disrupción celular

DISRUPCIÓN CELULAR
Operaciones y Procesos Biotecnológicos II
DISRUPCIÓN CELULAR
Objetivos de Operaciones y Procesos Biotecnológicos II:
1) Estudiar los procesos habitualmente empleados en la
industria para separar y/o purificar productos de
interés.
2) Evaluar las variables que permiten optimizar los
procesos habitualmente involucrados en la separación
de residuos insolubles, el aislamiento y la purificación
de un determinado producto.
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DISRUPCIÓN CELULAR
Disrupción celular
Lípidos
?
Proteínas recombinantes
ADN, ARN
Microorganismo
Productor
Productos de interés liberados
naturalmente al medio
Antibióticos
Enzimas
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Proceso General
Que clase de célula
se quiere destruir?
Conclusiones
Cuál es el producto
que queremos
extraer?
Evaluación
acerca de los
rendimientos
obtenidos
Selección del
método de
disrupción celular
a emplear
Puesta a punto
del método
seleccionado
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¿Qué es lo que debemos
conocer de la célula a la
hora de diagramar una
disrupción?
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Membrana Plasmática
Estructura de la Membrana Plasmática
- Actualmente el modelo que describe la membrana plasmática es el del
“mosaico fluido”.
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Membrana Plasmática
Las principales funciones de la membrana plasmática son:
 Aislar selectivamente el contenido de la célula del ambiente externo.
 Regular el intercambio de sustancias entre el interior y exterior celular
(lo que entra y sale de la célula).
 Comunicación intercelular.
 Protección.
 Ayudar a la división de compartimientos sub-celular.
 Servir de receptores que reconocen señales de determinadas moléculas
y transducir la señal al citoplasma.
 Servir de sitio estable para la catálisis enzimática.
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Pared Celular
o La pared celular es una estructura rígida y compleja que
protege a la célula del ambiente, manteniendo su forma y
presión osmótica.
o El tipo de célula con el que se vaya a trabajar es importante:
- bacterias (Gram positivas y Gram negativas)
- hongos y levaduras
- células vegetales (plantas y algas)
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Pared Gram Positiva
- La red de mureína (peptidoglicano) esta
muy desarrollada (puede presentar hasta
50 capas).
- Es frecuente la presencia de los
aminoácidos L-diaminopimélico o de
lisina.
- En ella se encuentran ácidos teicoicos y
lipoteicoicos.
- No presentan lipo-polisacáridos.
- Presentan una sola bicapa lipídica.
- Presentan bajo contenido proteico.
- Alto contenido de lípidos.
Staphylococcus
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Pared Gram Negativa
- La red de mureína presenta una sola
capa.
- Contiene únicamente mesodiaminopimélico y nunca contiene lisina.
- Hasta ahora no han podido
encontrarse ácidos teicoicos o lipoteicoicos.
- Se encuentran grandes cantidades de
lipoproteínas y lipo-polisacáridos que
representan hasta el 80 % del peso seco
de la pared celular.
- Tienen dos bicapas lipídicas.
- Presentan porinas en la membranas
externa.
E. Coli
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Pared celular de Hongos y Levaduras
- Es una estructura muy gruesa (100-200 nm)
- Representa del 15-25% del peso celular en base seca.
- La pared celular esta compuesta por dos capas de polisacáridos, una
capa interna transparente y amorfa, constituida principalmente de β1,3 y β-1,6-glucanos. En la capa externa se encuentran ubicadas las
mano-proteínas, ancladas a la capa interna de β-glucanos o bien
atravesándola.
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Pared celular Células Vegetales
- Laminilla media: Es el lugar
que une las paredes primarias
de dos células contiguas.
- Pared primaria: mide entre
100 y 200 nm de espesor,
compuesta entre un 9 y un
25% de celulosa
- Pared secundaria: (cuando existe) se
relaciona con la especialización de cada tipo
celular. A diferencia de la pared primaria,
contiene una alta proporción de celulosa,
lignina y/o suberina. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II
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Célula animal (carece de pared celular)
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Dificultad Para la Disrupción Celular
Células Animales
Micelios
Bacilos Gram (-)
Bacilos Gram (+)
Células Vegetales
Levaduras
Cocos Gram (-)
Esporas
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Métodos de Disrupción Celular
Métodos no mecánicos:
Rompen las cubiertas celulares induciendo la lisis celular, a través
de medios químicos, físicos o enzimáticos.
- Por lo general son menos
severos que los mecánicos.
- Por sí mismos, estos métodos
no suelen ser muy eficientes.
- No generan grandes daños
a las célula, facilitando la
posterior purificación del
producto de interés.
- Pocos métodos no mecánicos
pueden llegar a ser escalados
exitosamente.
- Son mas específicos.
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Métodos no-mecánicos
Dentro de estos tipos de métodos podemos clasificar tres
sub-clases principales:
1) Métodos químicos
2) Métodos físicos
3) Métodos enzimáticos
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Métodos no-mecánicos
1) Métodos Químicos
Tratamiento con solventes orgánicos (cloroformo, tolueno)
Los solventes orgánicos permeabilizan las membranas celulares disolviendo
componentes hidrofóbicos de la pared, como los fosfolípidos de la membrana
interna en bacterias Gram (-).
Tratamiento con álcalis (hidróxido de sodio)
Se produce la saponificación de los lípidos de las membranas. Es una técnica muy
