Ciclo de replicación viral Josep Cucurull Canosa Servicio de Medicina Interna, Hospital de Figueres; Fundació Salut Empordà, Girona Introducción Entrada en la célula Transcripción inversa para la síntesis de ADN Entrada en el núcleo Integración Transcripción Traducción Acoplamiento Salida de la célula y maduración Bibliografía Introducción El VIH es una partícula esférica de 80 a 100 nM de diámetro con una estructura de tres capas, nucleoide, cápside y envoltura. La infección del huésped por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) se produce a través de la invasión de forma no productiva de células dendríticas, incluidas las células de Langerhans y las células epiteliales genitales, la cuales poseen en la membrana celular glucosaminoglucanos, unos complejos a los que se adhieren con baja afinidad diferentes virus, entre ellos el VIH (1). También se ha descrito la presencia en la superficie de las células dendríticas de una serie de lecitinas de tipo C denominadas DC-SING y L-SIGN, que son más específicas y tienen mayor importancia patogénica, al unirse de forma inespecífica a diferentes virus, incluido el VIH (2); debido a ello, la membrana de las células dendríticas queda recubierta de partículas virales. La unión del VIH a estas lecitinas facilita la infección de los linfocitos circulantes que entran en contacto con las células dendríticas mediante la interacción de DC-SIGN con la molécula LFA-3 presente en los linfocitos y facilitan la interacción entre el receptor de la célula T (TcR) y los péptidos procesados en las moléculas HLA de clase II (1). La infección del huésped por el VIH se produce a través de la invasión de las células que expresan en su superficie la molécula CD4 presente en los linfocitos T4 y en células de estirpe mononuclear-fagocítica. La molécula CD4 puede expresarse en células CD4 negativas, lo cual las convierte en células susceptibles de ser infectadas (3). Existen dos hipótesis para explicar este fenómeno: a) la síntesis de novo a través de una sobrerregulación de la molécula CD4, que hace que las células naïve y los linfocitos T CD8 de memoria puedan expresar CD4 bajo un estímulo adecuado, y también los correceptores CXCR4 y/o CCR5 (4); lo mismo puede suceder con los eosinófilos, que al infectarse, facilitan el acceso del VIH al tracto genitourinario y gastrointestinal (5); b) la transferencia del Ag CD4 a través de microvesículas, también llamadas micropartículas o exosomas, que se liberan espontáneamente de las células y que contienen componentes citoplasmáticos envueltos dentro de la membrana de la célula original que a menudo expresa proteínas de superficie (6); se ha demostrado que las microvesículas transferidas de células CCR5+ a células CCR5- las convierten en vulnerables a la infección por el VIH (7). La expresión de la molécula CD4 en la superficie celular es necesaria pero no suficiente para la entrada del VIH. En 1996 se caracterizaron los correceptores que corresponden a distintos receptores de quimiocinas que pertenecen a la familia de la proteínas G de unión (CXCR4, CCR5, CCR1, CCR2 a/b, CCR3) y son indispensables para la fusión del VIH con la célula. Los dos correceptores principales para la infección in vivo son CCR5 y CXCR4. Las cepas de VIH que usan el correceptor CCR5 (variantes R5) no infectan las líneas celulares de células T no activadas y son variantes menos virulentas no productoras de sincitios. Las cepas que usan el correceptor CXCR4 (variantes X4) tienen tropismo por las células de la línea linfoide, son variantes inductoras de sincitios y más virulentas, con mayor capacidad de destrucción del sistema inmunológico. Existen virus que pueden unirse a ambos tipos de receptores (variantes mixtas R5X4). Con el desarrollo de los inhibidores del CCR5 es imprescindible conocer el tropismo del virus (8, 9). En las fases iniciales de la enfermedad se observa un predominio de las variantes R5 (10); esto podría explicarse por la presencia de la quimiocina factor-1 derivado del estroma (SDF-1), que regula negativamente el receptor CXCR4 en los linfocitos de la lámina propia y de las células dendríticas (11), los cuales expresan altas concentraciones de CCR5, confiriendo a las variantes R5 una importante ventaja selectiva para su transmisión. Con la progresión de la enfermedad se observa un cambio en muchos pacientes que desarrollan variantes con tropismo mixto y en menor proporción predominio de las variantes X4 (10, 12). La evidencia más importante de la relevancia de CCR5 en la transmisión y patogénesis del VIH es la profunda resistencia a la infección por el VIH identificada en individuos homocigotos con la deleción 32 (CCR5-∆32) una forma no funcional del CCR5 (13). El ciclo de replicación del VIH se desarrolla en dos fases: la fase temprana incluye la entrada en la célula, la desencapsidación del genoma viral, la transcripción inversa para la síntesis de ADN, su transporte al núcleo y su integración en el genoma celular. A partir de ese momento puede permanecer en un estado de latencia proviral, sin replicarse, o iniciar la fase tardía con la transcripción, la síntesis y el procesamiento del ARN mensajero, la traducción