la biogénesis del quiste de giardia duodenalis como modelo de

Bustos Jaimes I, Castañeda Patlán C, Oria Hernández J,
Rendón Huerta E, Reyes Vivas H, Romero Álvarez I,
(eds). Mensaje Bioquímico, Vol XXXII. Depto de
Bioquímica, Fac de Medicina, Universidad Nacional
Autónoma de México. Cd Universitaria, México, DF,
MÉXICO (2008).
(http://bq.unam.mx/mensajebioquimico)
(ISSN-0188-137X)
LA BIOGÉNESIS DEL QUISTE DE GIARDIA DUODENALIS COMO
MODELO DE DIFERENCIACIÓN UNICELULAR
María Luisa Bazán-Tejeda, Raúl Argüello-García y Guadalupe Ortega-Pierres
Departamento de Genética y Biología Molecular. Centro de Investigación y de Estudios
Avanzados del IPN, 07360 México, D.F.
gortega@cinvestav.mx
Resumen
Giardia duodenalis es un parásito de divergencia evolutiva temprana y uno de los
principales agentes etiológicos causantes de infecciones entéricas en humanos y en otros
vertebrados. Este protozoario sufre cambios complejos durante el enquistamiento, considerado
como el proceso de diferenciación de trofozoíto a quiste que le permite sobrevivir fuera del
intestino de su huésped. En el caso de Giardia, el enquistamiento ha sido crucial para sobrevivir
exitosamente como parásito ya que el estadio de quiste es una entidad debidamente adaptada
para su transmisión a un nuevo huésped y probablemente represente una forma de adaptación
ancestral a ambientes adversos. El estudio del proceso de diferenciación a quiste resulta muy
importante no solo por el impacto de este parásito en la salud humana sino también por su
relevancia para entender la evolución de los mecanismos de diferenciación eucariótica. Así, el
enquistamiento ha sido considerado como un modelo de estudio útil a nivel básico. A pesar de
que se han reportado varios estudios sobre el enquistamiento en este parásito, aún no se
conocen por completo los procesos moleculares por lo cuales el trofozoíto se enquista. En esta
revisión, se discuten las evidencias moleculares y celulares conocidas hasta ahora respecto a la
biogénesis del quiste de Giardia, incluyendo un análisis de su impacto potencial en
epidemiología, profilaxis y diseño de fármacos para el control de la giardiasis.
Palabras clave: Giardia
diferenciación en eucariontes.
duodenalis,
25
enquistamiento,
mecanismos
moleculares,
MENSAJE BIOQUÍMICO, Vol. XXXII (2008)
Abstract
The early divergent parasite Giardia duodenalis is a major cause of enteric disease that
infects humans and other vertebrates. This protist undergoes a series of complex changes to
survive outside the intestine of its host by differentiating into infective cyst. The process of
encystment in Giardia is crucial for successfully live as parasite since the cyst is highly adapted to
very hostile environments and it can easily be transmitted to a new host. This may represent an
ancestral response for adaptation to non-favorable environments. The study of Giardia
encystment is important due to the impact of the infection caused by this parasite on human
health and also this may help to understand evolutionary mechanisms occurring in eukaryote
differentiation. In spite of extensive studies on Giardia encystment, the molecular events involved
in the encystment of trophozoites have not yet been fully defined. In this review we discuss
cellular and molecular events concerning biogenesis of Giardia cysts, including a global overview
of its impact on other studies.
Keywords: Giardia duodenalis, encystment, molecular mechanisms, eukaryote differentiation.
Introducción
Giardia duodenalis (sinónimos: Giardia lamblia, Giardia intestinalis) es el agente
etiológico causante de la Giardiosis. Esta infección es una enteropatía mundialmente endémica y
ocasionalmente epidémica que afecta particularmente a la población pediátrica de países en vías
de desarrollo [1]. La infección por Giardia puede ser asintomática o presentar diversos síntomas
como la pérdida del apetito, diarreas agudas o crónicas y síndrome de malabsorción lo cual se
ha asociado al retardo en el crecimiento y en consecuencia con cuadros de desnutrición [2].
