Aplicaciones de los Microarrays y Biochips en Salud Humana Informe de Vigilancia Tecnológica Aplicaciones de los Microarrays y Biochips en Salud Humana Informe de Vigilancia Tecnológica APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA El presente informe de Vigilancia Tecnológica ha sido realizado en el marco del convenio de colaboración conjunta entre Genoma España y la Fundación General de la Universidad Autónoma de Madrid (FGUAM), entidad que gestiona el Círculo de Innovación en Biotecnología (CIBT), perteneciente al Sistema de Promoción Regional de la Innovación MADRID+D. Genoma España y la Fundación General de la Universidad Autónoma de Madrid (FGUAM) agradecen la colaboración ofrecida a: – Dr. Carlos Briones (CSIC-CAB-INTA) – Dra. Ana Dopazo (CNIC) La reproducción parcial de este informe está autorizada bajo la premisa de incluir referencia al mismo, indicando: Aplicaciones de los Microarrays y Biochips en salud humana. GENOMA ESPAÑA/CIBT-FGUAM. Genoma España no se hace responsable del uso que se realice de la información contenida en esta publicación. Las opiniones que aparecen en este informe corresponden a los expertos consultados y a los autores del mismo. © Copyright: Fundación Española para el Desarrollo de la Investigación en Genómica y Proteómica/Fundación General de la Universidad Autónoma de Madrid. Autores: Marta López (CIBT) Paloma Mallorquín (CIBT) Miguel Vega (Genoma España) Edición: Silvia Enríquez Encinas (Genoma España) Referencia: GEN-ES06001 Fecha: Noviembre 2005 Depósito Legal: M-10639-2006 ISBN: 84-609-9226-8 Diseño y realización: Spainfo, S.A. 4 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA Índice de contenido • RESUMEN EJECUTIVO 7 • OBJETIVOS DEL INFORME 8 1. INTRODUCCIÓN 9 2. MICROARRAYS DE ADN 9 2.1. Diseño de un microarray de ADN 2.1.1. Tipos de sondas en microarrays de ADN 2.1.2. Tecnologías de inmovilización de las sondas y tipos de soporte en microarrays de ADN 2.1.3. Tecnologías de fabricación de microarrays de ADN 2.1.4. Técnicas de detección de la hibridación en microarrays de ADN 2.1.5. Sistemas de amplificación de la señal de hibridación del ADN 2.2. Tipos de microarrays de ADN 2.2.1. Resecuenciación génica 2.2.2. Análisis de la expresión Génica 2.2.3. Genotipado de SNPs 2.2.4. Hibridación genómica comparada 3. MICROARRAYS DE PROTEÍNAS 3.1. Diseño de un microarray de proteínas 3.1.1. Tipos de soporte de microarrays de proteínas 3.1.2. Tipos de formato de microarrays de proteínas 3.1.3. Técnicas de detección de la señal en microarrays de proteínas 3.2. Tipos de microarrays de proteínas 3.2.1. Microarrays de identificación y cuantificación de proteínas 3.2.2. Microarrays de función e interacción de proteínas 3.2.3. Microarrays de screening inverso de proteínas 4. MICROARRAYS DE CARBOHIDRATOS 4.1. Diseño de un microarray de carbohidratos 4.1.1. Síntesis de oligosacáridos 4.1.2. Aislamiento de oligosacáridos de fuentes naturales 4.1.3. Inmovilización de los carbohidratos 4.2. Aplicaciones de los microarrays de carbohidratos 5. MICROARRAYS DE CÉLULAS 9 10 10 12 15 16 19 20 21 23 23 24 25 26 28 31 33 33 36 37 38 39 39 39 40 40 41 5 6. MICROARRAYS DE TEJIDOS 43 7. APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS EN SALUD HUMANA 46 7.1. 7.2. 7.3. 7.4. 7.5. Identificación de dianas terapéuticas Descubrimiento y desarrollo de fármacos Diagnóstico clínico Farmacogenómica y farmacogenética Investigación básica 46 47 48 49 50 8. BARRERAS EXISTENTES PARA LA IMPLANTACIÓN DE LOS MICROARRAYS 52 9. PERSPECTIVAS DE MERCADO DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA 54 10. SITUACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO EN ESPAÑA EN EL ÁREA DE MICROARRAYS APLICADOS A LA SALUD HUMANA 56 11. CONCLUSIONES 59 GLOSARIO 60 ANEXOS 62 ANEXO I. Principales aplicaciones de los microarrays disponibles comercialmente ANEXO II. Empresas españolas que operan en el área de microarrays ANEXO III. Empresas españolas que desarrollan productos de bioinformática aplicados a microarrays ANEXO IV. Proyectos de investigación españoles relacionados con tecnologías de microarrays ANEXO V. Patentes recientes en Microarrays REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 6 62 72 76 78 89 90 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA Resumen ejecutivo Los microarrays de ADN surgen de la necesidad de A pesar de que los microarrays de ADN se han analizar la cantidad de información procedente de los convertido en una herramienta esencial para el grandes proyectos de secuenciación de genomas1,2. análisis de expresión génica y la secuenciación del Estas herramientas