y el procesamiento de las proteínas víricas, su acoplamiento en partículas que salen de la célula y su maduración. Estos diferentes pasos constituyen las dianas para el tratamiento antirretroviral: bloquear la entrada del virus en la célula con los inhibidores de la fusión y los antagonistas del correceptor CCR5 y la inhibición de las enzimas clave, la transcriptasa inversa, la integrasa y la proteasa. Entrada en la célula El VIH posee dos glucoproteínas de cubierta (Env) derivadas por endólisis de un único precursor: la gp160; la gp120, que deriva de la porción aminoterminal, interviene en la unión al receptor y dirige el proceso de fusión; la proteína transmembrana gp41, que deriva de la porción carboxiterminal y media en la fusión de membranas. Estas glucoproteínas se muestran solamente cuando el virus está lo suficientemente cerca de la membrana celular como para iniciar la entrada, evitando la exposición de estos dominios al sistema inmunológico (14). La entrada en la célula se inicia con la interacción entre la gp120 y el receptor específico de las células diana, la molécula CD4. La gp120 presenta cinco dominios variables (V1, V2, V3, V4, V5) intercalados entre partes fijas. Las partes de la gp120 que interactúan con el receptor CD4 solamente requieren conservar un limitado número de aminoácidos para mantener la capacidad de reconocer y de unirse con elevada afinidad al receptor; esto permite que el VIH altere las partes residuales del dominio de unión al CD4, cambiando su estructura antigénica, pero reteniendo su capacidad de unión (15). La interacción entre la gp120 y el receptor CD4 inicia cambios conformacionales de la gp120 con el despliegue de epítopos previamente ocultos que se unen al correceptor CCR5 o CXCR4. La secuencia V3, uno de los cinco dominios variable, además de dirigir el trofismo celular del virus, es fundamental en el uso de los correceptores como cofactores de la fusión y determina la actividad fusogénica del Env (16). Después de la unión al correceptor, se produce un segundo despliegue de la gp120 para la inserción del péptido de fusión de transmembrana (gp41) y la activación del mismo para transformarse de una forma prefusión a un estado fusogénico activo (14). La gp41 contiene un péptido hidrofóbico rico en glicina, esencial para la fusión y conformado en dos regiones, C-terminal y N-terminal. Con la activación se conforma primero una preestructura que lleva a la inserción de la región N-terminal en la membrana diana, la cual se une posteriormente a la región C-terminal, con lo cual da lugar a una estructura en forma de arpón que facilita la aproximación y la fusión de las membranas celular y vírica, mediante la formación conjunta de un poro de fusión (15). En el intervalo que va desde la exposición de la preestructura hasta que se completa la formación de la estructura de fusión, el virus es vulnerable a los inhibidores de la fusión que actúan en los intermediarios estructurales (15). Transcripción inversa para la síntesis de ADN Inmediatamente después de la entrada en el citoplasma, el core del VIH empieza un proceso de desensamblaje. La mayoría de las proteínas de la cápside del virus maduro están libres, no asociadas al core, y su liberación en el citoplasma provoca la disolución del core por un proceso de dilución (17), que va ligado al inicio de la retrotranscripción iniciada al contactar el complejo ribonucleoproteínico inicial con los desoxirribonucleótidos citoplasmáticos (18). La transcriptasa inversa cataliza la formación de una primera cadena de ADN a partir del ARN viral. La transcriptasa inversa posee tres actividades diferentes: ADNpolimerasa dependiente de ARN, ADN-polimerasa dependiente de ADN y ribonucleasa H. La ADN-polimerasa dependiente de ARN sintetiza una copia de ADN de cadena sencilla a partir del ARN, la ribonucleasa degrada parcialmente el molde ARN original y la segunda polimerasa sintetiza una segunda cadena de ADN a partir de la primera cadena. La retrotranscripción se inicia cuando el extremo 3’ del ARNt se une a la región de unión específica del primer ARNt (PBS), una secuencia de 18 nucleótidos localizada cerca del extremo 5’ de las secuencias repetidas largas (LTR) en el ARN genómico del virus. A continuación, en este extremo 3’ se libera un grupo hidroxilo, al que se incorpora el siguiente nucleótido (19). Para que el ARNt pueda actuar como iniciador necesita disponer de un grupo hidroxilo libre en el extremo 3’, lo cual sucede en las formas no acetiladas del ARNt; las concentraciones intracelulares de ARNt no acetilado son menores en las células latentes que en las proliferativas. Uno de los genes reguladores del VIH, el Vpr, puede unirse e inhibir la Lys-ARNt sintetasa, enzima involucrada en la aminoacetilación del ARNt, que aumenta las concentraciones de ARNt no acetilado y favorece, por lo tanto, la transcripción (20). Este proceso conduce a la generación de partículas subvíricas, los complejos de retrotranscripción (RTC), en los que la retrotranscripción es incompleta, y los complejos preintegración (PIC), que son los complejos competentes para integrarse (21). Si la célula no es activada, los RTC son degradados