Validación del método de cuantificación de Carbonato de Calco en

Validación del método de cuantificación de Carbonato de Calco en el polvo de
SupleCal®
Validation of the method of quantifying calcium carbonate in the powder of
SupleCal®
Clara E. Becquer Romagoza1, Gisela Paredes Varela1, Iala Rodríguez Calero1,
Osmara Rodríguez Cristobol1 y Ana M. Sánchez Hechavarría1
1
Departamento de Gestión de la Calidad. Dirección de Química. Centro Nacional de
Investigaciones Científicas.
clara.becquer@cnic.edu.cu
1
Validación del método de cuantificación de Carbonato de Calco en el polvo de
SupleCal®
ABSTRACT
Introduction: The calcium is indispensable for the health of bones, teeth and muscles.
Many enzymes depend on calcium to function properly, and it is also important for the
functioning of the nervous system, heart and blood clotting. A new nutritional
supplement of calcium carbonate was developed starting from coral powders. For the
development of a new product, it is necessary to validate analytical methods to quantify
the active ingredient with a high degree of reliability. It was validated the technique
described in the USP 27 for controlling the quality of powder Suplecal® and ensure
reliability of the results. Materials and methods: We developed a new nutritional
supplement of calcium carbonate from coral powders. The SupleCal® powder is a
product obtained from the purification of the calcium carbonate variety aragonito that is
present in the exoskeletum of the marine corals and that has been sifted until obtaining
a particle size between 40 and 100 µm. The analytic method is based on the
determination of the active principle using for it the method of valuation for formation of
complex with solution of EDTA 0.05 mol/L and blue hidroxinaftol as indicator. Results
and disscusion: Parameters like linearity, precision and accuracy were determined.
The analytic method developed demonstrated to be lineal R=0.9985, precise
(CV=0.5%) and exact in the selected range of concentrations (160-240 mg).
Conclusions: The applicability of the analytic method is demonstrated in the
formulation designed for this product.
Keywords: Validation; SupleCal®; Calcium carbonate; Quantification method.
RESUMEN
Introducción: El calcio es indispensable para la salud de huesos, dientes y músculos.
Muchas enzimas dependen del calcio para funcionar adecuadamente, así como
también es importante para el funcionamiento del sistema nervioso, cardiaco y la
coagulación sanguínea. Para el desarrollo de un nuevo producto, es necesaria la
utilización de métodos analíticos validados que permitan cuantificar el principio activo
con un alto grado de confiabilidad. Se desarrolló un nuevo suplemento nutricional de
carbonato de calcio a partir del polvo de coral. El polvo para obtener el suplemento
nutricional SupleCal® es un producto obtenido de la purificación del carbonato de
calcio variedad aragonito presente en el exoesqueleto de los corales marinos Poritesporites. El objetivo de este trabajo fue la validación de la técnica descrita en la USP 27
para realizar el control de la calidad del polvo para SupleCal® y garantizar la
confiabilidad de los resultados. Materiales y métodos: S tamizo el polvo hasta
obtener un tamaño de partícula entre 40 y 100 µm. El método analítico se basa en la
determinación del principio activo empleando para ello el método de valoración por
formación de complejo con solución de EDTA 0.05 mol/L e hidroxinaftol azul como
indicador. Resultados y discusión: Fueron determinados parámetros como
linealidad, precisión y exactitud. El método analítico desarrollado demostró ser lineal
R=0,9985 preciso (CV=0.5%) y exacto en el rango de concentraciones seleccionado
(160-240 mg). Conclusiones: Se demostró la aplicabilidad del método analítico en la
formulación diseñada para este producto.
Palabras claves:
cuantificación.
Validación;
SupleCal®;
carbonato
de
calcio;
método
de
2
INTRODUCCIÓN
La validación es la confirmación mediante el suministro de evidencias objetivas que se
han cumplido los requisitos para una utilización o aplicación específica prevista.
Proporciona un alto grado de confianza y seguridad del método analítico y se realiza
con carácter obligatorio cuando se desarrolla un nuevo procedimiento, ya que permite
asegurar que el método propuesto cumple su objetivo de Buenas Prácticas de
Producción (1).
Las normas de Buenas Prácticas de Fabricación y Control de la Calidad plantean que
la validación debe aplicarse tanto a los procesos de fabricación como a los métodos
analíticos (2).
Es necesario señalar que los métodos descritos en farmacopeas u otros textos
oficiales se consideran validados, pero es necesario adecuarlos a las condiciones
reales de trabajo (3). La validación interna de un método es el proceso de verificar,
dentro de un laboratorio, que un método previamente validado en otro ámbito conduce
a resultados fiables (4).
