ENTEROCOCOS: procedimientos de aislamiento e identificación en el laboratorio ENTEROCOCOS: PROCEDIMIENTOS DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN EN EL LABORATORIO Loretta Durán Esther Damiani Christian Trigoso RESUMEN Los diferentes miembros del género Enterococcus han asumido un papel muy importante entre las causas de infecciones intrahospitalarias. El creciente número de infecciones causadas por dichos organismos y el progresivo desarrollo de resistencia antimicrobiana hacen que su precisa identificación hasta el nivel de especie y la determinación de su perfil de susceptibilidad antimicrobiana sean de alta importancia para el laboratorio de bacteriología. El presente estudio resume los procedimientos actualmente recomendados para el aislamiento, identificación y determinación de la susceptibilidad antimicrobiana de estos patógenos en laboratorios clínicos de bacteriología. Correspondencia: estherpaula@yahoo.es 295 Vigilancia, prevención y control de infecciones asociadas a servicios de salud INTRODUCCION Los enterococos son cocos Gram positivos que constituyen parte de la flora normal del intestino humano y de animales. La dos especies de este género que causan infecciones humanas con mayor frecuencia son Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium. (1) Inicialmente se los reconoció como patógenos de infecciones urinarias, bacteriemias y como causa infrecuente de endocarditis bacteriana subaguda. En los últimos 20 años los Enterococcus vienen adquiriendo una inusitada importancia hospitalaria, de hecho se los considera como la segunda causa más frecuente de infecciones del tracto urinario (ITU) y la tercera causa de bacteriemia nosocomial. También son causa de endocarditis bacteriana subaguda y de abscesos intraabdominales. La terapia antimicrobiana masiva y la capacidad intrínseca de resistir la acción bactericida de muchos antibióticos hacen posible la supervivencia de dichos microorganismos en el entorno hospitalario. Por si solos no presentan una alta virulencia ni capacidad de invasión de los tejidos, es por lo que las infecciones solo se producen en determinados puntos anatómicos. Los estreptococos fueron observados y descritos por primera vez a partir de sepsis puerperal (Pasteur) y en infecciones de heridas (Koch). La frecuencia y la importancia de las infecciones causadas por ellos fueron anotadas por Ogston, Fehleisen y Rosenbach a mediados de la década de 1880. Griffith (1928), estudiando la correlación de especificidad y patogenicidad de los neumococos, descubrió el fenómeno de transformación sirviendo de base para la demostración de Avery, Mc. Leod y Mc Carty (1994) de que los caracteres genéticos radicaban en el DNA. En la década de 1930 Lancefield diseñó un sistema de tipificación serológico en el que se clasificó a los enterococos como Streptococcus tipo D, incluyendo en el grupo al Streptococcus bovis. En 1937 Sherman clasificó a los estreptococos en los siguientes grupos: piógenos, lácticos, viridans y enterococos. Dicha clasificación se mantuvo hasta la década de 1980 cuando avances en taxonomía basados en el análisis del ácido nucleico mostraron que los enterococos ameritaban su designación como un género separado. De esta manera Streptococcus faecalis y S. faecium se convirtieron en Enterococcus faecalis y E. faecium, respectivamente. (2) Subsecuentemente se reclasificaron otras especies de estreptococos y se reconocieron nuevas especies dentro de 296 ENTEROCOCOS: procedimientos de aislamiento e identificación en el laboratorio este género. En el momento actual se reconocen más de 12 especies dentro del género, de las cuales pocas son patógenos humanos. Tradicionalmente, la mayoría de estas infecciones ha sido causada por E. faecalis. Sin embargo, en los últimos 15 años la incidencia de infecciones causadas por E. faecium, el cual es muchas veces multiresistente, ha aumentado en forma muy rápida. En los EE. UU. la distribución por especie entre las bacteriemias causadas por enterococos muestra los siguientes porcentajes: E. faecalis 60%, E. faecium 20%, E. rafinosus 2.0%, E. durans 0.5%, E. avium 0.5%, E. gallinarum 0.5%, E. casseliflavus y Enterococcus spp. 16%. Los laboratorios de bacteriología tradicionalmente utilizan las siguientes características para identificar a los enterococos: reacción bilis esculina positiva, reacción con anticuerpos del Grupo D positiva y habilidad de crecer en ClNa al 6.5%. Sin embargo pueden surgir algunas dificultades de interpretación utilizando dichas características. Por ejemplo, en algunas cepas es difícil identificar la reacción con el anticuerpo D. Los lactococos también pueden crecer en ClNa al 6.5% y/o ser bilis esculina positivos; sin embargo, los lactococos no crecen o crecen muy lentamente a temperatura de 45 °C. Existen dos otros géneros (Pediococcus y Leuconostoc) que comparten muchas de las