de estudio de la información ADN, la información que arrojan éstos no es genética vienen empleándose en dos aplicaciones suficiente para comprender los procesos fundamentales, la secuenciación o genotipado del relacionados con los efectores últimos de una ADN y el análisis de la expresión génica. multitud de mecanismos celulares: las proteínas. La estimación de la concentración de proteínas a La determinación de la variación en las secuencias través del ARNm traducido no suministra una de ADN humano mediante microarrays permite información precisa sobre las proteínas entre otras cosas identificar la huella genética de sintetizadas correctamente ni sobre su la predisposición a padecer diferentes funcionalidad. enfermedades. Por otro lado, el empleo de microarrays de ADN en estudios de la expresión Los microarrays de proteínas permiten la génica está permitiendo la identificación y detección, caracterización y cuantificación de las validación de manera mucho más rápida de genes proteínas así como el estudio de su función y sus como potenciales dianas terapéuticas. Los interacciones tanto entre diferentes proteínas patrones o perfiles de expresión génica se pueden como con otras moléculas como ADN o lípidos. Es estudiar desde dos puntos de vista: mediante el por ello que los microarrays de proteínas son una análisis de la expresión específica de los genes en herramienta fundamental de la Proteómica y los tejidos, o bien a través del estudio en las poseen un enorme potencial en cuanto a su alteraciones del nivel de expresión en una aplicación en diagnóstico molecular o desarrollo determinada situación fisiológica o patológica con de fármacos. el objetivo de identificar los genes implicados. El estudio a gran escala de los carbohidratos y La combinación de los datos obtenidos a través de sus interacciones con proteínas juega un papel la secuenciación del ADN junto con la información destacable en biología celular y medicina, ya que obtenida del estudio de perfiles de expresión los carbohidratos están involucrados en la génica, permite establecer una correlación entre interacción de los patógenos con su organismo el genotipo y el fenotipo de un determinado hospedador, procesos de desarrollo, transducción individuo en una situación concreta. El resultado de señales e inflamación. El empleo de de esta combinación está resultando de enorme microarrays en el análisis de carbohidratos es otra importancia en estudios de farmacogenómica, así posible expansión de estas herramientas al como en el desarrollo de la medicina análisis de alto rendimiento de moléculas personalizada. diversas. 1 2 http://www.sanger.ac.uk/HGP/ http://www.tigr.org/tdb/ 7 Objetivos del informe El objetivo del presente informe consiste en realizar una actualización de los últimos desarrollos llevados a cabo en las tecnologías relacionadas con los microarrays y biochips, así como de sus aplicaciones en salud humana. Este documento pretende ser una revisión del informe de Vigilancia Tecnológica en Microarrays y Biochips de ADN publicado por Genoma España en el año 2002, incluyéndose en esta ocasión microarrays y biochips de otras biomoléculas como proteínas y microarrays de células y tejidos. Por otra parte, se ha realizado un estudio acerca de las perspectivas de las tecnologías clave relacionadas con microarrays y biochips en España, para lo cual se ha hecho una revisión de los grupos de investigación que en la actualidad están trabajando en el desarrollo de estas herramientas de análisis. Por último, con el objetivo de evaluar las limitaciones tecnológicas y prácticas del empleo de microarrays y biochips en salud humana, se ha recurrido a la recopilación de información por medio de cuestionarios por parte de diversos expertos en la materia. 8 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA 1. Introducción Como consecuencia de la disminución progresiva del coste de los microarrays en los últimos años, se ha producido una integración de esta tecnología como herramienta fundamental de la biomedicina y del proceso de desarrollo de fármacos. El empleo de microarrays en estudios de genómica funcional tiene numerosas aplicaciones de entre las que se pueden destacar la determinación de perfiles de expresión génica, la selección de biomarcadores, la farmacogenómica, la toxicogenómica, la identificación de genes marcadores pronóstico de enfermedades y la clasificación de tumores. 2. Microarrays de ADN Los microarrays de ADN son colecciones de moléculas de ADN inmovilizadas sobre un soporte en localizaciones conocidas, empleados para el estudio de la secuencia de genes conocidos, o bien para determinar los niveles de expresión genética de un tipo celular o tejido. 