El estudio de este parásito es importante tanto por su impacto sobre la salud humana
como por su relevancia en el conocimiento de la evolución de los eucariontes, debido a que se
ha considerado que Giardia tuvo una divergencia temprana en la escala evolutiva considerando
estudios filogenéticos del RNA ribosomal, ATPasa vacuolar y del factor de elongación 2 [3]. Sin
embargo su posición evolutiva aún es controversial debido a que recientemente se identificaron
en Giardia diversas proteínas mitocondriales y también se detectaron estructuras similares a las
mitocondrias a las que se les dió el nombre de mitosomas [4,5]. De acuerdo con estas
evidencias se ha sugerido que Giardia surgió de un ancestro más evolucionado de lo que se
había considerado, o que al menos Giardia presenta tanto características ancestrales como
altamente evolucionadas que van de acuerdo con su actual condición de parásito.
Ciclo de vida
Este parásito tiene un ciclo de vida directo simple con dos estadios que permiten su
sobrevivencia en dos tipos de ambiente desfavorables. La entidad patogénica o vegetativa
conocida como trofozoíto se adhiere a las células del intestino ocasionando los síntomas de la
giardiosis, en tanto que el quiste constituye la entidad infectiva. Así, este parásito presenta dos
procesos de diferenciación que se llevan a cabo en el hospedero: el desenquistamiento y el
enquistamiento. La infección se inicia mediante transmisión fecal-oral directa por la ingestión del
26
Bazán-Tejeda y cols.
quiste que se encuentran en agua o alimentos contaminados. Una vez que el quiste se localiza
en el estómago del hospedero se inicia el desenquistamiento desencadenado por la actividad de
las enzimas hidrolíticas pancreáticas así como por el medio ácido de este órgano. Este proceso
culmina en el duodeno y finaliza cuando se rompe la pared quística y emerge del quiste una
masa tetranucleada de protoplasma denominada excizoíto [6]. A partir de un quiste se generan
cuatro trofozoítos que se adhieren a las microvellosidades intestinales del duodeno y se dividen
por fisión binaria, colonizando profusamente la mucosa intestinal. El enquistamiento se realiza
principalmente en el yeyuno, probablemente por la acción de la bilis y productos de lipólisis [7].
Los quistes son expulsados por el huésped y permanecen en estado de latencia en el
medio ambiente, teniendo una baja actividad fisiológica [8]. Debido a las características,
particularmente de la pared del quiste, puede sobrevivir en el medio externo aún y cuando se
presentan variaciones drásticas de pH y de tipo osmótico [9]. Asimismo, la eficiencia de la
transmisión de Giardia depende en forma decisiva de la formación adecuada de esta estructura.
En el proceso de enquistamiento de Giardia se distinguen cuatro fases: (a) Inducción y
transducción del estímulo de enquistamiento, (b) Expresión diferencial de genes estadioespecíficos, (c) Síntesis y transporte de los componentes de la pared del quiste, y (d)
Ensamblaje de la pared celular .
Inducción y transducción de estímulos en el enquistamiento
Aún no se han determinado en su totalidad cuáles son los estímulos inductores del
enquistamiento in vivo, sin embargo existen evidencias de cuál sería la naturaleza de éstos
debido a que este proceso de diferenciación ha sido reproducido in vitro siguiendo diversas
estrategias que incluyen: (a) empleo de una atmósfera de de N2/CO2 en una proporción de 90:10,
(b) uso de altas concentraciones de sales biliares en el medio de cultivo y (c) empleo de medios
deficientes en colesterol [10,11,12]. El segundo método ha sido el más reproducible y eficiente,
por lo que ha sido empleado en la mayor parte de los estudios reportados en relación con el
5
enquistamiento de este parásito. Así, se han logrado rendimientos de hasta 4 X 10 quistes/ml
[13].
Aún cuando el enquistamiento de Giardia se puede reproducir in vitro, no se han
dilucidado por completo las bases moleculares que activan la expresión diferencial de genes en
este proceso. En otros eucariontes, la regulación de las interacciones tan complejas que ocurren
tanto en la diferenciación como en la proliferación, está mediada en parte por redes de
fosforilación de proteínas, las cuales son moduladas por cinasas y fosfatasas. En Giardia no se
tiene información detallada sobre las bases moleculares de la fase inductiva del enquistamiento,
aunque se han identificado algunos elementos de señalización que posiblemente participen en la
inducción del enquistamiento.
