tR-96 4/13 Balanza analítica con precisi(m de ±O,I mg. Columnas

PNT-A-xxxx
IQS-CROMA
tR-96
4/13 ll'iSTRUMENTOS y EQUIPOS.
Balanza analítica con precisi(m de ±O,I mg. Columnas cromatográlicas IIPI.C de fase inversa. Cromatógrafo de HPLC con detector lJV. Sislema de integración cromatogrMica y tratamiento de datos Gynkosoft. Jeringa de inyección de vidrio para HPLC de lOO
~L. Medidor de pH. Sistema de filtración al vado. REACTIVOS Y PATRONES.
Acctonitrilo
(Cl-l.~CN)
calidad HPLe.
Agua (1120) calidad MilliQ. fosnlto Monopotásico (KH»O,): Purísimo. PANREAC. Trictilarnina {(C2IlJ;CNIJll: Pura de F.E.R.O.S.A. Ácido Fosfórico (H·IP0 1). 85%, en peso: Purísimo. PANREAC.
AccIona: Purísima. PANREAC. Ftalato de Dimetilo: Purísimo. PANREAC. (3-Naftol: Purísimo. PANREAC. a-Nafldamina: Pura de F.E.R.O.S.A. PROCEDIMIENTO. l . Preparación de patrones.
l. l . Preparaciún del palrón madre (p 1):
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5/1 ] Se pesan (con 'precisiún de ±O, I mg) las siguientes cantidades de los reactivos cuyas
calida(ks se describieron anteriormente; las sustancias líquidas se toman en volumen, con
pipeta volumétrica de doble aforo :
'1 0,00 mI.
Acetona :
Flalato de Dimctilo: 0,50 mI.
r~-Nanol :
~O()
a-Natlilamina:
mg.
ISO mg.
Se enrasan estas cantidades, en matraz volumétrico, a 100 mI con Acetonitrilo: Pt.
1.2. Preparación del patrón madre (P'I ):
Este patrón se prepara en aquellas ocasIOnes en las cuales la columna no separa los
compuestos del patrón madre PI , a las condiciones de aplicación del test.
Se toman los líquidos con pipeta volumétrica de doble aforo y se pesan los sólidos con
precisión de
± O, I mg:
IO,no mI. Acctona:
a-Naftilamina: ISO mg . Se
~nrasa
In anterior
él
1no mI, en malraz volumétrico, con Acetonitrilo: P'I. 1.1. Preparación de las mezclas ele prueba (PA) y (P n):
¡\
partir de PI se preparan p\ y "JI: IO,O() mi dc PI (tomados con pipeta
dohk aforo) se diluyen a lOO mI con una mezcla de
CH\CN : H ~ O
d~
de
(-Hl :W v/v)-fase móvil
1-(1\)
IO ,()O mI dc PI (lomados Clln pipeta volumétrica
con
mezcla de CII ,CN :Tampón FllSlilto (40 :úO v/v)-I"ase móvil 2-(P¡J
1I11<l
volum~trica
doble aforo) sc diluyen a 1 00 mi
PNT-Á-xxxx
IQS-CROMA
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1.4. Preparación de las mezclas ele prueba ( P 'A) Y (P' B)'
A partir de P' 1 se preparan P',\ y P'o: 10,00 mi de P' I (tomados con pipeta volumétrica de
doble aforo) se diluyen a lOO mi con una macla de CII J CN:H 20 (40:60 v/v)-fase móvil 1­
(P',\).
IO,()O mI de P'I (tomados con pipeta volumétrica de dohle aforo) se di luyen a 100 \111 con
una mezcla de CII ,CN :Tampón fos fato (40:60 v/v)-fase móvil 2- (P' B)'
las mezclas de enrase se preparan comhinando 40 volumenes de Acetonitri 'lo con 60
volumenes de Agua o tampón Fosfato, según sea el caso .
1.5. preparación de las
t~lses
móviles:
La fase móvil I es Acdonitrilo-Agua con una composición de 40:60 v/v . La fase móvil 2 es Acetonitrilo-Tampón Fostato de composición 40:60 v/v.