El carbonato de calcio, presente como componente fundamental en el polvo del
Suplecal®, es una sal inorgánica adquirida de una fuente natural, los corales marinos
variedad aragonito. El calcio, es un mineral abundante e importante en el cuerpo
humano, niveles adecuados del mismo, garantizan un óptimo funcionamiento del
organismo. Este producto es indispensable para la salud de los huesos, dientes y
músculos, para el buen funcionamiento del sistema nervioso, el tratamiento de la
osteoporosis, depresión, etc. Algunas causas de cáncer, pueden deberse a
deficiencia de minerales, incluyendo el calcio (5,6). El la USP 27 se reporta el método
de ensayo aplicado a la materia prima carbonato de calcio (CaCO3) de la variedad
calcita.
El objetivo del presente trabajo es la validación interna del método analítico reportado
en la USP 27 para la determinación del contenido de CaCO3 variedad aragonito en el
polvo de SupleCal.
MATERIALES Y METODOS
Equipos
Balanza analítica Sartorius (±0,0001g) y estufa marca HS 32A
Reactivos
Se utilizó una disolución de EDTA como agente valorante, a una concentración de
0,05N; como indicador el hidroxinaftol azul y como patrón de referencia CaCO3
reactivo MERCK con certificado de calidad. El HCl concentrado se empleó en la
disolución de las muestras y el NaOH IN para garantizar el medio básico en la
valoración. Todos estos reactivos utilizados fueron de calidad puro para análisis.
PARTE EXPERIMENTAL
Linealidad: Se analizaron tres curvas patrones en un rango de 160 a 240 mg a partir
del patrón de CaCO3 para cinco valores de concentración en un rango de 80-120 %,
que fueron preparadas de forma independiente en un mismo ensayo. La linealidad se
verificó mediante el análisis estadístico de los datos a través de los coeficientes de
correlación y de determinación, la prueba de proporcionalidad y la de significación de
la pendiente ajustada por el método de los mínimos cuadrados.
Precisión intermedia: En el caso de la repetibilidad, este estudio se realizó 100,0 %
de la cantidad teórica declarada; mientras que para la reproducibilidad, se analizó la
misma muestra homogénea de concentración única que representa el 100 %, y se
efectuaron las valoraciones por 3 analistas en 3 días diferentes. La precisión se
3
verificó mediante el coeficiente de variación total (CV) que establece como requisito
para los métodos químicos un CV menor del 3%.
Exactitud: Se realizó un análisis repetitivo a 6 porciones de la misma muestra de
patrón de referencia de CaCO3 de la Merck. Se pesó 200 mg de CaCO3 previamente
secado en la estufa a 200 0C, por 4h. Se humedeció con agua destilada y se disolvió
en HCl 3N. Se llevó a un erlenmeyer de 250 mL y se añadió agua destilada hasta 50
mL aproximadamente, se añadieron 15 mL de disolución de Hidróxido de sodio 1N y
300 mg de hidroxinaftol azul, para valorar posteriormente con disolución de EDTA
0,05N.
Se calculó el contenido de CaCO3 según la ecuación 1:
%= (V EDTA * F* meq * 100)/Pmuestra
(1)
Donde:
V: mL de disolución de EDTA consumido; F: factor de corrección de la
disolución; P: pesada de la muestra: 5,004: Mequivalente gramo; 100: factor
matemático. El factor de corrección es el valor obtenido de la relación entre la
normalidad obtenida experimentalmente y la teórica reportada.
RESULTADOS Y DISCUSION
Linealidad del sistema: La relación entre la concentración de calcio y el volumen de
disolución de EDTA consumido, se describen por un modelo lineal cuya curva se
representa en la figura 1. La curva de calibración resultó ser lineal en el intervalo de
concentraciones comprendidos entre 160 y 240 mg. Al aplicar el método de los
mínimos cuadrados a los resultados registrados se obtuvo la ecuación de la recta que
se expresó según V (EDTA)/ mL = -1,13333 + 0,205167. mg (CaCO3). El coeficiente
de correlación lineal fue de 0,998558 y el valor de la t-student experimental tiene
asociado un valor de p mucho mayor que 0,05.
En el análisis de ANOVA para la regresión, el valor obtenido para F indica la alta
significación de la pendiente (b≠0) al ser la p< 0,05 e incluso p< 0,01, existiendo
una relación estadísticamente significativa entre el volumen de disolución de EDTA y
la concentración de CaCO3 con un nivel de confianza del 99%.
50
V (EDTA)
47
44
41
38
35
32
160
180
200
220
240
c (Carbonato de Calcio)
Figura 1. Relación entre la concentración de carbonato de calcio y el volumen de
EDTA consumido.
Precisión del método: En la Tabla 1 se exponen los resultados correspondientes al
estudio de la repetibilidad. El valor obtenido de 0,41 % para el coeficiente de
variación se considera aceptable para el límite establecido de un 3 %.