En cuanto a la asociación de la inducción del enquistamiento por ausencia de colesterol,
recientemente se identificó en G. duodenalis el receptor denominado Ck y la proteína de unión a
elementos reguladores de esteroles (SREBP) los cuales participan en el control de la
homeostasis celular del colesterol. En trofozoítos, se ha sugerido que el receptor Ck funciona
como un sensor de colesterol. La inactivación de este receptor trae como consecuencia el
incremento de proteínas de la pared del quiste (CWP, específicamente la CWP1), sugiriendo que
este receptor regula de manera negativa el enquistamiento. Así, la presencia del colesterol
podría estar inhibiendo el proceso de diferenciación [14]. Al respecto, aun es necesario
caracterizar la ruta de señalización que activa directamente el enquistamiento.
Las cinasas reguladas por señales extracelulares 1 y 2 (conocidas como ERK1 y ERK2)
también han sido identificadas en Giardia. De estas cinasas, se ha reportado que principalmente
ERK1 presenta cambios de expresión y actividad durante el enquistamiento, por lo que se ha
27
MENSAJE BIOQUÍMICO, Vol. XXXII (2008)
sugerido que participa directamente en este proceso. Así mismo, se ha sugerido la participación
de la proteína cinasa B o Akt (PKB), identificada recientemente empleando un anticuerpo que
reconoce a un homólogo de mamífero [15]. La cinasa PKB presenta un aumento en su expresión
durante el enquistamiento, por lo que se ha asociado a la inducción de este proceso [15,16]. Otra
proteína implicada en el enquistamiento, que pertenece al grupo de las AGC cinasas en el cual
también se incluye PKB es la proteína cinasas C (PKC). En Giardia duodenalis se han
identificado las isoformas de PKC beta, delta, epsilon, theta y zeta. De manera interesante, estas
proteínas mostraron diferentes patrones de expresión durante el enquistamiento y el inhibidor
general de PKC, bisindolilmaleimida I, redujo significativamente este proceso sugiriendo su
participación durante el enquistamiento. En este contexto, la única isoforma dependiente de
Calcio, la PKC beta, presentó actividad de cinasa dependiente de los cofactores de PKC y de
manera notable se redistribuyó hacia la membrana plasmática a los 10 min post-inducción de
enquistamiento, indicando la posible activación de esta enzima durante la fase temprana del
enquistamiento [17]. En este contexto, es importante señalar que homólogos de ERK y de PKC
beta están involucradas en la vía de señalización que activa el proceso de formación de la pared
celular en levaduras [18], lo cual sugiere que esta vía de señalización podría estar conservada
en eucariontes con una función similar. En relación con PKB, en G. duodenalis se han
identificado homólogos de varios elementos de señalización vinculados con PKB como la
fosfatidil-inositol-3-cinasa ó PI3K (PI3K1 y PI3K2), el blanco de rapamicina (gTOR), el factor de
iniciación de la elongación 4E (eIF4E) y la cinasa dependiente de fosfoinosítidos ó PDK1 [19,20].
Sin embargo, se requiere definir si la vía en la que participan estas moléculas activa la
proliferación o la diferenciación. De hecho esta vía podría regular negativamente el
enquistamiento mediante la actividad de TOR, ya que se ha reportado que en levaduras al
inhibirse la actividad de TOR se induce la activación de la vía de señalización asociada con
PKC1 que participa en el mantenimiento de la pared celular en estos organismos [21,22] (Figura
1). Por otra parte, recientemente se reportó que la subunidad regulatoria de la PKA de Giardia
disminuye su expresión durante el enquistamiento [23], mientras que la subunidad catalítica se
sobre expresa [24], lo cual pone de manifiesto su papel en los procesos de diferenciación de este
parásito. En un estudio reciente se reportó que la proteína adaptadora 14-3-3, implicada en el
reclutamiento de elementos de señalización, migra al núcleo durante el enquistamiento de G.
duodenalis, indicando que probablemente se encuentra activada durante esta fase de
diferenciación [25]. Finalmente, se ha caracterizado una serina/treonina fosfatasa 2 A (PP2A)
que puede participar en la modulación de las vías de transducción durante la diferenciación,
debido a que se sobre-expresa durante el enquistamiento tardío y al inicio del
desenquistamiento; mostrando una distribución peculiar en la célula, ya que se ha detectado
asociada al citoesqueleto de este parásito [26].