El Tampón Fosfato tiene una concentración de 0,025 M en Fosfato (como KH 2 PO.¡) y de 0,030 M en Trietil,amina, y se prepara pesando las siguientes cantidades: Fosfato Diácido de Potasio (KI1 2J>O.J 1110 mg.
1450 mg.
Lo an·t erior se diluye a 1,0 litro con agua MilliQ y se lleva hasta pll = 3 (lO con ácido
Fosfórico (11;1'0-1) lid X5°!.1 ('n peso. Esta solución puede guardarse en la nevera, pero se
dehe siempre filtrar, antes de lIsarla , con filtro de O,LIS
~lm .
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2. Condiciones crom"to~ráficas.
Equipo de cromatografía II PI.C con dos canales para solventes. Volumen de inyecciún: 20 pI.. Columna: A examinar (fase inversa). temperatura de columna: 15"('. Detecciún UV; J. =- 254 nm. Composición de la fase móvil 1: CH 1C\N-H 2 0 (40 :60 v/v). Composición dc la fase móvit 2: ('11 leN-Tampón I'osfato (40:60 v/v) . Flujo de la fase móvil: 1,00 mllmin. Presión: Variable según la columna ensayada. l . Conelicinnes de
inte~raciÓn~
Las condiciones de integración cromatográfica del sistema de tratamiento de datos
(Gynkosoti), se indican en los anexos n"l y n"2 { especialmente en lo que se refiere al
DET-File (archivo <le integraciún y al PRM-Fi1e (archivo de int~)rmc)
l.
4. Aplicación de la mezcla ele prueba (P..).
Para aplicar la mezcla de prueba , es necesario llevar a cabo las siguientes operaciones : -Colocar en los recipientes de solventes de las dos líneas a usar, agua MilliQ (que se cambia cada día) y !\cctonitrilo gradn IIPI .(' ; desgasillcar los solventes de la fase móvil en caso <k que el cromatógrafo no cuente con desgasificador incorporado. La desgasitlcación se puede ell:ctuar con I [clio o en un bañn de ultrasomdus. IQS-(:ROl\lA
) R-%
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~/13
• Poner en marcha el instnunellto: Bombas, detector y otros elementos cou que cuellte el lTomatógrafo. • Fijar la longitud de onda de detetción. • Abrir la purga y purgar dos líllcas, así: lJlla de ellas
COll
agua MilliQ
(l()()'~/;,
de Aglla a través de la línea) hasta que la presión se estabilice y se evidencie que sale agua por la salida de la purga; otra línea con Acetonitrilo (100%, de Acetonitrilo en la líllea) hasta qlle se estabilice la presión y se Ilote que sale Acetonitrilo por la salida de la purga. -'eITar la purga. • Verificar que d hllcle de inyctciúll es el adecuado; limpiar el inyector, primero con 5,00 mi de agua Mil1iQ y luego COll 5,00 mi de Acetonitrilo, usando para ello una jeringa de plástico de 10,00 Inl. • Instalar la coh~mna que se va a probar y fijar la temperatura de trabajo. Establecer las tondiciones al1<:cuadas de composición de fase móvil
(t~lse
móvil 1) y aumentar el flujo <le la misma desde O hasta 1,00 mVmin, alimentando 0,10 mVmin cada vez y dejando que la presión se estahilice despnés de caela illcremcnlo. Esperar a que el irlstnunellto esté estable, en lo que se refiere a la temperatura, el flujo de la
fase móvil y la presiúlI.
• Establecer las condiciolles del sisterna de integración y tratamiellto de datos <Jynkoson (ver
alH: .'\OS ).
• Hacer dos inyecciones sucesivas de la mezcla de pmeha 1\.
·1 '.11 caso dl' qm' haya
S()lapallli(~lltl)
veces la rnc:;'zc\a (k prlll'ha 1)'\.
dl' picos eH la iIlyl'Cl'iún all1l'rinr,
t'Il10lICeS ilIYt' l'tar
dos
1QS-C lU )l\1A
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11~-96
9/13
En aquellas columnas que presenten colas, especialmente en el pico de la amina, es nec.esario
cambiar de fase móvil: para ello se ejecutan los siguientes pasos:
• Bajar el flujo de la fase móvil hasta O ml/min en decrementos sucesivos de 0,10 ml/min.