en un breve plazo de tiempo por las ADNasas celulares; este compartimiento de ADN proviral supone el 90% del total y constituye un reservorio susceptible de integración si la célula es activada (22). Los PIC contienen transcriptasa inversa, proteasa, integrasa y Vpr; en cambio, la presencia de proteínas estructurales es más controvertida (23). Estudios recientes revelan que las proteínas de la nucleocápside y la matriz se pierden en el proceso de disolución (24). Por el contrario, otras proteínas celulares se acoplan a los PIC en su tránsito hacia el núcleo (23). La transcriptasa inversa es incapaz de corregir las incorporaciones incorrectas de nucleótidos durante la síntesis de ADN, lo cual provoca la aparición de errores de transcripción con tasas de error estimadas de 10 -5 a 10-4 incorporaciones incorrectas por nucleótido copiado. Esto le confiere al VIH una de sus características más determinantes, su elevada variabilidad genética. Entrada en el núcleo Los PIC se transportan hasta la cubierta celular y se trasladan al interior del nucleoplasma, donde la doble cadena de ADN proviral se integra dentro del genoma de la célula huésped. Una célula infectada puede integrar entre 1 y 30 copias de ADN proviral. En el genoma celular existen unas regiones en las que la integración parece más frecuente, y corresponden a genes que se expresan tanto en linfocitos en reposo como activados (1). El transporte se realiza a través de un mecanismo que implica al gen Vif, el cual tiene la capacidad de asociarse a la vimentina, que forma parte de unos filamentos intermediarios que unen la membrana celular y nuclear (25). Vif actúa como conector entre los PIC y las moléculas motoras del microtúbulo para el transporte activo hacia el núcleo (26). Los PIC de la mayoría de retrovirus son incapaces de atravesar la membrana nuclear intacta y deben esperar hasta su ruptura durante la mitosis (27). En cambio, los PIC del VIH son capaces de atravesar de forma activa la membrana nuclear (28). El PIC se ancla en la membrana nuclear dirigido por la proteína accesoria Vpr (29), y entra en el núcleo a través del complejo nucleoporina (NPC) mediante un transporte activo que incluye la interacción de las regiones de localización nuclear (NLS) en los componentes del PIC y los receptores nucleocitoplásmicos conocidos como importinas (23): importina alfa e importina beta (29). El PIC tiene cuatro componentes (matriz, Vpr, integrasa y flap central del ADN), que pueden desempeñar un papel significativo en la entrada nuclear del VIH, aunque la función exacta de cada uno no esta aún totalmente aclarada. A pesar de las controversias, la entrada es un proceso complejo y sus bases moleculares pueden diferir dependiendo del tipo de célula y las condiciones de infección (23). La matriz contiene una NLS en la región N-terminal (necesaria para la replicación en células en reposo) y una segunda NLS en la región C-terminal (30). Se ha visto que Vpr puede unir el PIC al núcleo a través de una vía independiente de importinas o modificar la maquinaria celular dependiente de las importinas (esto se basa en la capacidad in vitro de Vpr de entrar en el núcleo en ausencia de factores solubles de entrada) y que puede unirse directamente a las nucleoporinas (23). Se ha visto que situaciones que reducen la unión de la integrasa al ADNc provocan una acusada reducción de la infectividad vírica, probablemente por la afectación de la entrada del ADNc que precede a la integración (31). Se cree que el flap central del ADN fuerza al ADN a adoptar una conformación que facilita el paso a través de los poros nucleares; asimismo, puede interactuar con proteínas celulares como las importinas o componentes del NPC (23). Integración Después de la entrada del PIC dentro del núcleo, la integrasa cataliza la inserción del ADNc proviral en el ADN de la célula huésped. Aún se conocen poco las bases moleculares de la selección de los puntos de inserción; sin embargo, gracias a la secuenciación completa del genoma humano, estudios recientes han proporcionado una visión global sobre las preferencias de integración del VIH, revelando que la integración tiene lugar preferentemente en genes con alta trascripción, especificidad que puede favorecer una expresión genética más eficiente del VIH, maximizando la propagación vírica (32). Las preferencias regionales a lo largo del genoma celular sugieren la existencia de un mecanismo de enlace entre los componentes del PIC, entre ellos la propia integrasa y elementos celulares como el desarrollo del ectodermo embrionario (embryonic ectoderm development, EED) (33) y el factor de crecimiento derivado del epitelio del cristalino (LEDGF/p75) (34), que dirigen a los PIC hacia su destino final. Al estudiar la integración del VIH en células mermadas de LEDGF/p75, se vio que había menos integración en las unidades de transcripción y en los genes regulados por LEDGF/p75, aunque no una inhibición total, lo que sugiere la existencia de otros factores adicionales (35). Cada integrasa contiene tres puntos catalíticos con tres aminoácidos esenciales (Asp 64, Asp 116 y Glu 151), los cuales coordinan uno o dos cationes divalentes (Mg2+ o