En el ensayo de reproducibilidad los resultados de la comparación a través del análisis
de varianza (ANOVA) para los factores analistas y día; muestran que no existen
4
diferencias significativas en % para un nivel de confianza del 95,0%, dado que ningún
P-valor es inferior a 0,05, (tabla 2).
Se obtiene un CVT =0,5% para la variable dependiente correspondiente al % de
CaCO3, que es un valor menor al 3 % según lo establecido para este tipo de método
(tabla 3). Los resultados de la comparación a través del análisis de varianza (ANOVA)
para los factores analistas y día; muestran que no existen diferencias significativas en
% para un nivel de confianza del 95,0%, dado que ningún P-valor es inferior a 0,05,
(tabla 2).
Tabla 1. Resultados experimentales para evaluar la repetibilidad.
M(muestra)/mg
V (EDTA)/mL
% (CaCO3)
38,7
38,5
38,9
38,8
38,8
38,5
S= 0.41
100,4
100,1
101,0
100,8
100,8
100,0
CV=0,41
200,5
200,2
200,4
200,3
200,3
200,3
Xm=100,5
Tabla 2. Análisis de Varianza para el %CaCO3. Factores: Analista y Día.
Fuente
A: Analista
B: Día
Residual
Total (Corr)
Suma de
Cuadrados
0,708439
1,2374
5,47085
0,689687
gL
2
3
30
31
Cuadrado
medio
0,354219
0,412467
0,182362
F
1,94
2,26
P
0,1610
0,1016
Los cocientes F están basados en el error cuadrático medio residual
5
Tabla 3. Resultados de los cálculos estadísticos para evaluar la reproducibilidad
intermedia.
Día
1
Analista 1
%
99,2
99,7
99,3
Analista 2
%
99,6
99,7
99,6
Analista 3
%
98,8
99,3
100,0
100,0
100,0
100,0
99,9
100,2
100,2
98,8
99,9
100,8
98,9
100,0
99,7
100,2
100,0
100,0
100,0
99,8
100,0
2
3
4
Xm
S
CV
Xm= 99,8
99,7
99,8
99,9
99,1
100,1
99,0
99,9
0,4572
0,5
99,9
0,2215
0,2
S= 0,4603
100,1
100,4
100,0
99,8
0,5931
0,6
CVT = 0,5 %
Exactitud: Las pruebas de hipótesis realizadas (Tabla 4), muestran que no existen
diferencias estadísticamente significativas entre el valor del contenido de CaCO3
obtenido experimentalmente y el intervalo de valores asumido como verdadero según
las especificaciones del patrón utilizado (%CaCO3 = 98,5-100,5), con nivel de
confianza de un 95%.Los resultados experimentales se muestran en la tabla 5,
calculados según la ecuación 1.
Tabla 4. Prueba de hipótesis. Criterios de aceptación y resultados.
Criterio de aceptación
Prueba de hipótesis
t exp<t teo; p>0,05
Resultados
Hipótesis nula: media=98,5
Alternativa: menor que
t exp<t teo; p-valor=0,999979
Hipótesis nula: media=100,5
Alternativa: mayor que
t exp<t teo; p-valor= 0,835971
6
Tabla 5. Resultados experimentales para evaluar la exactitud.
m (muestra)/mg
V(EDTA)/ mL
% CaCO3
200,1
39,7
100,3
200,2
39,6
100,0
200,6
39,7
100,0
200,3
39,9
100,7
39,8
39,9
S= 0,34
100,3
100,8
CV=0,34%
200,6
200,0
Xm=100,35
CONCLUSIONES
Se comprobó el cumplimiento de la linealidad del método en el intervalo de
concentraciones de 160 a 240 mg. No se observaron diferencias significativas entre
los factores analista y día para un nivel de confianza del 95,0%, para p> 0,05 lo que
demostró que el método presenta buena reproducibilidad. El ensayo de exactitud
demostró que no existe diferencia significativa entre el valor obtenido
experimentalmente y el teórico reportado para el patrón de CaCO3. Estos resultados
demostraron que el método complejométrico reportado en la USP 27 para la
determinación del contenido de CaCO3 es válido en la producción de SupleCal®.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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de calidad Validación de métodos analíticos. Monografía. Sept., 1989:1-94.
2. EURACHEM (1998) The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory
Guide to Method Validation and Related Topics. EURACHEM Secretariat,
Teddington, Middlesex, http://www.vtt.fi/ket/eurachem
3. United Stated Pharmacopoeia. 27.NF22. Inc Rockville. Mack Printing; vol.27: 3255
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Evaluation of Analytical Methods including Detection and Quantification
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Colección Adulto Mayor, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2000.
6. Ph.D Robert Owen .Why Calcium - A summarized report on the roll of calcium in
human health; Health Digest Publishing Co.,Cannon Beach, OR, 1998.
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