2.1. Diseño de un microarray de ADN A la hora de fabricar un microarray, existen determinados elementos que tendrán una importancia crucial en función de las aplicaciones deseadas: Puntos clave en la fabricación de un microarray • Elección de la sonda. • Elección del soporte. • Tecnología de inmovilización de la sonda. • Técnica de fabricación del array. • Método de detección de la hibridación. • Sistemas de amplificación de la señal/sonda. • Sistemas de análisis e interpretación de la señal. 9 2.1.1. Tipos de sondas empleadas en los microarrays de ADN nucleotídicas están unidas a un esqueleto de tipo peptídico en lugar del típico esqueleto de fosforribosas del ADN. Estas sondas son de gran “Sonda” es el término que se emplea comúnmente para definir un fragmento de ADN o ARN de secuencia conocida, el cual se emplea en ensayos de hibridación para identificar secuencias idénticas o similares en una mezcla compleja de ácidos nucleicos. Las sondas también pueden consistir en anticuerpos que son utilizados en las técnicas de 3 detección de proteínas específicas . En el caso de los utilidad en los microarrays de ADN ya que los híbridos que se forman entre las sondas de PNA y el ADN que se analiza poseen una estabilidad térmica superior a los dúplex de ADN-ADN, además de cierta insensibilidad a la fuerza iónica debido a la carga neutra del PNA. Por otra parte, los dúplex que presentan desapareamientos de una sola base son menos estables que sus microarrays de ADN, el material biológico que se correspondientes híbridos de ADN-ADN, lo que les emplea como sonda puede consistir en moléculas de hace particularmente adecuados para detectar ADN, ARN o PNA, que se inmovilizan sobre el mutaciones en una sola base nucleotídica o SNP soporte del array e hibridan con la muestra de ADN (Single Nucleotide Polymorphism)4. a analizar denominada “diana”. • Sondas de ADNc • Sondas de oligonucleótidos Además de oligonucleótidos de ADN o PNA, Las sondas comúnmente empleadas en los también es posible emplear ARNm de genes microarrays de ADN consisten en oligonucleótidos concretos como sonda de hibridación, aunque de cadena sencilla de ADN, que pueden debido a su baja estabilidad es necesario realizar sintetizarse in situ o bien depositarse sobre el una transcripción inversa para obtener un ADN soporte mediante diferentes técnicas de copia (ADNc) de mayor estabilidad. inmovilización. Estas sondas suelen ser lineales y con longitud comprendida entre los 11 y 50 nucleótidos. Recientemente, el empleo de horquillas de oligonucleótidos está empezando a tomar relevancia debido a su mayor estabilidad, mejor índice de hibridación y mayor afinidad por los agentes de captura, que se traduce en una 2.1.2. Tecnologías de inmovilización de las sondas y tipos de soporte en microarrays de ADN señal de mayor intensidad. La deposición de las sondas es un paso • Sondas de PNAs fundamental a la hora de diseñar un microarray de ADN, y está directamente relacionado con la Los ácidos nucléicos peptídicos (PNAs) son elección del soporte y la técnica de fabricación del moléculas artificiales con características híbridas array. Existen tres factores que han de tenerse en de ácidos nucleicos y peptídicos, donde las bases cuenta en la inmovilización de las sondas: Puntos clave en la inmovilización de sondas de ADN • La química empleada en la inmovilización ha de ser estable durante las diferentes etapas del experimento. • Las sondas han de permanecer funcionales después de su inmovilización. • Las sondas han de ser inmovilizadas con una orientación y configuración apropiada de manera que no se entorpezca el emparejamiento de bases. 3 4 Glosario de términos genéticos. Universidad de Murcia, Dpto. Bioquímica, Biología Molecular e Inmunología (http://www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes/Glosario/Glosario/index.htm). Campas, M.; Katakis, I. (2004). DNA biochip arraying, detection and amplification strategies. Trends in analytical Chemistry. Vol. 23(1): 49-62. 