severa pero efectiva y de bajo costo, siempre y cuando el producto de interés sea
resistente a la degradación a pH elevados.
Tratamiento con ácidos (ácido clohídrico)
Tratamientos con HCl 6N han logrado hidrolizar diferentes tipos de células. Sin
embargo el proceso es lento (más de 6 horas) y durante el mismo se pueden
producir la hidrólisis de amino ácidos y proteínas de interés.
Agentes Caotrópicos (urea, clohidrato de guanidina)
Interfieren con los enlaces no covalentes (puentes de hidrógeno, fuerzas de van
der Walls) desorganizando la estructura del agua haciéndola menos hidrofílica,
debilitando las interacciones soluto-soluto.
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Métodos no-mecánicos
1) Métodos Químicos
Agentes Quelantes (EDTA):
Este agente quela los iones Ca2+ y Mg2+ que unen los LPS adyacentes
haciendo que se liberen parte de los LPS conteniendo proteínas y
fosfolípidos de la membrana (Gram -).
Antibióticos:
Son efectivos contra bacterias Gram (-) (β-lactámicos). Distintos
antibióticos causan la lisis por distintos mecanismos. No se utilizan a
gran escala.
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Métodos no-mecánicos
1) Métodos Químicos
Tratamiento con detergentes
La efectividad del método radica en la
química del detergente, ya que son
anfipáticos.
Forman micelas con los lípidos de las
membranas, desestabilizándolas.
Se clasifican en tres tipos: catiónicos
(sales de tetra-alquil-amonio, pH
básico), aniónicos (SDS, pH ácido) y
no-iónicos (Triton-X,).
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Métodos no-mecánicos
2) Métodos Físicos
Shock osmótico
- Es el método físico mas simple.
- El estrés osmótico es generado cuando las células son situadas en
medios hiper/hipotónicos.
- Las células con paredes celulares son mas difíciles de romper.
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Métodos no-mecánicos
2) Métodos Físicos
Congelamiento/descongelamiento:
Los cristales de hielo que se forman y crecen durante el congelamiento,
rompen mecánicamente la integridad del interior de la membrana
celular, haciéndola mas permeable.
Enfriamiento lento
Enfriamiento rápido
Se ha visto que la congelación lenta no funciona tan bien como la rápida.
La congelación rápida lesiona más específicamente las membranas
celulares produciendo lisis celular.
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Métodos no-mecánicos
2) Métodos Físicos
Descompresión:
- Es un proceso por el cual las células se mezclan con un gas
presurizado por un tiempo específico. El gas entra en las células y
luego al liberar la presión aplicada el mismo se expande causando
la disrupción.
Termólisis:
- Es un proceso bastante común a gran escala. Las células son
llevadas a mayores temperaturas con el fin de romper o debilitar la
membrana externa.
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Métodos no-mecánicos
3) Métodos Enzimáticos
Disrupción Enzimática:
- La lisis enzimática es un método muy
preciso, pero que requiere de una
comprensión precisa de la estructura de
las paredes celulares que se desean
destruir.
Lisozima
(muramidasa)
- La principal limitación de este método es su elevado costo. La
inmovilización puede ser una herramienta útil para la reducción de
costos
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Métodos no-mecánicos
3) Métodos Enzimáticos
Auto-lisis:
- Es un proceso por el cual las células inducen su propia destrucción.
Se produce la activación de señales que activan la liberación de
enzimas que degradan las organelas y membranas de las mismas
células.
- Por sí mismo es un mecanismo lento. Lo que se hace es
transformar cepas a fin de hacer estos sistemas auto-líticos mucho
mas activos, introduciendo genes que codifican antibióticos y
enzimas que degraden mas rápidamente las distintas organelas y
membranas celulares.
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Métodos de Disrupción Celular
Métodos mecánicos:
Se basan en fuerzas de corte (shear stress) que deforman las células
hasta el rompimiento de sus cubiertas.
-Suelen ser mas efectivos
que los métodos químicos.
- Son inespecíficos.
- Generalmente son mas
fáciles de escalar que los
métodos no-mecánicos .
- Requieren mucha energía.
- Generan elevadas temperaturas.
- Pueden llegar a dañar productos
lábiles.
- La separación del producto
deseado de otros materiales (ac.
nucleicos, proteínas, trozos de la
pared celular, etc.) puede llegar a
ser dificultosa.
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Métodos mecánicos
Sonicadores (ultrasonido)
- El ultrasonido utiliza frecuencias entre 20 y 50
kHz.
- Las ondas de ultrasonido crean muchas
micro-burbujas en muchos sitios de nucleación
dentro de la suspensión celular. Estas microburbujas luego colapsan implosionando
durante
el
período
de
rarefacción
(compresión) de la onda.
- Este fenómeno, denominado cavitación,
produce un shock de ondas muy intenso,
generando un fuerte estrés local, deformando
al límite las células y produciendo así su
consecuente ruptura.
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Métodos mecánicos
Homogenizadores de alta presión
Es uno de los mas utilizados para disrupción celular a gran escala.
Se aplica una elevada presión a una suspensión
de células forzándolas a través de una válvula,
sometiendo a las células a un alto estrés de
corte, rompiendo las membranas.
El mecanismo de disrupción se daría
por fuerzas de corte en la región de
la válvula, cavitación (debido a las
regiones de baja presión generadas)
y al impacto contra el anillo.
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Métodos mecánicos
Homogenizadores de alta presión
dR
 k   Rmax  R 
dN
 Rmax 
a
ln 