• En la línea donde está el agua M iIIiQ (tic la fase móvil anterior) colocar el Tampón Fosfato.
I
• Abrir la pllfga y purgar este canal (corno se describe antes) hasta que por la salida de la
pllfga se
IIOIe
qlle sale solllciúl\ áei":a (lo que se detecta lIsalldo papellflcdidor de plI).
Cerrar la purga.
• Restahlecer las condiciones lk t'()II\,PosiciúlI de I¡.se lIIúvil (fase lJIúvil 2) y <Id flujo de fase
móvil
(COIIIO
se illdiea con allterioridad l.
Esperar ha...;;ta alcanzar la estabilidad del instl1Hncllto.
• Inyectar dos veces sucesivamente la mezcla de pmeba PB"
• Para las columnas <-lile muestren solapéUniento de picos, realizar dos inyecciones sucesivas
de la mezcla de pmeba P' B"
• Generar los infOlmes tal
5.
u
COlllO
se establece en el anexo n"2.
R~sllllados.
software de integración SllIllillistra
valores para los siglliclItes parámetros
".
1\11
d~
illt"onllc que, adclII:\s llel cromatograll1a, incluye
cada pico:
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10/ 13 N° del pico.
Tiempo muerto t 1) (min).
'riempo de retención (min).
Nombre del pico.
Tipo de pico scgún la integración . Área de pico (mv .min) . Altura de pico (mv). Anchura de pico a la mitad de h1 altura (min) . I
Númcro de platos tcúricos por columna .
Resolución .
Asimetría de pico .
Factor de capacidad.
OBSERVACIONES.
Es necesario calcular además, el número de platos/metro, la selectividad (a) en caso de que
no haya solapamiento de picos y la altura de plato reducida (h), de la fonna indicada en las
definiciones .
Si se trata de hace rle un scguimiento a la columna durante su vida útil, es indispensa ble
comparar los datos ohtenidos con aquellos dados por la aplicación del test antes del inicio
dduso de la columna.
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ANEXOS
N" 1: Archivo DET (integración) del Gynkosoft. N"2: Archivo PRM (infornle) del Gynkosoft. N"~ :
Cromatograma de la mezcla ele prueba P A en la fase móvil 1 y con la columna Lichrospher. N"4 : C'romatograma de la mezcla de prueha P'A en la fase móvil 2 y con la columna Lichrospher. Archivo DET (integracitln de los picos) del sistema de tratamiento de
datos.
Number of entries: 5
File title:
DETHP
No.
Time
1
0.000
0.000
0.000
0.000
1.000
2
3
4
5
Parameter Name
Parameter Value
Minimum
Minimum
Minimum
Inhibit
Inhibit
0.000000
0.000000
10.00000
On
Off
Area
Width
Height
Integration
Integratlon
Archivo PRM (informe) del sistema de trat'amiento de datos.
File title: testPRMHPI050
Signa 1 name ............... .
Time window from .......... :
Signal window from ........ :
Report unidentified peak s .:
Dead time ................. :
Relative area threshold ... :
AD-5
0.000
AUTO
On
to:
to:
10.000
AUTO
[min]
1.4 min
0.0 %
I IIVERSIDAO NACIONAL
DE COLOMBIA
ANEXO N°4: Gráficas de linealidad, factores de respuesta y sensibilidad
del test de verificación.
LINEALIDAD
.._ ....
LINEALIDAD
NoftalDoo
rt'1
JIIi~
~E~;;Eg
o
1000
2000
3000
.-.(ng)
1IonW6g...o Urpó" HP-IOSO
" . . . 0,216:11' O,OOIl2I(m...)