10 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA Las tecnologías de inmovilización de sondas sobre la superficie de microarrays de ADN son muy diversas, como se muestra en la tabla 1. Las monocapas autoensambladas5 constituyen una de las técnicas que más aceptación ha tenido en los últimos años debido a su simplicidad, eficiencia y bajo coste. Las principales tecnologías de inmovilización de sondas se recogen en la siguiente tabla: PRINCIPALES MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE SONDAS Método Orientación de la sonda Accesibilidad Ventajas Desventajas Retención en matriz polimérica Al azar Baja Gran cantidad de sondas Requiere tratamiento de superficie. Bajos índices de hibridación Unión covalente Ordenada Alta Gran estabilidad Requiere tratamiento de superficie. Bajos índices de inmovilización Alta Posible control de la densidad de la sonda Requiere tratamiento de superficie. Posibles interacciones inespecíficas. Bajos índices de inmovilización Requiere tratamiento de superficie. Bajos índices de inmovilización Silanizaciónunión covalente Ordenada Afinidad (biotinaestreptavidina) Ordenada Alta Gran estabilidad. Sencillez Adsorción Al azar Baja Sencillez Bajos índices de hibridación Inclusión en un composite6 Al azar Baja Posible unión ordenada Bajos índices de hibridación Alta Sencillez. Posible control de la densidad de la muestra Posibles interacciones inespecíficas Alta Posible control de la densidad de la muestra Requiere tratamiento de superficie. Bajos índices de inmovilización SAMs directo7 (la propia sonda se inmoviliza formando una monocapa) SAMs indirecto (la sonda se une a SAM de otro material previamente formado) Ordenada Ordenada Tabla 1. Principales métodos de inmovilización de sondas. Fuente: Campàs, M. & Katakis, I. (2004). DNA biochip arraying, detection and amplification strategies. Trends in analytical chemistry. Vol. 23(1): 49-62 (SAM: Self-Assembled Monolayer o monocapa autoensambladas). 5 6 7 Las monocapas autoensambladas (self-assembled monolayers o SAMs) se forman a partir de la organización espontánea de moléculas con ciertos grupos funcionales, principalmente grupos tiol, sobre la superficie de un metal. Estos grupos tiol se fijan al sustrato que se desea cubrir a través de un mecanismo de adsorción química y el resto de la molécula establece uniones electrostáticas, de puente de H, o por fuerzas de Van der Waals, etc., con sus moléculas vecinas (Fuente: González Rumayor, V., et al. (2005). Informe de vigilancia tecnológica. Aplicaciones de biosensores en la industria agroalimentaria. Fundación para el conocimiento madri+d; CEIM). Composite: compuesto que une dos o más materiales, normalmente fibras introducidas en una resina polimérica (plásticos). Las sondas de PNAs han demostrado recientemente una capacidad para formar SAMs directos muy superior a la del ADN, lo que abre una nueva línea de desarrolllo de biosensores. Fuente: Briones, C., et al. (2004). Ordered self-assembled monolayers of peptide nucleic acids with Dna recognition capability. Physical Review Letters, vol. 93:208103 (1-4). 11 El tipo de soporte en el cual se inmovilizan las sondas puede ser de diferente naturaleza, siendo las membranas de nylon y los soportes rígidos como el plástico o el vidrio los más utilizados. En la actualidad, debido a su adaptación al marcaje fluorescente, alta sensibilidad, posibilidad de realizar distintas funcionalizaciones químicas y fácil manejo y resistencia, el vidrio ha suplantado a las membranas como soporte para microarray de ADN8. 2.1.3. Tecnologías de fabricación de microarrays de ADN La fabricación de un microarray consiste en la disposición de las sondas sobre la superficie del mismo en posiciones conocidas y ordenadas. Existen diferentes tecnologías para la producción de microarrays que han de cumplir una serie de requisitos, lo que ha generado la aparición de diversas plataformas comerciales. Estos requerimientos han motivado que los avances tecnológicos relacionados con la fabricación de microarrays queden reflejados en los sistemas de producción y las plataformas introducidas por diferentes empresas. Requisitos de las tecnologías de producción de microarrays • Robustez • Reproducibilidad • Consistencia • Uniformidad • Automatización • Alta precisión • Velocidad de fabricación • Alta resolución • Versatilidad • Coste-efectividad Las principales tecnologías empleadas en la fabricación de microarrays de ADN se pueden clasificar en función de la metodología empleada para disponer sondas de forma ordenada. Principales tecnologías empleadas en la fabricación de microarrays • Ink Jetting: impresión de sondas sin contacto. • Pin deposition: impresión de sondas por contacto. • Fotolitografía: síntesis in situ mediante métodos químicos. • Polipirrolización: inmovilización electroquímica de sondas modificadas por pirroles. • Electrodeposición: inmovilización de sondas de ADN sobre nanopartículas de biorreconocimiento en electrodos. • Unión con direccionamiento electrónico. 8 Meloni, R., et al. (2004). DNA microarrays and pharmacogenomics. Pharmacological Research. Vol. 49: 303-308. 