k
N
P

R

R
 max

k '  k Pa
N: número de ciclos
P: presión de trabajo
a: constante relacionada a la dureza de la célula
k: constante relacionada a factores del sistema
R: es la cantidad de proteína liberada al medio
Rm: es la máxima cantidad de proteína posible de
ser liberada
Métodos mecánicos
Homogenizadores Microfluidizadores (microfluidizer homogenizer)
En los microfluidizadores, el líquido se divide en dos o más corrientes que se
bombean a elevadas presiones (en algunos equipos más de 270 MPa) y grandes
velocidades, unas contra otras en un ángulo de 180° cayendo repentinamente
la presión tras chocar ambas corrientes.
El mecanismo de disrupción realizado por este
equipo genera partículas de mayor tamaño que
el homogenizador de alta presión.
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Métodos mecánicos
Bead mills (molinos de perlas)
- Son de los mas utilizados a
gran escala.
- Básicamente consiste en un agitador a discos montado sobre un
motor central que gira en una cámara central, la cual es cargada con
esferas de vidrio, metal u otro material.
- Aspectos a considerar al trabajar con estos equipos: tamaño de las
esferas (0,2-1,5mm), cantidad y material de las esferas; velocidad de
agitación; temperatura de trabajo; velocidad de flujo y concentración de
la suspensión a tratar.
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Métodos mecánicos
Bead mills (molinos de perlas)
dR
 k  Rm  R 
dt
 Rm 
ln 
kt
 Rm  R 
k: constante del modelo
R: es la cantidad de proteína liberada al medio
Rm: es la máxima cantidad de proteína posible de ser liberada
uL A
k
V
 Rm  uL A
ln 
t