Mn2+) que forman un puente con los sustratos de ADNA (36). A continuación se produce una eliminación endonucleolítica específica de un nucleótido del extremo 3’ de cada LTR y, seguidamente, una reacción de cambio de cadena que une de forma covalente los extremos 3’ recesivos del ADN viral a los extremos 5’ del ADN diana (37). El ADN no integrado se degrada por parte de las ADNasas celulares en un período de 5 a 15 días. Transcripción A partir de la integración, el VIH puede permanecer latente, replicarse de forma controlada o replicarse de forma masiva, con el consiguiente efecto citopático en la célula infectada. El inicio de la transcripción depende de factores celulares y se produce en ausencia de proteínas víricas (1). El principal factor celular implicado en el paso de la fase de latencia a la de reactivación en respuesta a factores mitógenos es el factor nuclear kappa B (NF-B). Éste no se encuentra de forma activa en los linfocitos CD4 en estado de reposo y se genera únicamente en los procesos de activación inmunológica. Esto explica que la replicación del VIH dependa de forma absoluta de la activación de los linfocitos infectados (38). La LTR es el centro de control para la expresión genética del VIH. Posee tres regiones U3, R y U5 en ambos extremos de la doble cadena de ADN proviral. La región U3 se subdivide en tres elementos: promotor o core, región de intensificación y región moduladora. El promotor contiene la TATA box y Sp1, ambos necesarios para el inicio de la transcripción. La región de intensificación posee elementos de unión para NF-B, involucrado en una amplia variedad de procesos celulares. La región moduladora contiene locus de unión para numerosos factores celulares: la proteína de unión a elementos de respuesta a AMP cíclico (CREB), el factor de intensificación de linfocitos (LEF-1), el factor nuclear de células T activadas (NF-AT) y receptores de hormonas nucleares; además, se cree que esta región contiene un elemento regulador negativo (NRE), ya que las deleciones en este punto incrementan la transcripción y la replicación vírica (39). La región R contiene el elemento responsable de la transactivación (TAR), el cual se une a la proteína vírica Tat, que es esencial para la producción de provirus viables; Tat también recluta de la LTR vírica diversos factores de transcripción que modifican la conformación de la cromatina en el locus de integración vírica (39). La región U5 contiene locus de unión para factores celulares de transcripción como AP-1, de tipo AP3, y Sp1 que son importantes para la capacidad infectiva del virus (40). La síntesis de un ARN mensajero maduro y funcional del VIH se realiza mediante la ARN polimerasa II (ARNPII). Este proceso se desarrolla en cinco fases: preiniciación, iniciación, aclarado del promotor, elongación y finalización. La ARNPII se preinicia en el promotor, donde interactúa con el ADN y con factores generales de transcripción y forma el complejo de preiniciación. Una vez completado, se le añade ATP, lo cual provoca la separación de las cadenas de ADN desde la posición -9 a la +2; esto constituye la transición hacia el complejo de iniciación. Después de sintetizarse los primeros 57 nucleótidos, éstos forman una estructura, la denominada TAR. Entonces, se pasa de la fase de inicio a la fase de aclarado del promotor, en la cual la ARNPII abandona el promotor basal, facilitando la entrada de una nueva polimerasa para formar un nuevo complejo de preiniciación (41). La actividad de elongación de la ARNPII se controla mediante la fosforilación de un heptapéptido localizado en el dominio carboxiterminal (DCT), modificando la conformación de la ARNPII, que pierde los factores negativos de elongación y gana factores positivos (42). Al final de este proceso, la ARNPII se ha elongado a lo largo del ADN y se libera la plantilla de ADN que está lista para empezar una nueva ronda de transcripción. La transcripción del provirus genera un ARN de longitud completa que funciona como ARN mensajero y como ARN genómico. A pesar de la importancia de los factores celulares para la transcripción, la mayoría finalizaría prematuramente, produciendo moléculas cortas de ARN. Para que esto no suceda se requiere la presencia de la proteína vírica Tat, que desempeña un papel clave en el control del proceso de transcripción, ya que lo potencia, incrementando hasta 100 veces la producción de ARN mensajero viral, y previene la terminación prematura de la transcripción del complejo de elongación. Tat se une directamente a la ciclina T1 (CycT1), proteína asociada a la ciclina T dependiente de cinasa 9 (CDK9) (42). Tat también se une a TAR a través del dominio IV o dominio de unión a TAR, y lleva consigo el complejo CycT1-CDK9, acercándolo a la ARNPII, poniendo la CDK9 junto al DCT y provocando la hiperfosforilación de este dominio crítico, paso necesario para el cambio de conformación de la ARNPII (43). Tat puede aumentar también la transcripción mediante interacciones con otros componentes del complejo del ARNPII, reclutando, por ejemplo, otras cinasas para fosforilar DCT, o inhibiendo la actividad fosfatasa del DCT para regular la desfosforilación. Tat puede