28
Bazán-Tejeda y cols.
Sensor de
nutrientes o
RTK
?
Receptor ó Sensor de
nutrientes (Ck?)
?
GiPI3K1
P
K
B
gPKC
PLC
PDK-1
DAG
activa
IP3
gPKC
inactiva
gTOR
?
?
ERK1
?
[Ca+2]i
Proliferación
Síntesis de Proteínas ?
(Activación de eIE4E )
ENQUISTAMIENTO
PI(3,4,5)P3 ó PI(4,5)P2
Sales Biliares
DAG
Figura 1. Modelo hipotético de las vías de señalización asociadas al enquistamiento de
G. duodenalis. En este esquema se muestran las vías de señalización propuestas que
integran los elementos de transducción que a la fecha han sido caracterizados en G.
duodenalis. El signo “?” indica que no se tienen evidencias bioinformáticas ni
experimentales sobre las interacciones y efectos indicados en su caso.
Expresión diferencial de genes estadio-específicos
Durante la fase temprana de enquistamiento en este parásito, se induce la expresión de
genes involucrados en la síntesis y transporte de los componentes de la pared del quiste.
Algunos de los productos codificados por estos genes corresponden a las CWPs. Hasta el
momento se han identificado CWP1, 2, 3 y la proteína del quiste no variante rica en cisteína ó
HCNCp como las proteínas que forman parte de la pared del quiste. Las CWPs presentan
dominios similares a un péptido señal amino terminal de secreción y repetidos en tandem que
son ricos en leucina (LRRs) [27-30]. Por otro lado, la HCNCp tiene similitud con las proteínas
variables de superficie (VSPs), las cuales pueden participar en mecanismos de evasión de la
respuesta inmune conocidos como variación antigénica que presentan los trofozoítos [31]. Las
CWPs se diferencian entre sí debido a que CWP2 tiene un dominio carboxilo terminal básico de
121 aminoácidos y CWP3 presenta solamente 4 repetidos ricos en leucina, mientras que CWP1
y CWP2 tienen 5 LRRs [28]. Estas proteínas se unen entre sí mediante sus LRRs formando
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MENSAJE BIOQUÍMICO, Vol. XXXII (2008)
complejos estables de heterodímeros y mediante estudios de microscopía electrónica se ha
observado que estas proteínas se localizan en la pared quística formando parte de los filamentos
[9,32]. Las CWPs incrementan su expresión inmediatamente después de la inducción del
enquistamiento al igual que otras proteínas como la glucosamina-6-fosfato isomerasa (GLN6PIb), la proteína BiP, Myb2, GLP1 y ENC6. Esta última fue identificada mediante una búsqueda en
el transcriptoma de Giardia como una proteína que se sobre-expresa a partir de las 5 h postinducción del enquistamiento, y aún cuando no presentó homología con alguna proteína
reportada, su identificación ha sido útil para estudiar las características estructurales del material
genético de este parásito así como en la identificación de la región consenso de poliadenilación
[33]. La proteína GLN6PI-b es la primera enzima involucrada en la síntesis de la N-acetil
galactosamina [34]. BiP actúa como chaperona y se encontró unida a CWP1 en las vesículas
específicas de enquistamiento (ESVs), por lo que se sugiere que impide las uniones prematuras
de estas proteínas dentro de estas estructuras [35]. Myb2, GLP1, GARP y gARID son factores de
transcripción que han sido clonados y caracterizados en G. duodenalis, que se unen a las
regiones promotoras de genes que se sobre-expresan durante el enquistamiento tales como
CWP1, 2, 3 y gln6pi-b e incluso se ha reportado que Myb2 regula su propia expresión [36,37].
Además, se ha determinado que estos factores de transcripción incrementan su expresión
durante la fase inductiva del enquistamiento [36-39]. A pesar de que se han reportado esta serie
de evidencias aún no se conoce con detalle el orden secuencial de activación de genes y la
forma exacta en la que operan estos factores de transcripción in vivo.