características bioquímicas de los enterococos y que también producen antígenos del Grupo D y pueden crecer a temperatura de 45 °C. Dichos organismos son intrínsicamente resistentes a la vancomicina, lo cual permitía su separación de los enterococos antes de que surgieran las cepas de enterococos resistentes a la vancomicina (ERV). Actualmente, se separa dichos géneros de los ERV por la producción de pirrolidonilarilamidasa (PIR) y leucina aminopeptidasa (LAP). En dichos casos las reacciones típicas son las siguientes: +/+ para enterococos; +/- para Pediococos; y -/- para Leuconostoc. Este último también produce gas de la glucosa. (3) Previa la aparición de los ERV no se justificaba tratar de identificar a los enterococos en el laboratorio hasta el nivel de especie puesto que 90% de las infecciones eran causadas por E. faecalis, susceptible a la ampicilina. Dicho panorama ha cambiado drásticamente con el desarrollo de resistencia y sobre todo con la aparición de cepas resistentes a la vancomicina, la mayoría de las cuales son E. faecium pero también incluyen E. casseliflavus y E. gallinarum. Por esta razón en la práctica laboratorial actual es necesario poder identificar hasta el nivel de especie. Dicho nivel de especificación es útil al seleccionar antibióticos para infecciones severas puesto que existen diferencias en la susceptibilidad 297 Vigilancia, prevención y control de infecciones asociadas a servicios de salud antimicrobiana de las diferentes especies de enterococos. Igualmente es útil para detectar brotes de infecciones nosocomiales o para determinar si un mismo paciente con infecciones repetidas por enterococos sufre de relapsos de infección a causa de tratamiento no adecuado o de nuevas infecciones. Se diferencian las especies de enterococos por una serie de pruebas que incluyen la acidificación de carbohidratos, hidrólisis de la arginina, tolerancia a la telurita, motilidad y pigmentación. Por ejemplo, las cepas de E. faecalis característicamente toleran a la telurita y producen colonias de color negro. Las especies motiles incluyen a E. casseliflavus (E. flavescens) y E. gallinarum. E. casseliflavus y E. mundtii producen pigmento amarillo. La motilidad y la producción de pigmento son particularmente útiles en diferenciar E. gallinarum y E. casseliflavus de E. faecium aunque se reconoce que algunas cepas pueden mostrar reacciones atípicas. La identificación de los enterococos hasta el nivel de especies puede ser complicada a causa de las múltiples pruebas requeridas y la existencia de cepas con características fenotípicas atípicas. (4) Por estas razones, los laboratorios de referencia han utilizado pruebas de biología molecular para dicho propósito. (5-7) Desde el punto de vista práctico el mayor imperativo es poder identificar las cepas de E. faecalis y de E. faecium y de poder establecer sus perfiles de susceptibilidad. Es útil reconocer que las cepas de E. faecalis son susceptibles a la ampicilina y resistentes a la quinupristina-dalfopristina y las cepas de E. faecium son resistentes a la ampicilina y susceptibles a la quinupristina-dalfopristina. 298 ENTEROCOCOS: procedimientos de aislamiento e identificación en el laboratorio Flujograma para la identificación del género Enterococcus 299 300 α, β, γ α, β, γ - + + + + * + + * + - * - * Hemólisis Catalasa Cl Na 6,5% Bilis esculina Crecimiento a 45 ºC Hidrólisis Arginina Hidrólisis Piruvato Sorbitol Manitol Rafinosa Arabinosa + * + * + - - + + + + - E. faecium E. faecalis Prueba Bioquímica - - * - - + + + + + - α E. durans Tabla de interpretación de Pruebas Bioquímicas - +* + - - - - + - - α, γ S. bovis Vigilancia, prevención y control de infecciones asociadas a servicios de salud ENTEROCOCOS: procedimientos de aislamiento e identificación en el laboratorio TABLA2. CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS UTILIZADAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES DE ENTEROCOCCUS Y ALGUNAS ESPECIES RELACIONADAS DE COCOS GRAM POSITIVOS a Abreviaturas y símbolos MAN, manitol; Sor, sorbosa;ARG, arginina; ARA, arabinosa; SBL, sorbitol; RAF, rafinosa; TEL, 0.04% telurito; MOT, mobilidad; Pig, pigmento; SUC, sucrosa; PYU, piruvato; MPG, metil-o-Dglucopiranosido; +,90% o más de las cepas son positivas; -,10% o menos de las cepas son positivas; V variable(11 al 89% de las cepas son positivas). b Caraterísticas fenotípicas basadas en datos de la cepa tipo. c Las características fenotípicas de E. porcinus son idénticas a las de E. villorum. Estas dos especies recientemente descriptas corresponden a un solo taxon. d Existen excepciones (-3% de cepas que muestran reaccines aberrantes) 301 Vigilancia, prevención y control de infecciones asociadas a servicios de salud Bibliografía 1. Murray, BE.The life and times of the Enterococcus. Clin Microbiol Rev 1990; 3: 46. 2. 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