Detección de Antígenos Microbianos

Pruebas Rápidas para la
Detección de Antígenos
Microbianos
Lic. TM Luis Alvarado Rios
Antígenos
• Un antígeno es una molécula de
superficie celular, que puede
inducir la formación de
anticuerpos.
• Epítopo, es la zona del antígeno
donde se une el anticuerpo.
• Cada epítopo está definido por
su anticuerpo, los cuales
interactúan por
complementariedad espacial.
• Las proteínas son las
principales moléculas
antigénicas
Anticuerpos
• Los anticuerpos son moléculas
proteicas secretadas por un
tipo celular del sistema
inmune, los anticuerpos tienen
una altísima afinidad por sus
antígenos correspondientes.
• Anticuerpos:
– Defensa natural
– Utilidad terapéutica
– Utilidad Diagnóstica
• Marcador de Infección o
exposición.
• Detección de antígenos
Diagnóstico
Microbiológico
• Conjunto de procedimientos empleados para
establecer la etiología del agente responsable de
una enfermedad infecciosa.
• Diagnóstico Microbiológico Directo. Implica la
demostración del agente, sus metabolitos o
componentes antigénicos en los fluidos orgánicos.
• Diagnóstico Microbiológico Indirecto. Implica la
demostración de la huella que el agente ha dejado
en su contacto con el sistema inmune.
Métodos en el Diagnóstico
Microbiológico
• Directo:
– Tinciones
– Cultivos
– Métodos Inmunológicos
– Métodos Moleculares
• Indirecto
– Detección de
Anticuerpos
Métodos Inmunológicos en el
Dx. Microbiológico
•
•
•
•
•
Aglutinación
Precipitación
ELISA
Inmunofluorescencia
Inmunocromatografía-Lateral
Flow.
Pruebas Rápidas en el
Diagnóstico Microbiológico
• El diagnóstico microbiológico requiere ser oportuno
y confiable.
• La microbiología convencional suele requerir un
tiempo prolongado para obtener el diagnóstico.
• Las pruebas inmunológicas permiten acortar el
tiempo requerido para el diagnóstico.
• No recuperan el agente etiológico, solamente
detectan su presencia.
• No requieren equipos sofisticados en su
procedimiento.
• Su principal desventaja la lectura subjetiva, la
disponibilidad en el mercado y el costo.
Pruebas Rápidas en el
Diagnóstico Microbiológico
• Una prueba rápida ideal es aquella que brinda
resultados en corto tiempo, no requiere mayor
entrenamiento para su realización e interpretación,
no requiere instrumentación, de fácil conservación,
de bajo costo y disponibilidad en el mercado.
• Debe tener un rendimiento adecuado en cuanto a
sensibilidad y especificidad.
• Sensibilidad
Es la probabilidad de clasificar correctamente a un
individuo enfermo.
Es la probabilidad de que para un sujeto enfermo se
obtenga en la prueba un resultado positivo.
La sensibilidad es, la capacidad del test para
detectar la enfermedad.
• Especificidad
Es la probabilidad de clasificar correctamente a un
individuo sano.
Es la probabilidad de que para un sujeto sano se
obtenga un resultado negativo.
Se puede definir la especificidad como la capacidad
del test para detectar a los sujetos sanos.
Métodos Inmunológicos en el
Dx. Microbiológico
Aglutinación
Reacción Ag-Ac donde el antígeno esta formando
parte de células, bacterias o se encuentra unido a
partículas inertes.
La reacción Ag-Ac se puede detectar y cuantificar
por el aglutinado celular o bacteriano formado.
– Serotipificación bacteriana.
– Látex. Partículas de poliestireno de 0.25 – 0.8 µm
de diámetro.
– Coaglutinación. Staphylococcus aureus COWAN
I, proteina A.
– Hemaglutinación.
Aglutinación de Látex
• Rotavirus.
• Meningitis. Antígenos bacterianos.
• Antígeno capsular de Cryptococcus.
Rotavirus
• Pertenece a la familia de los reovirus, se clasifican
en serogrupos de la A a la G.
• Rotavirus grupo A es una de las principales causas
de diarrea infantil severa en niños de 6 a 24 meses.
• Pruebas diagnósticas:
– Látex
– Elisa
– Inmunocromatografía
Rotavirus Látex
Rotavirus Látex
• Test Rápido para la detección de rotavirus grupo A
en heces
• Ac. Polivalentes de conejo contra Rotavirus Grupo
A, ligados a partículas de látex
• Sensibilidad frente a PCR 97.2%
• Especificidad frente a PCR 97.1%
Periodo: Enero Marzo - Niños menores 2 años
2006
2007
2008
12%
4%
2%
Meningitis. Antígenos
Bacterianos
• Test Látex para detección de polisacáridos
capsulares solubles en LCR, suero y orina.
• Anticuerpos policlonales de conejo y monoclonales
de ratón.
• Tratamiento previo de la muestra con calor. BM
100ºC.
