum, HBV, HCV, Coccidioides
posadasii, Brucella spp, Treponema pallidum, T. gondii.
Status inmunológico frente a un agente infeccioso: HBV, virus
Rubéola, virus Varicela, T. gondii.
Realizar encuestas epidemiológicas. HAV, T. cruzi, HBV, HCV,
Que información proveen ?
Etapa de la infección.
Evolución de la infección .
Estado del sistema inmune en relación con la infección.
Respuesta al tratamiento.
DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
INDIRECTO
Búsqueda de
Anticuerpos
Inmunodifusión
ELISA
Reacciones Intradérmicas
(HipersensibilidadTipo IV)
Aglutinación
IFI
Látex
GR
(HAI-Inh de la HA)
Diagnóstico de
infección
Western blot
Métodos Indirectos
Aumento de 4 veces
el título de Ac en
dos muestras. Una
de fase aguda y otra
en convalecencia
Título: inversa de la
mayor dilución del
suero con reacción
positiva
Establece un diagnostico retrospectivo
Métodos Indirectos
Etapa de la infección I.
Infección aguda IgM HAV
Métodos Indirectos
Evolución de la enfermedad y diagnostico.
MICOSIS ENFERMEDAD en Histoplasmosis,
Paracoccidiodomicosis, Coccidioidomicosis.
Aspergilosis cavitaria.
Inmunodifusión
positiva
diluciones del suero
Evolución del título de anticuerpos
1200
1000
800
600
m al pronóstico
400
200
buen pronóstico
0
m al pronóstico
1
sem anas
Meses
2
3
4
5
Paciente sintomático
Signos y síntomas
Imágenes
Epidemiología
Selección de la muestra clínica
esputo
Orina
Dx. clínico
presuntivo
sangre
Materia fecal
Hisopados
Biopsias
TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN ADECUADOS
Detección de
componentes del
microorganismo
Ácidos nucleicos
Microscopía
Cuantificación o
semicuantificación
Pruebas bioquímicas criterios
morfológicos
Serología
Diagnóstico de certeza
Sensibilidad antimicrobiana
Tratamiento
Mutaciones
Susceptibilidad
a una droga
TIEMPO EN EL DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
Su velocidad es fundamental en la
medicina, ya que un diagnóstico rápido
posibilitará:
la prescripción de un tratamiento
antimicrobianos específico y un uso
racional de los mismos.
establecer medidas preventivas
TIEMPO EN EL DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
Observación microscópica. Resultado: en horas.
Dx presuntivo microbiológico
Rapidez y especificidad.
Detección de componentes Dx de certeza.
del microorganismo.
TIEMPO EN EL DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
Cultivo: el resultado después de 24 hs, a excepción de los métodos
automatizados.
Levaduras: 24 a 48hs
Hongos no tabicados (Mucor spp., Rhizopus spp.): 48 hs.
Hongos dimórficos (Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis): 3 a 4
semanas.
Bacterias: 24 a 48 hs.
Dx de certeza.
Mycobacterium tuberculosis 3 a 4 semanas.
Identificación de especie. Tiempo variable con el microorganismo
MUCHAS
GRACIAS!!!!!!!!!!