12 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA La técnica de Ink jetting emplea inyectores La electrodeposición selectiva se basa en la piezoeléctricos. Junto al capilar de vidrio que inmovilización de sondas de ADN sobre contiene la muestra se localizan cristales nanopartículas de biorreconocimiento en piezoeléctricos que se deforman al aplicar voltaje. electrodos de resolución fotolitográfica. Estas Esta deformación presiona el capilar y expulsa nanopartículas consisten en pequeñas esferas de una pequeña cantidad de fluido por el extremo oro modificadas con oligonucleótidos. del capilar, que se deposita en un punto concreto de la superficie. El posicionamiento electrónico, técnica desarrollada por Nanogen, está basada en la La técnica Pin deposition emplea agujas o pins que concentración electroforética de oligonucleótidos se empapan en la solución que contiene la muestra biotilinizados sobre un gel de agarosa modificado y se transfiere una pequeña cantidad al extremo de con estreptavidina. Este gel puede direccionarse la aguja. Al hacer contacto el extremo con la electrónicamente sobre un array con propiedades superficie del chip, se imprime una gota en una de electrodo. La incorporación de campos posición determinada de la superficie. Una variante eléctricos permite controlar la deposición de las de este método utiliza en vez de agujas, cabezales sondas, así como incrementar la concentración de similares a la punta de una pluma estilográfica. las muestras sobre estas últimas, aumentando por tanto la efectividad de la hibridación. Existen Respecto a la Fotolitografía, la técnica se basa diversos métodos basados en este tipo de técnica, en la unión de los nucleótidos protegidos por un que combinan los avances producidos en la agente químico fotodegradable sobre un soporte investigación con microarrays con los derivados de vidrio que posee determinados grupos de la microfluídica. reactivos. Mediante una máscara que se sitúa sobre el chip se logra enfocar un haz de luz hacia Algunas de las técnicas anteriormente descritas unas posiciones determinadas, degradando al están confinadas para su uso en laboratorio por agente químico protector en dichas zonas y diferentes motivos. Tal es el caso de la dejándolo intacto en las zonas protegidas por la polipirrolización, que si bien presenta ciertas máscara. Posteriormente se añade un medio que ventajas como su bajo coste, existen una serie de contiene uno de los cuatro nucleótidos que se factores que hacen inviable su empleo a escala unirá, mediante enlace covalente, al soporte con industrial, como son su escasa reproducibilidad de los grupos reactivos que hayan quedado la deposición de sondas, así como el tiempo desprotegidos. Cada grupo añadido lleva una necesario para fabricar un array. molécula receptora fotodegradable. Este proceso se va repitiendo con los diferentes nucleótidos y Las tecnologías líderes en el mercado son la máscaras hasta generar unos oligonucleótidos con impresión por chorro de tinta o ink-jetting, la las secuencias de interés. La pionera en el empleo fotolitografía, pin deposition y el posicionamiento de esta técnica fue Affymetrix y en el primer chip electrónico. Además, en los últimos años se ha que construyó alcanzó una densidad de 106 desarrollado toda una serie de variantes de estas sondas por cm2. En la actualidad, el Genechip® tecnologías orientadas a mejorar el control sobre comercializado por esta compañía consigue una el tamaño y la morfología de la muestra de ADN densidad de más de 9.000 sondas de una longitud depositada sobre el array. Este es el caso de la de 30 bases en 1,6 cm2. tecnología Bubble Jet Printing Technology de Canon10 que es capaz de crear un array de alta La técnica de Polipirrolización está basada en la densidad con unos puntos de tamaño uniforme y copolimerización de un grupo pirrol y los forma regular. oligonucleótidos que portan parte del pirrol en su extremo 5’. Las secuencias de oligonucleótidos La siguiente tabla recoge las principales modificados con pirrol se inmovilizan tecnologías líderes en el mercado en fabricación electroquímicamente en lugares específicos de microarrays, sus principales características, mediante el encendido secuencial de los ventajas y desventajas, así como las aplicaciones diferentes electrodos9. a las que van dirigidas. 9 10 Càmpas, M.; Katakis, I. (2004). DNA biochip arraying, detection and amplification strategies. Trends in analytical chemistry Vol. 23 (1): 49-62. Bubble Jet Technologies Applied to DNA Chips, Canon (http://www.canon.com/technology/detail/bj/dna_chips). 