Síntesis y transporte de los componentes de la pared del quiste
Con respecto a los mecanismos implicados en el transporte de proteínas durante el
enquistamiento, se ha observado que durante este proceso las células pierden su capacidad de
adhesión, se redondean y comienza una vacuolización profusa. Estas vesículas son en parte las
vesículas específicas de enquistamiento (ESV). Las ESVs transportan a las CWPs y otros
elementos implicados en formación de la pared del quiste a la periferia de trofozoítos inducidos a
enquistamiento [40,41]. En la Figura 2 se observan a las ESVs identificando a CWP1 a través de
inmunofluorescencia indirecta empleando anticuerpos que reconocen a esta proteína [42]. En
esta figura se observa que las ESVs son específicas del enquistamiento, ya que en trofozoitos
bajo crecimiento vegetativo no fue posible identificar a estas vesículas (Figura 2A) mientras que
en los trofozoítos inducidos a enquistamiento se detectó inmunorreactividad que corresponde a
las estructuras conocidas como ESVs (Figura 2B). Por otra parte, también se ha reportado que
existe una relación estrecha entre las ESVs y las CWPs, debido que se determinó que la
expresión y agregación de CWP1 recombinante induce la formación de las ESVs [43] sugiriendo
que la formación y maduración de estas estructuras está condicionada al incremento y
oligomerización de las CWPs durante el enquistamiento. Esta observación fue sustentada al
determinar que las ESVs se desensamblan cuando son tratadas con el reductor DTT, lo cual
podría ser consecuencia de la monomerización de las CWPs [44].
30
Bazán-Tejeda y cols.
Figura 2. Identificación de los las proteínas de la pared del quiste mediante
inmunofluorescencia indirecta empleando anticuerpos policlonales dirigidos contra las
proteínas que forman esta estructura. (A) Trofozoítos en proliferación, (B) Detección de
ESVs transportando los elementos de la pared del quiste en trofozoítos inducidos a
enquistamiento durante 18 h. (C) Inducción de enquistamiento durante 90h. En la parte
inferior se observa un trofozoíto enquistante con parches de material de la pared del
quiste en la superficie, y en la parte superior se observan dos quistes morfológicamente
distinguibles con tinción uniforme en la superficie. En los paneles del lado izquierdo se
muestran fotomicrografías en campo claro y en los paneles del lado derecho los campos
correspondientes con la técnica de inmunofluorescencia indirecta. Tomado de CastilloFigueroa (1997) (ref. 43).
Mediante estudios de microscopía electrónica se observó la aparición de las ESVs desde
las 6 h post-inducción de enquistamiento con una apariencia electrón-densa y se determinó que
estas vesículas surgen del retículo endoplásmico [45]. Diversas evidencias experimentales
sugieren que las ESVs representan un organelo similar al Aparato de Golgi, a pesar de que estas
vesículas no poseen la forma aplanada o de cisterna típica del organelo de eucariontes
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MENSAJE BIOQUÍMICO, Vol. XXXII (2008)
superiores. Estas estructuras presentan marcadores clásicos del Aparato de Golgi tales como
coatómeros (Gi’COP), BiP1, YIP1 (GiYip1) y ARF que es una proteína de unión a GTP [46,47].
Las ESVs también presentan propiedades funcionales de Aparato de Golgi, ya que el transporte
de CWP1 es inhibido en presencia de Brefeldina A, el cual es un metabolito fúngico que actúa
como bloqueador del intercambio de nucleótidos de guanina de ARF, lo que ocasiona el
desensamble del Aparato de Golgi en eucariontes al prevenir la unión de ARF y coatómeros [46].
Las estructuras que corresponden al Aparato de Golgi se han observado conspicuas durante el
enquistamiento de G. duodenalis, aunque también se han detectado estructuras con
características de Aparato de Golgi en los trofozoítos que no han sido inducidos a
enquistamiento [40]. El Aparato de Golgi se ha observado mediante el marcaje con NBDceramida tanto en las membranas de las ESVs como en la periferia nuclear de los trofozoítos
que no son inducidos a enquistamiento (46,48). Esta evidencia sugiere que probablemente el
Aparato de Golgi en este parásito es críptico, incipiente o en ocasiones ausente en los
trofozoítos que no enquistan [40,46,48]. En cambio, durante el enquistamiento esta estructura se
hace más evidente por los requerimientos propios del estadio como son: un transporte
exhaustivo de los elementos necesarios para la formación de la pared del quiste, la maduración
o modificaciones post-traduccionales de estos elementos y el ensamblaje de la pared quística.