• Especificidad entre 97% y 100%
Meningitis. Antígenos
Bacterianos
• Detección de los siguientes agente etiológicos
– Haemophilus influeza b
– Streptococcus pneumoniae
– Streptococcus grupo B
– Neisseria meningitidis (A, B, C, Y, W135)
– Escherichia coli K1
Meningitis. Antígenos
Bacterianos
Cryptococcus neoformans
•
•
•
•
•
Hongo levaduriforme capsulado
Hábitat ambiental, excretas de aves
Ingreso por vías respiratorias
Diseminación en inmunosuprimidos
Infección frecuente en pacientes HIV
Antígeno de Cryptococcus
• Detección del antígeno polisacárido capsular
glucuronoxilomanano (GXM).
• Sensibilidad y especificidad 100%
• Tratamiento previo de las muestras. BM 100ºC.
• Muestras de suero tratamiento con la enzima
pronasa.
• Efecto de prozona
• Enero – Marzo 2008
55 pruebas
6 positivos (aprox 10%)
Cryptococcus neoformans
Precipitación
• Participan Ag y Ac solubles que van a formar
inmunocomplejos que precipitan cuando están en
proporción equivalente.
• La precipitación es máxima donde la proporción
entre ambos es óptima (parte central de la curva),
pero va disminuyendo a medida que predomine el
Ac o el Ag (izquierda y derecha de la curva
respectivamente)
Inmunodifusión doble
• Utilizada para detectar Anticuerpos
generados en micosis invasivas
• Aspergillus
• Coccidioides
• Histoplasma
• Candida
ELISA
•
ELISA:
competitivo – no competitivo
–
Indirecto
detección de anticuerpos
–
Sándwich o de Captura
detección de antígenos
Campylobacter
• Es uno de los principales agentes causales de
diarrea en niños.
• El Dx. de laboratorio se puede realizar con un frotis
coloreado.
• Útil en pacientes que han iniciado el tratamiento
antibiótico, pacientes con baja carga bacteriana.
• Elisa de captura.
– Anticuerpo policlonal de conejo contra antígeno específico
de Campylobacter jejuni
• Sensibilidad 100%
• Especificidad 99%
Campylobacter ELISA
Clostridium difficile toxinas
AyB
• Elisa de captura de antígenos de toxina de A y B de
C. difficile a partir de muestras de heces.
Imunocromatografía-Lateral Flow
•
•
•
•
•
Pruebas de gran desarrollo en los últimos años.
Posibles de implementar en estaciones de campo.
No requieren mayor entrenamiento ni equipamiento.
Resultados rápidos ( 10 – 60 minutos)
Útiles para detectar antígenos y anticuerpos
TÉCNICA DE
INMUNOCROMATOGRAFÍA
C
T
S
ESQUEMA DE INMUNOCROMATOGRAFÍA
PARA DETECCIÓN DE ANTÍGENOS
Anticuerpos de detecció
detección
marcados con
Oro Coloidal
Antí
Antígeno en muestra
TIRA NITROCELULOSA
Anticuerpo de Captura
contra anticuerpo
de detecció
detección
Anticuerpo de Captura
contra antí
antígeno
especí
específico
www.biogenix.com.co/internas/libreria/documentos/ICT.ppt
Estreptococo ß-hemolítico
grupo A
• Los estreptococos del grupo A son la principal
causa de Faringitis bacteriana.
• Un diagnóstico oportuno pueden evitar las
enfermedades post estreptocócicas: fiebre
reumática, glomerulonefritis.
• Las pruebas diagnósticas:
– Cultivo
– Inmunocromatografía
Estreptococo ß-hemolítico
grupo A
• Inmunoensayo, detección de polisacáridos de grupo
A con anticuerpo policlonales de conejo.
• Extracción del antígeno: tratamiento del hisopado
con nitrito de sodio y ácido acético.
• Detección 1x105 UFC/test
Estreptococo ß-hemolítico
grupo A
• Enero - marzo 2008
– 74 pruebas
– 7 positivos (10%)
Virus Respiratorios
• Las infecciones virales son las responsables de la
mayoría de infecciones respiratorias altas.
• Virus de la Influenza, Adenovirus, Virus Respiratorio
Sincicial. Importantes por su patogenicidad y
capacidad de causar brotes y epidemias.
• Pruebas diagnósticas.
– Cultivo.
– Inmunofluorescencia
– Inmunocromatografía
Influenza A
• Test inmunocromatográfico, con anticuerpos
monoclonales de pollo frente a la nucleoproteina del
virus Influenza A.
• Buffer de extracción con EDTA y nitrito de sodio.
• Importante. Colección de muestra nasofaríngea
• Detectabilidad 7.2 x 106 pv/mL
• Sensibilidad especificidad
76.6 % 100% frente RT-PCR
96.9 % 100% frente IFI
Influenza A
• Enero - marzo 2008
• 93 pruebas
• 15 positivos (16%)
Toxina A de Clostrium difficile
• C. difficile es una causa importante de diarrea
asociada a antibióticos.
• Puede causar una colitis pseudomembranosa.
• Toxinas de C. difficile
– Toxina A: Enterotoxina.
– Toxina B: Citotoxina in vitro.
• Pruebas Diagnósticas
– Aglutinacion Látex. Detecta antígenos de C. difficile no de
la toxina
– Citotoxicidad en cultivo celular
– Inmunocromatografía
– Elisa
Toxina A de Clostrium difficile
Toxina A de Clostrium difficile
• Límite de detección:
• Sensibilidad 90%
• Especificidad 99%
1.38 ng/mL
Gracias por su atención