13 14 Oligos de 25 nt Pequeños fragmentos de ADN/ARN Oligos de 20 nt Fotolitografía con nucleótidos activados Deposición de pines en electrodos o fotolitografía con oligos activados Posicionamiento electrónico Hyseq Affymetrix Clinical Micro Sensors Nanogen Fluorescencia Impedancia Tabla 2. Principales tecnologías de fabricación de microarrays. Fuente: Campàs, M.; Katakis, I. (2004). DNA biochip arraying, detection and amplification strategies. Trends in Analytical Chemistry. Vol. 23(1): 49-62. 99 puntos en 2 mm2 36 dianas en un chip Fluorescencia Fluorescencia Radioisotópica 1.024 puntos en 1,15 cm2 64 puntos en 0,6 cm2 Oligos de 5nt Muestras de ADN de 5002.000 nt Deposición de pins en membrana 9.000 puntos en 1,6 cm2 Fluorescencia Radioisotópica 2.780 puntos/ cm2 Detección Muestras de ADN de 500 nt Fragmentos de PCR Densidad Sonda Ink-jetting en vidrio Técnica Synteni/Incyte Pharmaceuticals Empresa Alta densidad Bajo coste Alta densidad Bajo coste Bajo coste Ventajas Alto coste Baja densidad Alto coste Alto coste Síntesis in situ Baja densidad Baja densidad Desventajas PRINCIPALES TECNOLOGÍAS DE FABRICACIÓN DE MICROARRAYS DE ADN Perfiles de expresión, identificación génica, diagnóstico, identificación de STR (short tandem repeat) Perfiles de expresión, identificación génica, diagnóstico, secuenciación, análisis de polimorfismos Perfiles de expresión, diagnóstico, análisis de polimorfismos Perfiles de expresión, identificación génica, diagnóstico, análisis de polimorfismos, secuenciación Perfiles de expresión, identificación génica, diagnóstico, análisis de polimorfismos Aplicación APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA limita el desarrollo de nuevas plataformas de 2.1.4. Técnicas de detección de la hibridación en microarrays de ADN biochips. Los métodos de detección en los cuales no se necesita el marcaje de la diana están tomando relevancia en nuevas aplicaciones de los biochips, ya que permiten una mayor sensibilidad, La detección de la hibridación es un paso clave para revelar qué sondas se han unido a sus reducción de la muestra necesaria y simplificación dianas complementarias procedentes de la del proceso de preparación de la muestra11. muestra. Determinadas técnicas de detección de la hibridación del ADN requieren del marcaje La siguiente tabla muestra las diferentes técnicas de previo de la sonda a la molécula diana, por lo que detección de la hibridación en los microarrays de la detección de la hibridación es un proceso que ADN con su transductor y marcaje correspondiente: TÉCNICAS DE DETECCIÓN DE LA HIBRIDACIÓN EN MICROARRAYS DE ADN Técnicas Transductor Marcaje Fluorescencia Óptico Fluoróforos Piezoeléctrico Piezoeléctrico No necesario Cronopotenciometría Voltametría Impedancia Electroquímico Complejos catiónicos Compuestos redox Cronoamperometría Electroquímico Enzimas redox Capacitancia Electroquímico No necesario Colorimetría Óptico Enzimas Resonancia de plasmones en superficie Óptico No necesario Quimioluminiscencia electroquímica Óptico Quelato rutenio Tabla 3. Técnicas de detección de la hibridación en microarrays de ADN. Fuente: Campàs, M.; Katakis, I. (2004). DNA biochip arraying, detection and amplification strategies. Trends in analytical chemistry. Vol. 23(1)1: 49-62. 11 López, M.; Mallorquín, P.; Vega, M. (2002). Informe de Vigilancia Tecnológica Microarrays y Biochips de ADN. Genoma España. 15 amplificación de la señal de hibridación que 2.1.5. Sistemas de amplificación de la señal de hibridación del ADN emplea oligonucleótidos circularizados. Mediante dos pasos sucesivos con sondas de hibridación, se consigue obtener una secuencia de ADN inmovilizado en el soporte capaz de hibridar con El análisis de ADN por medio de microarrays un ADN circular. Posteriormente, la acción requiere de la amplificación de la muestra y/o de la conjunta del ADN polimerasa12 y el molde de señal para alcanzar una sensibilidad apropiada, si ADN circular desplazándose a lo largo del bien es cierto que la mayoría de los sistemas de fragmento de ADN inmovilizado genera copias del amplificación realizan ambas tareas. A pesar del ADN original unidas entre sí por sus extremos. tiempo que requiere, la técnica de PCR se ha venido Para detectar la señal, se procede a añadir empleando de manera habitual en la amplificación y marcadores fluorescentes complementarios para marcaje fluorescente de muestras de ADN, e incluso su hibridación con los múltiples sitios repetidos se ha integrado en sensores y microarrays para en la secuencia de ADN elongada. Este método minimizar el tiempo de ensayo necesario. Además