aumentar el acceso de ARNPII a LTR por la acetilación de las proteínas de histona, que protegen al ADN proviral integrado en el nucleoplasma, a través de la histona acetiltransferasa (42). Además de Tat, intervienen otras proteínas víricas: Rev, Nef y Vpr. La proteína Rev, de localización preferentemente nuclear, interviene en el transporte del ARN sintetizado al citoplasma y en su procesamiento en ARN de distintos tamaños. Rev se une de manera específica a una estructura de ARN llamada elemento de respuesta a Rev (ERR), localizado en el gen Env. Nef contiene una RLN y una secuencia rica en leucina que actúa como señal de exportación nuclear (SEN), la cual permite que Rev se asocie a los mecanismos de exportación del núcleo, como la proteína Crm1. La proteína Rev emplea la vía de la Crm1 para trasladar el complejo Rev/ERR al citoplasma (44), en una unión mediada por la Ran-GTP, una GTPasa celular, una vez el factor Ran BP1 en el citoplasma cataliza la desunión del complejo Rev/ERR/RanGTP (26). La unión Rev/ERR incrementa, asimismo, la producción de ARN mensajero de tamaño completo o con un único sitio de unión. Estos ARN sirven para codificar las proteínas estructurales y los de tamaño completo sirven, además, como genoma viral. La Vpr activa la transcripción al interactuar con el factor de transcripción II D y con Sp1 en el promotor basal. Traducción Después de su síntesis, las proteínas víricas deben ser procesadas antes de ensamblarse en lo que serán las partículas maduras. En este proceso participan diversas proteínas y proteasas víricas, así como una proteasa celular que interviene en la traducción del Env. Las proteínas del Env gp120 y gp41 se sintetizan como una poliproteína precursora, la gp160, a partir de un ARN subgenómico, la cual es glucosilada en el retículo endoplásmico; se forma una estructura trimérica que contiene tres subunidades de gp120 y tres de gp41 asociadas de forma no covalente. La secuencia del Env que participa en este proceso parece estar contenida por completo en la secuencia transmembrana que corresponde a la gp41. La glucosilación es esencial para un correcto plegamiento de la proteína. En el aparato de Golgi tiene lugar la ruptura del precursor gp160 en las dos subunidades individuales, gp120 y gp41, por la acción de una proteasa celular (45). En el momento en que se ha completado la oligomerización, la poliproteína ya es competente para la interacción con el receptor CD4. Esta interacción puede inhibir el transporte del complejo a la membrana celular para la fase de ensamblaje. El VIH posee una proteína accesoria, Vpu, que se traduce junto con las proteínas de la cubierta a partir de un ARN mensajero común y que produce la degradación de la molécula CD4 y, posiblemente, de otras proteínas transmembrana desde el retículo endoplásmico. Aunque el Env no está directamente implicado en la degradación, actúa reteniendo la molécula CD4 en el retículo endoplásmico (26). Las proteínas estructurales y las enzimas que componen el core se traducen a partir de dos poliproteínas precursoras, Gag y Gag-Pol, sintetizadas en el retículo endoplásmico a partir del ARN genómico. Durante el proceso de replicación, se requiere un mayor número de moléculas derivadas de Gag que de las derivadas de Pol. Ambas se solapan en la posición 3’-terminal de Gag y en la posición 5’-terminal de Pol. La lectura de la estructura de Pol se realiza en relación a la de Gag mediante un mecanismo de salto ribosómico que hace que se sintetice una molécula de Gag-Pol por cada 20 moléculas de Gag (46). Gag codifica las proteínas estructurales asociadas al core vírico: la proteína matriz que reviste la cara interna de la membrana vírica, la proteína de la cápside que construye la partícula del core en forma de cono, la proteína de la nucleocápside que interactúa con la cadena simple de ARN genómico viral y la p6, una proteína que interviene en la incorporación de la proteína Vpr y en las fases finales de la liberación del virión naciente de la membrana celular. El gen Pol codifica varias enzimas víricas, entre ellas la transcriptasa inversa, la integrasa y la proteasa (46). Estos precursores se trasladan en ribosomas libres por el citoplasma hacia la membrana, donde se unen unos con otros e interactúan con la glucoproteínas del Env a través de una serie de procesos de ensamblaje dirigidos por Gag. Acoplamiento La formación de partículas VIH infecciosas y su liberación de las células infectadas es un proceso complejo que requiere no sólo el procesamiento y la expresión coordinada de las proteínas precursoras de Gag, Pol y Env, sino que también depende de la actividad de varias proteínas accesorias del VIH como Vif, Nef y Vpu (26). Gag es la proteína estructural fundamental, interviene en una serie de complejas interacciones consigo misma y con otros factores víricos y celulares para conseguir el ensamblaje de viriones infecciosos (47). El acoplamiento se desarrolla en varias fases: la interacción del precursor con la membrana celular, la interacción de los precursores entre sí y la emergencia del virión en la superficie celular. Cada uno de estos pasos se ha relacionado con un dominio específico