Por otra parte, también se ha determinado que en G. duodenalis ciertas funciones del retículo
endoplásmico y Golgi co-localizan o se yuxtaponen espacialmente y temporalmente en una
novedosa vía de secreción que está regulada [45]. En su conjunto, estos datos enfatizan que
este parásito posee características muy particulares, las cuales probablemente derivan de su
divergencia evolutiva temprana o tal vez sean una consecuencia de la co-evolución que
experimentaron como consecuencia de la relación huésped-parásito.
Ensamblaje de la pared quística
En relación con la composición de la pared quística, se ha determinado que está
integrada por una porción interna membranosa y una externa filamentosa de 0.3-0.5 μM [49]. La
pared filamentosa externa esta compuesta de proteínas (37%) y de filamentos del carbohidratos
(63%), principalmente de un homopolímero de N-acetil galactosamina [50-52]. El precursor de
este homopolímero es la UDP-N-acetilgalactosamina (UDP GlcNAc), la cual se sintetiza a partir
de glucosa por una vía de enzimas que se sobre-expresan durante el enquistamiento [53]. Estas
enzimas
son:
glucosamina-6-fosfato
isomerasa,
glucosamina-6-fosfato
N-acetilasa,
fosfoacetilglucosamina mutasa, UDP-GlcNAc pirofosforilasa y UDP-GlcNAc 4’ epimerasa [54]. El
UDP-GalNAc se convierte posteriormente en un homopolímero de (1-3)-D-GalNAc por la
actividad la enzimática tentativamente llamada “sintasa de la pared del quiste” [55,56].
En cuanto al depósito de los elementos que forman la pared del quiste aparentemente
éstos son liberados en la periferia de los trofozoítos por las ESVs mediante exocitosis; al
respecto se ha observado que las membranas de las ESVs presentan continuidad con la
membrana plasmática [40, 13]. La secreción de los elementos de la pared de quiste, de las ESVs
hacia la periferia celular, se observó al utilizar el trazador catiónico Rojo de Rutenio (RR) que
presenta 6 cargas positivas que le permiten unirse a los extremos de las proyecciones fibrilares
en proceso de polimerización (Figura 3A) [9].
32
Bazán-Tejeda y cols.
A
ESV
0.1 μM
B
C
0.1 μM
D
0.1 μM
E
F
1 μM
1 μM
1 μM
Figura 3. Identificación del ensamble extracelular de la pared del quiste de Giardia
mediante la tinción con Rojo de Rutenio (RR). (A) Estructuras fibrilares en formación
detectadas en la superficie dorsal de los trofozoítos mediante el marcaje con RR
(cabezas de flechas). (B) Depósito de la malla fibrilar sobre la región dorsal del trofozoíto
positiva a RR mostrando pliegues en la superficie celular (flechas). (C) Pared del quiste
completamente ensamblada, mostrando las capas fibrilar (OCW) y membranosa (ICW) la
cual es refractaria a la tinción con RR, indicando un posible cambio en los sitios de unión
o en la carga neta del heteropolímero. (D) Detección de ESVs (flechas) en trofozoítos
inducidos a enquistamiento durante 18 h. (E) Identificación de vesículas periféricas en un
quiste en el cual se está efectuando la formación del espacio peritrópico (cabezas de
flecha). (F) Quiste maduro de Giardia que presenta 4 núcleos, pared quística y espacio
peritrópico (cabezas de flecha) completamente conformados. N, Núcleo; Ad, disco
adherente; OCW, porción externa de la pared del quiste; ICW, porción interna de la pared
del quiste; ESVs, vesículas específicas de enquistamiento. Tomado de Argüello-García
(2003) (ref. 13).