de amplificación es rápido, técnicamente sencillo, de la técnica de PCR, existe toda una serie de y capaz de detectar mutaciones en presencia de métodos de amplificación de la señal que pueden una gran cantidad de ADN original. Esta técnica ser incorporados en el sistema de detección: cuenta con la desventaja de requerir una gran – La Amplificación por círculo rodante o Rolling cantidad de muestra de ADN de partida (100 nanogramos). Circle Amplification es una técnica de Sonda Adición diana Eliminación diana Adición sonda 2 Adición ADN circular Adición oligos marcados ADN ligasa ADN polimerasa Eliminación ADN circular Fig. 1. Amplificación por círculo rodante. Fuente: Campàs, M., Katakis, I. (2004). DNA biochip arraying, detection and amplification strategies. Trends in analytical chemistry. Vol. 23(1): 49-62. 12 Las ADN polimerasas son las enzimas que realizan la replicación del ADN. 16 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA – La amplificación mediante ADN ramificado es otro de los métodos empleados para aumentar la señal de la hibridación, que en este caso emplea ADN ramificado13 o hiperpolimérico, que debido a sus ramificaciones puede realizar hibridaciones simultáneas. Este tipo de ADN requiere ciertas características como son su homogeneidad, uniformidad, y el control de la composición y tamaño de la longitud de sus fragmentos. Célula Adición de sondas Sondas ADN ramificado Lisado de célula para obtener ARNm Hibridación Marcadores de sondas Cuantificación del ARNm Sustrato quimioluminiscente Fig. 2. Amplificación por ADN ramificado. Fuente: Genospectra (http://www.genospectra.com). – La amplificación de la señal de hibridación mediante nanopartículas dendríticas está basada en el uso de nanopartículas de oro activadas con nucleótidos, como las empleadas en los métodos piezoeléctricos. Estas nanopartículas contienen fragmentos de 13 oligonucleótidos que hibridan con la diana una vez que ésta ha hibridado con la sonda inmovilizada. Empleando el tamaño apropiado de partícula se pueden conseguir sensibilidades de detección muy elevadas. bDNA (branched DNA o ADN ramificado): el ADN ramificado contiene múltiples cadenas ramificadas en forma de árbol y cada una de estas ramas constituye un sitio de hibridización con una sonda marcada con una enzima, que reacciona con un sustrato que permite la demostración colorimétrica o quimioluminiscente. 17 Nanopartícula unida a oligonucleótido ADN diana Fig. 3. Amplificación mediante nanopartículas dendríticas. Fuente: Fritzsche, W. & Taton, A. (2003) Metal nanoparticles as labels for heterogeneous, chip-based DNA detection. Nanotechnology 14, R63-R73. – El método de amplificación de la Tiramida o TSA (Tyramide Signal Amplification) consiste en una combinación de tres pasos que comienzan en el marcaje de la molécula diana con un anticuerpo unido a peroxidasa o estreptavidina. Tras la hibridación a la sonda, se añaden múltiples derivados de tiramida marcados con biotina o agentes fluorescentes, que son activados por la enzima peroxidasa, liberando finalmente radicales de tiramida que emiten una señal detectable. Este es un método de marcaje indirecto que consigue una amplificación de la señal hasta 100 veces mayor que las técnicas directas de marcaje con fluorescencia, sin incrementar el ruido de fondo. A pesar de ser una técnica laboriosa, la amplificación con Tiramida compite con las tecnologías actuales de amplificación por PCR14. Sin embargo, los análisis comparativos son complicados debido a la variabilidad existente en la eficiencia del marcaje15. Peroxidasa H2O2 Estreptavidina Biotina ADN Fig. 4. Amplificación de la Tiramida. Fuente: Tyramide Signal Amplification (TSA) Technology, Molecular Probes, Invitrogen detection technologies (http://probes.invitrogen.com/lit/catalog/2/sections/4021.html). – La amplificación de la señal por medio de liposomas funcionalizados se puede emplear en las técnicas de detección electroquímica de la hibridación. Este sistema está basado en la inhibición de la transferencia de electrones entre la sonda y la superficie del electrodo 14 15 donde la sonda está inmovilizada. Existen dos formas de conseguir la transferencia de electrones, mediante la activación de los oligonucleótidos cargados negativamente, o bien mediante la funcionalización de los liposomas con biotina. Càmpas, M.; Katakis, I. (2004). DNA biochip arraying, detection and amplification strategies. Trends in analytical chemistry Vol. 23 (1): 49-62. Tyramide Signal Amplification (TSA) Technology, Molecular Probes, Invitrogen detection technologies (http://probes.invitrogen.com/handbook/sections/0602.html). 