PCR convencional o PCR de punto final versus PCR en Tiempo Real PCR convencional no es cuantitativo S Lobos C - U de Chile 1 PCR clásico z z z La cantidad de producto no está relacionada con la cantidad de DNA inicial Herramienta cualitativa (presencia o ausencia) El bromuro de etidio es poco sensible, cuando se detecta ya se ha sobrepasado la fase exponencial 2 Fases de la PCR z z z Exponencial: En cada ciclo se dobla el producto. Lineal: enlentecimiento, enlentecimiento consumo de componentes componentes, principio de degradación. Meseta: Parada de la reacción, agotamiento de componentes, degradación de productos. 3 Fases de la PCR Logarítmica Lineal 4 Detección en la fase de meseta Problemas de cuantificación en la fase de meseta 5 Técnicas de cuantificación z Northern Blot 6 PCR Competitivo o PCR “Mimic” Early expression of p53 responsive genes (24h) Bax CD95/Fas GAPDH L C 6 8 10 12 M Martín-Burriel et al. (2004) 7 Necesidad de PCR en tiempo real N Necesidad id d d de cuantificar tifi dif diferencias i d de expresión de un mRNA (RT (RT--PCR) z Disponibilidad de muy pequeñas cantidades de mRNA en algunas g p prácticas laboratoriales:: laboratoriales z Células obtenidas de microdisección por láser z Pequeñas cantidades de tejido z Biopsias embrionarias z Especimenes de gran valor z 8 PCR en Tiempo Real Nuevos q químicos Nuevas plataformas instrumentales Detección de productos PCR en tiempo real Permite observar la cinética de la reacción 9 Detección en la fase exponencial 10 PCR en Tiempo Real Toma los datos mientras se producen. z Cuantificación más exacta sin necesidad de métodos laboriosos. z Existe E i t una relación l ió cuantitativa tit ti entre t la l cantidad inicial y la cantidad de producto PCR en un ciclo dado. z Curso PCR 2010 11 Polymerase chain reaction (PCR) 12 Polymerase chain reaction (PCR) 13 Polymerase chain reaction (PCR) 14 Fluorocromos:: SYBR Green Fluorocromos z z z Se intercala en el surco menor del ADN de doble cadena y emite fluorescencia. No es equimolecular equimolecular.. Necesaria curva de disociación. 15 Curva de disociación Tª Melting: - Composición de bases del fragmento g - Tamaño del fragmento. -Tm dimeros < Tm fragmento 16 Curva de disociación Muestras problema Controles negativos y sin RT 17 Ventajas e inconvenientes z PCR con SYBR G Green: Más barato z Los mismos reactivos sirven para analizar cualquier fragmento z La especificidad viene dada únicamente por los primers z No es equimolecular z Se necesita realizar una curva de disociación z 18 Sondas TaqMan z z z z z Actividad 5’ exonucleasa de la Taq polimerasa. Reporter:: FAM, VIC. Reporter Quencher:: TAMRA. Quencher Importante tªm (~70ºC). Equimolecular.. Equimolecular 19 Real Time PCR: Sonda TaqMan S Lobos C - U de Chile 20 Polymerase chain reaction (PCR) Fluorocromo + Quencher (absorbe la energía del fluorocromo cuando está cerca fluorocromo no fluoresce) 21 S Lobos C - U de Chile 22 Ventajas e inconvenientes z PCR con Sondas TaqMan: TaqMan: Más caro z Utilización de sondas específicas para cada fragmento a analizar z La especificidad viene dada por los primers y la sonda z Es equimolecular z No necesita curva de disociación z 23 Aplicaciones de la PCRPCR-TR z Cuantificación: Absoluta z Relativa z D t Determinación i ió d de mutaciones. t i z Ensayos ++- Diagnóstico z 24 Glosario de términos z C Cuantificación: tifi ió z Absoluta: z Resultado final con unidades (carga viral, copias de mensajero, copias de un gen,...). z Se S necesita it una curva patrón t ó absoluta. b l t z Relativa: z Resultado sin unidades. Proporciona un porcentaje de incremento o disminución (expresión génica). z Se necesita curva patrón (al menos para prueba de primers). primers). 