de Gag. El dominio de interacción con la membrana (dominio M) está formado por las primeras secuencias de la proteína matriz y el ácido mirístico, que está añadido a la glicina Nterminal, estabiliza la unión del precursor a la membrana por la interacción con los fosfolípidos de ésta (48). El dominio de interacción (dominio I) se encuentra en dos regiones discontinuas de la porción C-terminal de la proteína de la cápside e interviene en las interacciones Gag-Gag que forman agregados proteicos cilíndricos (49); recibe ayuda del ARN, necesario para la multimerización de Gag (50). El dominio tardío (dominio L) está situado en la porción terminal de la secuencia p6, contiene una secuencia rica en prolina (Pro-Tir-Ala-Pro; PTAP) en la región N-terminal y estimula la separación final de la superficie celular de los viriones ya formados (51). Otro dominio importante de Gag es el péptido p2, que se halla en la posición C-terminal de la proteína de la cápside; los cambios en esta región disminuyen la liberación de partículas y producen virus defectivos no infecciosos (49). Para su transporte hasta la membrana, el precursor Gag se une a la actina celular (52). El virión aparece en diferentes zonas de la membrana, distribuido de manera no uniforme, lo que hace suponer que existen interacciones específicas entre Gag y Env que dirigen la formación de partículas hacia puntos específicos de la membrana plasmática. La composición fosfolipídica de la membrana vírica tiene una relación colesterol/fosfolípido 2,5 veces superior a la de la membrana de la célula infectada (53). Esto respalda la existencia de un mecanismo que dirige los precursores hacia regiones de la membrana ricas en estos componentes llamadas “balsas de lípidos” (lipid rafts). Se ha visto que al realizar una depleción de colesterol en las células infectadas, las partículas de VIH que se producen pierden más del 90% de capacidad infecciosa, la cual se recupera con la reposición del colesterol (54). Que el acoplamiento y la aparición del virus tengan lugar en una determinada localización de la membrana hace que determinadas proteínas celulares se incorporen a la superficie de las partículas víricas. Durante el acoplamiento, Gag-Pol se incorpora a través de interacciones con moléculas de Gag. El ARN y la membrana celulares intervienen en la formación y estabilización de los complejos Gag/Gag-Pol en las células infectadas (50). La partícula vírica que emerge de este proceso mide unos 80-100 nM de diámetro, contiene dos copias idénticas de ARN genómico viral, varias moléculas de ARNt, la proteína de la nucleocápside, transcriptasa inversa, integrasa, proteasa y las proteínas accesorias del VIH en una estructura densa en forma de cono denominada core (49). El VIH surge de la superficie celular en un proceso en el que participa parte de la membrana celular para recubrir la partícula vírica madura. Asociadas a la membrana se encuentran las proteínas de la cubierta vírica gp41 y gp120 (46). Salida de la célula y maduración La liberación de la partícula vírica desde la célula huésped requiere la fisión de la membrana, la cual no parece ligada a ninguna proteína vírica, por lo que debe de estar implicado un componente celular. La proteína celular tumoral humana susceptible al gen 101 (TGS101), que se une a la secuencia PTAP de la p6, parece intervenir en la liberación del virus recién formado. Las mutaciones en la secuencia PATP bloquean el proceso de fisión, y las modificaciones en la expresión de TGS101 bloquean la liberación del virión, y su restitución la restaura (55). La molécula CD4 de la superficie celular puede unirse a la gp120 recién sintetizada y hacer que se reinfecte de forma no productiva la misma célula. Para evitar que esto suceda, debe producirse una reducción en el número de moléculas CD4 presentes en la membrana plasmática; Nef, Env y Vpu están involucradas en este proceso. La proteína Nef aumenta el índice de endocitosis y la subsiguiente degradación de las moléculas CD4, así como las moléculas de MHC de tipo I y II localizadas en la superficie celular. En estadios más avanzados, el precursor de la envuelta gp160 atrapa las moléculas CD4 sintetizadas de novo en el retículo endoplásmico y Vpu induce su degradación y libera las moléculas de gp160, permitiendo su maduración (56). Vpu forma, además, poros de conducción iónica que favorecen la liberación del virus (57). La partícula vírica liberada contiene una cápside inmadura que experimenta una dramática maduración morfológica mediada por la proteasa vírica, que realiza múltiples fragmentaciones del precursor de las poliproteínas Gag y Gag-Pol, permitiendo la liberación de sus componentes para reensamblarse y formar el core del virión maduro (47). El proceso de fragmentación es ordenado y se rige por diferencias en el índice de procesamiento inherente a cada punto de fragmentación. Este proceso ordenado sugiere que es necesaria una cascada organizada de fragmentaciones para una correcta maduración del virión (58). Una mínima inhibición de la proteasa produce un intenso déficit en la infectividad del virus. La proteasa es sólo parcialmente activa en la forma precursora; su activación prematura dentro de la célula huésped provocaría la liberación temprana de los componentes de los precursores, lo cual impediría su correcto acoplamiento. No se conoce totalmente el mecanismo de control de la actividad autocatalítica de la proteasa que impide su activación temprana. Parece ser que la dimerización de la proteasa vírica actúa como desencadenante del proceso autocatalítico (45). Bibliografía 1. Alcamí, J., Bermejo, M., García, J y cols. Inmunopatología del sida. En: Gatell, J.M., Clotet, B., Podzamczer, D., Miró, J.M., Mallotas, J. (Eds.). Guía práctica del SIDA, clínica, diagnóstico y tratamiento. Elsevier Doyma S.L., Barcelona 2007; 2147. 