33
MENSAJE BIOQUÍMICO, Vol. XXXII (2008)
Así, se ha sugerido que durante la formación de la pared, los polipéptidos como las
CWPs son transportados por las ESVs a la periferia celular (Figura 3A y 3D) y se depositan
inicialmente en la superficie del trofozoíto, mientras que los precursores de Nacetilgalactosamina se integran posteriormente a la pared del quiste para finalmente copolimerizarse y formar la malla fibrilar. Al respecto, la CWP1 se ha identificado en las ESVs
desde las 5.5 h post-inducción de enquistamiento; en cambio, la identificación de Nacetilgalactosamina mediante la tinción con RR sobre la superficie de trofozoítos enquistantes se
observó hasta las 9-10 h post-inducción [9]. La formación de la pared del quiste se realiza por
regiones, debido a que se encuentran parches de malla fibrilar dispersos en la superficie de los
trofozoítos inducidos a enquistamiento (Figura 2C), los cuales son más evidentes a las 15-18 h
post-inducción. Estos parches aparecen al azar y al multiplicarse se unen entre sí y en ocasiones
se sobrelapan engrosando la malla fibrilar. Esta condición le proporciona a la membrana del
trofozoíto una apariencia rugosa durante esta fase extracelular del enquistamiento. Al terminar el
ensamblaje de la pared del quiste, esta estructura se torna lisa y homogénea (Figura 2C y 3C).
En estas circunstancias, la pared del quiste presenta tinción negativa a RR porque
probablemente ya no expone los sitios de unión a este compuesto o porque la carga neta del
polímero ha cambiado [9].
En cuanto a la estructura membranal interna de la pared del quiste, se ha
sugerido que se forma por la fusión de las vesículas periféricas (PV). Estas últimas
presentan características de endosomas tempranos y tardíos que van a formar los
lisosomas en Giardia [57]. La unión de las membranas de las vesículas periféricas y la
formación del espacio peritrópico se observó mediante el análisis de las células en
proceso de enquistamiento empleando microscopía electrónica, lo que sugiere que
mediante este proceso se forma la bicapa lipídica de la porción interna membranosa de
la pared del quiste y el espacio peritrópico, que es el espacio que encuentra entre
ambas membranas [58].
Impacto y relevancia del estudio del enquistamiento
El conocimiento de los mecanismos del enquistamiento ha sido muy relevante en
el diseño de vacunas [59] ya que se propone emplear en el diseño de fármacos con el
propósito de interrumpir la transmisión de G. duodenalis [60]. En este contexto,
recientemente se produjo una vacuna de DNA que contiene la secuencia de CWP2
expresada en Salmonella thypimurium. Mediante el empleo de este vector en la
inmunización de modelos experimentales previo a la infección con G. duodenalis se
observó una reducción del 60% en la liberación de quistes en los modelos
experimentales empleados debido a la estimulación de la respuesta inmune mucosal
[59]. Esta respuesta se caracterizó por un incremento de células T CD4+ tanto a nivel
mucosal como sistémico así como por un incremento de IL4 e IFN en células de bazo y
de nódulos linfáticos mesentéricos en los modelos experimentales inmunizados, siendo
estas condiciones del sistema inmune análogas a las que se presentan durante la
eliminación de Giardia [61,62].
En cuanto al diseño de fármacos se pretende llevar a cabo inserciones de
secuencias de nucleótidos que presentan los diversos genes que codifican a las
proteínas involucradas en el enquistamiento ya que estas secuencias diferenciales se
pueden utilizar para el diseño racional de fármacos. Entre estos elementos se
encuentran algunas proteínas de señalización como la PKC y GiPI3K [17,19].
Asimismo, algunos inhibidores de PKC se están estudiando para fines terapéuticos,
34
Bazán-Tejeda y cols.
entre éstos se encuentran las bisindolilmaleimidas Enzastaurina (LY317615 .HCl) y
Ruboxistaurina (LY333531) para el tratamiento de neoplasias o diabetes,
respectivamente [63,64]. Por otro lado, se tienen evidencias sobre el efecto de fármacos
dirigidos contra PKCs de otros eucariontes patógenos, a este respecto se ha
determinado que la Cercosporamida, un fármaco que se emplea exitosamente en el
tratamiento de la infección por Candida albicans, es un inhibidor especifico de la
CaPKC1p. De manera interesante, este compuesto no se une a las PKCs de mamífero
[65] lo cual hace posible su empleo efectivo en el control de la infección por este
organismo. Asimismo, la síntesis de la N-acetilgalactosamina también puede ser
interrumpida al inhibir la actividad de alguna de las enzimas implicadas en la vía de
síntesis lo cual ya se esta llevando a cabo en levaduras patógenas. En este contexto,
en levaduras se ha puesto especial atención en el desarrollo de inhibidores de la sintasa
de glucano (1-3) debido a que esos compuestos pueden interrumpir la formación de la
pared celular [66].
