XIX Verano de la Investigación Científica y Tecnológica del Pacífico CLONACIÓN DE PRODUCTOS DE PCR EN PLÁSMIDOS PARA GENERAR CURVA DE CUANTIFICACIÓN EN TIEMPO REAL Cecilia Guadalupe Aguirre Cossio, Alejandra Paola Martínez Camberos, Ingeniería en Bioctecnología, Universidad Politécnica de Sinaloa, bio112006@upsin.edu.mx. Asesor Dra. Noemí García Magallanes. Laboratorio de Genética, Ingeniería en Biotecnología, Universidad Politécnica de Sinaloa. ngarcia@upsin.edu.mx Planteamiento del problema La reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) en Tiempo Real, es una variación de la PCR estándar utilizada para la cuantificación de DNA o mRNA presente en una muestra. Comúnmente se utilizan dos estrategias de cuantificación; la relativa para obtener magnitud de cambios fisiológicos en niveles de expresión genética entre genes en comparación y la absoluta, la cual relaciona la señal obtenida con la técnica al número de copias de una secuencia estándar y de esta manera poder conocer el número de copias presente en la muestra problema. El propósito de este estudio es generar los estándares indispensables para realizar la cuantificación absoluta de diversos genes de interés. Metodología Protocolo de clonación de productos de PCR con pGEM-T Easy Vector System II de Promega. Ligación: Se realizó la reacción adicionando el producto de PCR a la mezcla de reacción para ligación (5 µL Buffer de ligación rápida 2X, 1 µL pGEM-T, 1 µL ADN ligasa T4, 10 µL agua des-ionizada), se mezcló por pipeteo y dejó incubar durante la noche a 4°C. Transformación de células competentes JM109 de alta eficiencia: Se preparan las placas LB/ampicilina/IPTG/X-Gal; se centrifuga la reacción de ligación y agregan 2 µL de mezcla a tubos en hielo con 1.5 µL de agua estéril. Se ponen las células JM109 en baño de hielo durante 5 min y mezclan cuidadosamente; se transfieren 50 µL de éstas a los tubos con la mezcla de ligación y agua, dejándose incubar en hielo durante 20 min. A continuación, se provoca choque térmico por 40-45 seg a 42°C y regresan al baño de hielo por 2 min. Se agregan 950 µL de medio SOC a temperatura ambiente a la mezcla en reacción e incuban por 1.5 hrs a 37°C en agitación a 150rpm. Se agregan 100 µL de cada cultivo transformado por duplicado en las placas LB/ampicilina/IPTG/XGal e incuba durante la noche a 37°C. Las colonias transformadas tienen coloración blanca. Posteriormente se seleccionan estas colonias para realizar la curva de cuantificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en Tiempo Real. Conclusiones Hasta la fecha se continúa trabajando en la clonación de los plásmidos por el método propuesto por Promega. Una vez terminada la clonación, se transformarán las células competentes JM109 de alta eficiencia para realizar la posterior cuantificación del vector recombinante por PCR de Tiempo Real. © Programa Interinstitucional para el Fortalecimiento de la Investigación y el Posgrado del Pacífico Agosto 2014