2. Van Kooyk, Y., Geijtenbeek, T.B. DC-SIGN: Escape mechanism for pathogens. Nat Rev Immunol 2003; 3: 697-709. 3. Al-Harthi, L., Landay, A. Alternative targets of productive HIV infection: Role of CD4 up-regulation on susceptibility of cells to HIV infection. AIDS Rev 2001; 3: 67-74. 4. Kitchen, S., Korin, Y., Roth, M., Landay, A., Zack, J. Costimulation of naive CD8(+) lymphocytes induces CD4 expression and allows human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol 1998; 72: 9054-9060. 5. Weller, P., Marshall, W., Lucey, D. y cols. Infection, apoptosis and killing of mature human eosinophils by human immunodeficiency virus-1. Am J Respir Cell Mol Biol 1995; 13: 610-620. 6. Beaudoin, A., Grondin, G. Shedding of vesicular material from the cell surface of eukaryotic cells: Different cellular phenomena. Biochim Biophys Acta 1991; 1071: 203-219. 7. Mack, M., Kleinschmidt, A., Bruhl, H. y cols. Transfer of the chemokine receptor CCR5 between cells by membrane-derived microparticles: A mechanism for cellular immunodeficiency virus 1 infection. Nat Med 2000; 6: 769-775. 8. Nelson, M., Fätkenheuer, G., Konourina, I. y cols. Efficacy and safety of maraviroc plus optimized background therapy in viremia, ART-experienced patients infected with CCR5-tropic HIV-1 in Europe, Australia and North America: 24 weeks results. 14th CROI (25-28 febrero, Los Angeles) 2007; Abst. 104aLB. 9. Lalerazi, J., Goodrich, J., DeJesus, E. Y cols. Efficacy and safety of maraviroc plus optimized background therapy in viremia, ART-experienced patients infected with CCR5-tropic HIV-1: 24 weeks results of a phase 2b/3 study in the US and Canada. 14th CROI (25-28 febrero, Los Angeles) 2007; Abst. 104bLB. 10. Demarest, J., Bonny, T., Vavro, C. y cols. HIV-1 coreceptor tropism in treatment naive and experienced subjects. 44th ICAAC (30 octubre-2 noviembre, Washington D.C.) 2004; Abst. H-1136. 11. Agace, W.W., Amara, A., Roberts, A. y cols. Constitutive expression of stromal derived factor-1 by mucosal epithelia and its role in HIV transmission and propagation. Curr Biol 2000; 10: 325-328. 12. Wilkin, T., Su, Z., Kuritzkes, D. y cols. Co-receptor tropism in patients screening for ACTG 5211, a phase 2 study of vicriviroc, a CCR5 inhibitor. 13th CROI (5-8 febrero, Denver) 2006; Abst 655. 13. Samson, M., Libert, F., Doranz, B.J. y cols. Resistance to HIV-1 infection in Caucasian individuals bearing mutant alleles of the CCR5 chemokine receptor gene. Nature 1996; 382: 722-725. 14. Dietrich, U. HIV entry inhibitors. AIDS Rev 2001; 3: 89-97. 15. Esté, J. HIV resistance to entry inhibitors. AIDS Rev 2001; 3: 121-132. 16. Choe, H., Farzan, M., Sun, Y. y cols. The beta-chemokine receptors CCR3 and CCR5 facilitate infection by primary HIV isolates. Cell 1996; 85: 1135-1148. 17. Lanman, J., Lam, T., Barnes, S. y cols. Identification of novel interactions in HIV-1 capsid protein assembly by high-resolution mass spectrometry. J Mol Biol 2003; 325: 759-772. 18. Golf, S. Intracellular trafficking of retroviral genomes during the early phase of infection: Viral exploitation of cellular pathways. J Gene Med 2001; 3: 517-528. 19. Litvak, S., Sarih-Cottin, L., Fournier, M., Andreola, M., Tarrago-Litvak, L. Priming of HIV replication by tRNA(Lys3): role of reverse transcription. Trends Biochem Sci 1994; 19: 114-118. 20. Stark, L., Hay, R. Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) viral protein R (Vpr) interacts with Lys-tRNA synthetase: Implications for priming of HIV-1 reverse transcription. J Virol 1998; 72: 3037-3044. 21. McDonald, D., Vodicka, M., Lucero, G. y cols. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. J Cell Biol 2002; 159: 441-452. 22. Pierson, T.C., Zhou, Y., Kiefler, T. y cols. Molecular characterization of preintegration latency in HIV infection. J Virol 2002; 76: 8518-8531. 23. Lehman-Che, J., Saïb, A. Early Stages of HIV replication: How to hijack cellular functions for a successful infection. AIDS Rev 2004; 6: 199-207. 24. Fassati, A., Golf, S. Characterization of intracellular reverse transcription complexes of HIV type 1. J Virol 2001; 75: 3626-3635. 25. Karczewski, M., Strebel, K. Cytoskeletal association and virion incorporation of the human immunodeficiency virus type 1 Vif protein. J Virol 1996; 70: 494-507. 26. Strebel, K., Bour, S. Molecular interactions of HIV with host factors. AIDS 1999; 13(Supl. A): S13-S24. 27. Lewis, P., Emerman, M. Pasaje through mitosis is required for oncoretrovirus but not for the human immunodeficiency virus. J Virol 1994; 68: 510-516. 