Finalmente el estudio del enquistamiento de G. duodenalis presenta ventajas
adicionales debido a la posición filogenética muy particular de este parásito. Así, el
conocimiento de los mecanismos implicados en el enquistamiento de Giardia permitirá
emplear a este parásito como un modelo para establecer similitudes y diferencias del
enquistamiento en otros parásitos protozoarios e incluso en la diferenciación de
eucariontes.
Agradecimiento
Este trabajo fue financiado en parte por CONACyT proyecto No. 49724-M.
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Semblanza de la Dra. Guadalupe Ortega Pierres
La La Dra. Guadalupe Ortega-Pierres es Bióloga por la UNAM
y obtuvo el grado de Ph. D. en Inmunología en la Universidad
de Bristol, Inglaterra. Tiene una amplia experiencia profesional
en el área de Microbiología y Parasitología. A nivel
Internacional realizó una estancia post-doctoral en el Instituto
Nacional de Investigación Médica, Mill Hill, Londres, Inglaterra
y posteriormente estuvo por varios periodos en esa Institución
como Profesor visitante. Otras estancias académicas que
realizó la Dra. Ortega-Pierres fue en la Escuela de Salud
Pública de la Escuela de Medicina de Harvard en Boston MA,
USA., en la Unidad de Parasitología CNEVA y en el
Laboratorio Central de Investigación en Veterinaria ambos en
Maison-Alfort, Francia. A nivel Nacional la Dra. Ortega-Pierres ha trabajado en la Facultad de
Medicina, UNAM, en la UAM-Xochimilco y desde 1983 es Profesor Investigador del
Departamento de Genética y Biología Molecular del CINVESTAV-IPN, en el que ha tenido
diversos cargos como Coordinador Académico y Jefe de Departamento. Debido a su amplio
reconocimiento en el área, la Dra. Ortega-Pierres ha recibido varios premios y distinciones en la
que destacan: Premio “Miguel Otero” otorgado por el Consejo de Salubridad General, México;
Premios “Lola and Igo Flisser/PUIS” por la UNAM; Premio “Dr. Everardo Landa” y “von BehringKitasato” por la Academia Nacional de Medicina, México; Premio “Canifarma” por la Cámara
Nacional de la Industria Farmacéutica y “Jorge Rosenkranz por Roche, México. Actualmente
pertenece al Sistema Nacional de Investigadores nivel II. La Dra. Ortega-Pierres ha publicado
más de 50 trabajos de investigación original en revistas internacionales de impacto
especialmente en el área de Bioquímica y Biología Molecular de parásitos y tiene otras 49
publicaciones más en esta última área. Ha participado en varios comités editoriales de revistas
científicas y actualmente es miembro de estos en las revistas Research and Reviews in
Parasitology, España, Archives in Medical Research, IMSS, México y the Journal of Infection in
Developing Countries. Ha sido miembro del Comité Ejecutivo de la Comisión Internacional sobre
Trichinellosis, presidente del Comité Organizador de la IX International Conference on
Trichinellosis, del XV Congreso Nacional de Parasitología, de la II International Giardia and
Cryptosporidium Conference y miembro del Comité Científico del From Alaska to Chiapas, The
First North American Parasitology Congress, entre otros. Actualmente es miembro de numerosas
sociedades científicas Internacionales (Sociedad Americana de Medicina Tropical e Higiene,
International Commission for Trichinellosis) y Nacionales (Academia Mexicana de Ciencias,
Academia Mexicana de Medicina y la Sociedad Mexicana de Parasitología). Las líneas de
investigación de la Dra. Ortega-Pierres se relacionan con el estudio de mecanismos que
participan en el enquistamiento de G. duodenalis, en la resistencia a drogas en este parásito y
.
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MENSAJE BIOQUÍMICO, Vol. XXXII (2008)
en la patogenia de la giardiosis. Así mismo, estudia los mecanismos que participan en la
activación de respuestas inmunes protectoras a nivel intestinal en infecciones experimentales
con Trichinella spiralis con la finalidad de identificar antígenos que puedan ser empleados en la
prevención de la triquinelosis y lleva a cabo la identificación de moléculas de importancia
biológica durante el desarrollo del parásito adulto.
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