25 Glosario de términos z Referencia: z Señal utilizada para normalizar el experimento. z z z Pasiva: Fluorocromo en todos los tubos (ROX). Activa: endógena ((housekeeping housekeeping)) o exógena (construcción). Calibrador: z Muestra q que usamos p para comparar p las demás. 26 Glosario de términos z Standard (patrón): z z Muestra de concentración conocida que nos permite construir la curva de calibrado. Threshold Th h ld (umbral): ( b l) z Ct es el ciclo en el cual se detecta un incremento significativo de ΔRn (fluorescencia). El sistema empieza a detectar la señal asociada al incremento exponencial de producto PCR (Fase exponencial) 27 Aplicaciones de la PCRPCR-TR Glosario de términos. z Cuantificación: z Absoluta z Relativa R l ti z Determinación de mutaciones. z Ensayos ++z 28 Métodos de cuantificación Curva estándar z Delta Ct z Método de Pfaffl z 29 Curva estándar 30 Curva estándar 31 Curva Patrón z z z z y=ax+b y= y ax+b.. Y ax+b Y=Ct Y= Ct,, X Ct X=log log [DNA] [DNA]. Relaciona cada concentración con su Ct. Propia de cada pareja de primers primers.. La pendiente depende de la eficiencia de los primers y no debería cambiar entre experimentos: z z z z 100% (a= (a=--3.32). 75% (a= (a=--4). Aceptable:--3 ≤ -4. Aceptable: a> -3 contaminación por fluorescencia. 32 Curva Patrón z Correlación ((R2)): z z z z z Nº de réplicas: z z z R2=1 (perfecta). R2≥0.97 (0.99). Seleccionar el umbral donde R2 sea máxima. Mantener el umbral entre experimentos. Al menos 2 réplicas por muestra. Desviación estándar ≤ 0.38 Muestra: z z Curva absoluta: muestra de [ conc conc]] conocida. Diluciones 1/5. 33 1. Cuantificación Absoluta z Validación de la curva patrón: p z z La precisión de la cuantificación dependerá de la precisión de los patrones. Patrones: z z z z z DNA plasmidial. plasmidial. DNA genómico. genómico Productos PCR. Grandes oligonucleótidos comerciales. Resultado final relativo a una unidad de interés: z z z z Copias/ng de RNA Copias/ng Copias/g tejido tejido, copias/ml sangre sangre. Copias/genoma. Copias/ célula. 34 1. Cuantificación Absoluta z Posibles curvas de calibrado (Expresión génica): z Productos de RTRT-PCR u oligonucleótidos: z z z DNA recombinante: z z z Rápido, conocimiento preciso de [DNA]. Inestable, problemas en la reamplificación. reamplificación. Muy estable, sin problemas de amplificación, talla similar a transcritos. Construcción del DNArec DNArec,, no tiene en cuenta la eficacia de la RT. RNA recombinante: z z Mimetiza la situación real de retrotranscripción (añadir RNA background background). ). Muy inestable, clonación complicado, purificación, problemas de almacenamiento. 35 1. Cuantificación Absoluta z P t críticos Puntos íti de d la l curva patrón: tó DNA o RNA puro y muy concentrado. z Exactitud en la medida de la concentración inicial (7 veces). z Pipeteo apropiado: dilución del DNA o RNA original hasta concentraciones similares a las muestras biológicas (106-1012). z Estabilidad de las muestras patrón (RNA). z Curso PCR 2010 36 2. Cuantificación Relativa z Curva patrón: Sencillez en la preparación. z La cantidad de producto (n veces) se refiere a la obtenida en el calibrador (1x) (1x). z No hay unidades. z Se puede utilizar cualquier tipo de patrón para la obtención. z Curso PCR 2010 37 2. Cuantificación Relativa z P t críticos Puntos íti de d la l curva patrón: tó Dilución adecuada del RNA o DNA patrón. z La utilización de las mismas muestras en placas distintas permite comparar resultados. z Se pueden utilizar patrones DNA para análisis de RNA. z Se necesitan curvas patrón para el gen de estudio y el control endógeno. z 38