.000
6000
-e...·....
t==,~?fGl
o
200
400
~
EDO
t. 000 -toIIl Qunotógrolo u..... HP-IOIiO
... =(\21il10· O,06!22(n-.A)
r CUldrado:;: 0. 9997fi
r wadr.do:;: O,goo(tQ
LINEALIDAD
LINEALIDAD
Fen..lreno
........ Jllinl rI'~
-e....·minl
~I=?C 5 t2 t2 S8
~L:c=tE2@EI
1IonW6g...o Urpó" HP. lOS)
" .. = 0.22346' O,OU2I(m ...)
r cuadrldo 5 O, QQ984
~ ..o
o
200
400
SOO
eoo
1.000
1.200
1400
-Cn!ll
o
100
200
:m
400
-CnfII
UrpódDlP-tOliO
• • • (\ 1237S • 0. 14014(.....)
r OJldrado =O.~
LINEALIDAD
Al1lr.cello
,1'5
-e...·.....
SUSTANCIA
t:::::c:1
o
fI)
100
-CnfII
Qonoh\gr..oU..... ' ..- lClIIO
ir. :;: t, H227 •
, wldndo:;:
O.'JCl)t~lN w)
O,~16b
160
200
260
rCLW>RADO
tw=TALENO
0,88815
BFENILO
0,8_0
F1.UORENO
0,88884
FENANrRENO
0.88884
ANTAACEHO
0,88155
ltXJ
1,
LINEALIDAD
LINEALIDAD
Nlllaleno
Blerilo .
rf'1
n"8
Ir_Imu";n)
~tj;¿Gg:1
_... (n"
1 OOJ
o
3 OOJ
2.000
4 OOJ
6 OOJ
Qanortlg.lfo U"'IID HP-IOQO (),I(J
~:-==.=1
O
7oo
400
o.
, ... =. O. 1:le08. O,001IiO(m...)
'cuidrldo: 0,99948
eoo
ID:)
-"'111
1 000
1700 "
Qumoblgrlfo l r"'lID HP-IOQO [W)
"u = 1~18. 0,03/" (m...)
r cuadrado =O,09Q53
LINEALIDAD
LINEALIDAD
Ruarono
n"9
_~JnÍnj
~I:-?: ?C-In.,: ; 31
OO
100
200
300
'00
QomoI6gnfoU"''' HP -tOIIO (),I(J
6, • • 0.74l1l>I • 06101(m...)
o.
r cudrldo =O. 099U~
LINEALIDAD
M ..ceno
rf'11
SUSTANCIA
r
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-..,
o
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liJ
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100
176
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"lO' 0.501840. O,16171(m...)
r c.uadr.do
=O,gQ6()t
1&J
116
200
225
NAFTALENO
0,8ee.48
BFENIlO
0.88853
FlUORENO
0.88845
FENANTRENO
0.88818
NlTRACENO
0.88804
260
eoo
LINEALIDAD
LINEALIDAD
ElIDO
N.n....... 11"13
rM4
- ( _.1MIl
- ( -.nWtI
~C:-==:~1
~I~ ?:== == 61
. . . - Q 00738 • 0,01.36 (.....)
. . . . Q0Q628' O,OOON (.....)
r cuadrado r; O. ~
oo
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11"15
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o
200
.00
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~""oLl";"HP-IQ80.161 AD
0,11616' 0,030161 (m...)
r 'Uldfldo & O,gQjQ6
1 000
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LINEALIDAD
LINEALIDAD
-
ID:!
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1200
O
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• • • Q"1O&. O, 10162 (.....)
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LINEALIDAD
_
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11"17
.....min)
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O
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Dumoltlg,"Q ll";"
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r tuodlodo • 0,\11;& 7
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8USTANCIA
rCUADIW)O
NAfTAlENO
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0.11I83~
FlUORENO
FEHANTRENO
NfrRACEHO
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0.1112'
0,81118
0,811841
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LINEALIDAD
LINEALIDAD
Elfenilo
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Naftaleno
rl'19
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o
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LINEALIDAD
LINEALIDAD
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r cUildrado :; 0, 0t.;lt972
LINEALIDAD
SUSTANCIA
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0,118880
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o.e8848
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0,88812
FENANTRENO
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\
0,88841
0,88132
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LINEALIDAD
LINEALIDAD
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0.88810
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0.811808
FENANTRENO
0.18M3
ANTRACENO­
0.811813
LINEALIDAD
LINEALIDAD
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LINEALIDAD
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o
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LINEALIDAD
MlrllCeflo
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•••• 440
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Bifenio
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LINEALIDAD
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