 Rm  R  V
A: Área transversal de la cámara
V: Volumen de la cámara
uL: Velocidad de la suspensión
k  k' u p
 Rm 
ln 
  k' u p t
 Rm  R 
up: Velocidad de giro de la paleta
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Métodos mecánicos
Bead mills (molinos de perlas)
dR
 k  Rm  R 
dt
 Rm 
ln 
kt
 Rm  R 
Modelos no-lineales
k  a1S  a2 S  a3
2
  S a5 
k  k' 1    
  b  
b
a4
 S  1  X  
1
3
 a5
 Rm 
2
ln 

a
S
 a2 S  a3  t


1
 Rm  R 
  S a6 
 Rm 
ln 
  k' 1     t
  b  
 Rm  R 
an: constantes del modelo
S: concentración celular
an: constantes del modelo
S: concentración celular
X: grado de disrupción
b: distancia entre células
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Métodos mecánicos
Bead mills (molinos de perlas)
Modelo de dos etapas
dC
 k1  C0  C 
dt
dA
 k2  AD  A 
dt
C  C0 1  exp  k1 t 
A  AD  1  exp  k2 t 
C
AD  Am  
 C0 
dA
 k2  Am  1  exp  k1 t   A
dt
k1: constantes del modelo
referida a la ruptura celular
k2: constantes del modelo
referida a la liberación de la
proteína
C: concentración de células
destruidas
C0: concentración de
células iniciales
  k2 exp  k1 t  k1 exp  k2 t  

A  Am 
k2  k1


A: concentración de proteína liberada
AD: máxima concentración de proteína liberada a partir de las células destruidas
Am: máxima concentración de proteína disponibles para ser liberadas
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Métodos Combinados
Puede verse que los distintos métodos de disrupción poseen diversos
principios de acción, lo que hace factible su combinación de forma
sinérgica para aumentar el rendimiento del proceso en un solo
método combinado.
Métodos no-mecánicos combinados
Disrupción mecánica con pre-tratamientos no mecánicos
Evaluación de la eficiencia de los métodos de disrupción
Métodos directos: Consisten en contar el número total de células
destruidas e intactas.
- Recuentos en cámara.
- Contadores electrónicos.
- Recuentos en placa.
- Utilización de centrífugas analíticas.
Métodos indirectos: Consisten en determinar el grado de
liberación al medio externo de algún metabolito celular luego de
que las membranas celulares son destruidas (determinación de
proteínas solubles, actividades enzimáticas, etc.).
Cálculo del Rendimiento Alcanzado
Se determina el rendimiento alcanzado en función de la eficiencia de los
métodos realizados, teniendo en cuenta no solo la disrupción celular o
el porcentaje de producto recuperado, sino también las condiciones
operativas que se necesitaron para llevarlo a cabo.
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Conclusiones
- Existen distintas clases de microorganismos productores con una
gran diversidad de metabolitos de interés.
- Existen una gran diversidad de métodos de disrupción.
- Cada método posee diferentes principios de acción, por lo que
presentan una serie de ventajas y desventajas frente a los demás.
- Necesidad de desarrollar y poner a punto técnicas que permitan
la determinación de la eficiencia de los métodos utilizados.
- No existen protocolos universales de disrupción celular.
¿CUÁL ES EL MEJOR MÉTODO?
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