28. Bukrinsky, M., Sharova, N. Dempsey, M. y cols. Active nuclear import of HIV type 1 preintegration complexes. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89: 6580-6584. 29. Popov, S., Rexach, M., Zybarth, G. y cols. Viral protein R regulates nuclear import of the HIV-1 preintegration complex. EMBO J 1998; 17: 909-917. 30. Haffar, O., Popov, S., Dubrovsky, L. y cols. Two nuclear localization signals in the HIV-1 matrix protein regulate nuclear import of the HIV-1 pre-integration complex. J Mol Biol 2000; 229: 359-368. 31. Ikeda, T., Nishitsuji, H., Zhou, X. y cols. Evaluation of the functional involvement of HIV type 1 integrase in nuclear import of viral cDNA during acute infection. J Virol 2004; 78: 11563-11573. 32. Schroeder, A., Shinn, P., Chen, H. y cols. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell 2002; 110: 521-529. 33. Violot, S., Hong, S., Rakotobe, D. y cols. The human Polycomb group EED protein interacts with the integrase of HIV type 1. J Virol 2003; 77: 12507-12522. 34. Cherepanov, P., Devroe, E., Silver, P. y cols. Identification of an evolutionaryconserved domain in LEDGF/p75 that binds HIV-1 integrase. J Biol Chem 2004; 279: 33416-33445. 35. Ciuffi, A., Llano, M., Poeschla, E. y cols. A role of LEDGF/p75 in targeting HIV DNA integration. Nature Medicine 2005; 11: 1287-1289. 36. Semenova, E., Jonson, A., Marchand, C., Pommier, Y. Integration of human immunodeficiency virus as a target for antirretroviral therapy. Curr Opin HIV AIDS 2006; 1: 380-387. 37. Asante, E., Skalka, A. HIV-1 integrase: Structural organization, conformational changes, and catalysis. Adv Virus Res 1999; 52: 351-369. 38. Baeuerle, P., Baltimore, D. NF-kB: Ten years after. Cell 1996; 87: 13-20. 39. Ramírez de Arellano, E., Soriano, V., Alcamí, J., Holguín, A. New findings of transcription regulation across different HIV-1 subtypes. AIDS Rev 2006; 8: 9-16. 40. Van Lint, C., Amella, C., Emilia, S. y cols. Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity. J Virol 1997; 71: 6113-6127. 41. Daelemans, D., De Clerq, E., Vandamme, A. Control of RNA initiation and elongation at the HIV promoter. AIDS Rev 2000; 2: 229-240. 42. Liang, C., Wainberg, M. The role of Tat in HIV-1 replication: An activator and/or a suppressor? AIDS Rev 2002; 4: 41-49. 43. Garber, M., Jones, K. HIV-1 Tat: Coping with negative elongation factors. Curr Opin Immunol 1999; 11: 460-465. 44. Fukuda, M., Asano, S., Nakamura, T. y cols. Crm1 is responsible for intracellular transport mediated by the nuclear export signal. Nature 1997; 390: 308-311. 45. Rodés, B., Holguín, A. Retrovirus humanos y subtipos del VIH. En: Soriano, V., González-Lahoz, J. (Eds.). Manual de SIDA. Permanyer, Barcelona 2007; 1-19. 46. Kaplan, A. Asembly of the HIV-1 core particle. AIDS Rev 2002; 4: 104-111. 47. Salzwedel, K., Martin, D.E., Sakalian, M. Maturation inhibitors: A new therapeutic class targets the virus structure. AIDS Rev 2007; 9: 162-172. 48. Hill, C., Worthylake, D., Bancroft, D., Christensen, A., Sundquist, W. Crystal structures of the trimeric human immunodeficiency virus type 1 matrix protein: Implications for membrane association and assembly. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 3099-3104. 49. Granier, L., Bowzard, J., Wills, J. Recent advances and remaining problems in HIV assembly. AIDS 1988; 12(Supl. A): S5-S16. 50. Halwani, R., Khorchid, A., Kleiman, L. Cellular distribution of Gag/Gag-Pol complexes in HIV-1 infected cells and the role of RNA and high density lipid rafts “barges” in their assembly and stabilization. XIV AIDS Int Conf (7-12 julio, Barcelona) 2002; Abst. TuPeA4380. 51. Huang, M., Orenstein, J., Martin, M., Freed, E. Gag p6 is required for particle production from full-length human immunodeficiency virus type 1 molecular clones expressing protease. J Virol 1995; 69: 6810-6818. 52. Rey, O., Canon, J., Krogstad, P. HIV-1 Gag protein associates with F-actin present in microfilaments. Virology 1996; 220: 530-534. 53. Aloia, R., Tian, H., Jensen, F. Lipid composition and fluidity of the human immunodeficiency virus type 1 envelope and the host cell plasma membrane. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 99: 5181-5185. 54. Liao, Z., Hildreth, E. Lipid rafts and HIV biology: Cholesterol is required for HIV-1 infection. 8th CROI (4-8 febrero, Chicago) 2001; Abst. A531. 55. Demirov, D., Ono, A., Orenstein, J., Freed, E. Overexpression of the N-terminal domain of Tsg101 inhibits HIV-1 budding by blocking late domain function. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99: 955-960. 56. Sierra, S., Kupfer, B., Kaiser, R. Basics of the virology of HIV-1 and its replication. J Clin Virol 2005; 34: 233-244. 57. Schubert, U., Ferrer-Montiel, A.V., Oblatt-Montal, M. y cols. Identification o fan ion channel activity of the Vpu transmembrane domain and its involvement in the regulation of virus release from HIV-1 infected cells. FEBS Lett 1996; 398: 12-18. 58. Petit, S., Clemente, J., Jeung, J. y cols. Ordered processing of the HIV-1 Gag-Pol precursor is influenced by the context of the embedded viral protease. J Virol 2005; 79: 10601-10607.