18 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA 2.2. Tipos de microarrays de ADN Los microarrays de ADN surgieron de la necesidad de analizar la ingente cantidad de información surgida de los grandes proyectos de secuenciación de genomas desarrollados en los últimos años16. Por tanto, las principales aplicaciones de los microarrays de ADN se centraron inicialmente en el análisis de la expresión génica y el diagnóstico genético, basados mecanismos implicados en la resistencia de patógenos a ciertos agentes antimicrobianos18. Por último, el uso de microarrays de ADN para el análisis de los perfiles de expresión génica en procesos tumorales, ha posibilitado elaborar para ciertos tipos de cáncer una clasificación de los tumores que ha permitido un diagnóstico y pronóstico más preciso que el obtenido mediante otras técnicas moleculares. • Las estrategias de farmacogenética y en la búsqueda de mutaciones o polimorfismos de farmacogenómica19 constituyen otras de las un solo nucleótido o SNP17. Los nuevos desarrollos áreas de aplicación de los microarrays de ADN. tecnológicos han permitido ampliar estas La combinación de los datos obtenidos a partir aplicaciones hacia nuevas áreas de interés como la de la identificación de SNPs, junto con la farmacogenómica, así como la integración de los información obtenida del estudio de perfiles de microarrays de ADN en el proceso de expresión génica, permite establecer una descubrimiento e identificación de fármacos. correlación entre el genotipo y el fenotipo de un determinado individuo. El resultado de esta • El área de diagnóstico molecular mediante combinación está resultando de enorme microarrays de ADN posee entre sus principales importancia para la identificación de genes que aplicaciones el cribado genético de mutaciones puedan constituir nuevas dianas terapéuticas. o polimorfismos relacionadas con enfermedades mediante técnicas de resecuenciación del ADN. 16 17 18 19 • El proceso de descubrimiento y desarrollo Por otra parte, la identificación de de fármacos se ha beneficiado del uso de microorganismos patógenos (virus, bacterias, herramientas genómicas de alto rendimiento hongos o protozoos) mediante microarrays de como los microarrays de ADN, que hacen oligos que contengan secuencias de ARN posible el análisis de la expresión génica en ribosomal de dichos microorganismos es de miles de muestras simultáneamente. El diseño utilidad en el diagnóstico de patologías y estratificación de los ensayos clínicos en infecciosas. Asimismo, tanto los análisis de función del genotipo es otra de las aplicaciones SNPs como de expresión génica mediante que los microarrays de ADN han aportado a la microarrays de ADN permitirían identificar los industria farmacéutica. The Sanger Institute: Human Genome Project (http://www.sanger.ac.uk/HGP). The Institute for Genomic Research, TIGR (http://www.tigr.org/tdb). SNP: Single Nucleotide Polymorphism. Doménech-Sánchez, A. & Vila, J. (2004). Fundamento, tipos y aplicaciones de los arrays de ADN en la microbiología médica. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 22(1):46-54. Bryant, P. A., et al. (2004). Chips with everything: DNA microarrays in infectious diseases. Lancet Infect. Dis. 4:100-111. Farmacogenética: disciplina que se ocupa de estudiar las diferentes respuestas de los individuos frente a los fármacos basándose en los patrones de variabilidad genética de cada paciente. Farmacogenómica: término más amplio que persigue buscar genes candidatos de respuesta a determinados fármacos o personalizar medicamentos empleando herramientas genómicas. 19 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS DE ADN EN SALUD HUMANA Áreas Diagnóstico molecular Farmacogenética y Farmacogenómica Descubrimiento y desarrollo de fármacos Aplicaciones Técnicas Cribado genético Resecuenciación Identificación de patógenos Detección de secuencias de ADN procedentes de patógenos Resistencia a fármacos de microorganismos infecciosos Genotipado de SNPs Análisis de la expresión génica Diagnóstico y pronóstico oncológico Análisis de la expresión génica Identificación de genes Análisis de la expresión génica Genotipado de SNPs Resecuenciación Respuesta a fármacos Genotipado de SNPs Diagnóstico predictivo Genotipado de SNPs Cribado de fármacos Análisis de la expresión génica Diseño y estratificación de ensayos clínicos Genotipado de SNPs Tabla 4. Aplicaciones de los microarrays de ADN en salud humana. Fuente: Elaboración propia. A continuación se describen las principales técnicas genómicas que emplean los diferentes microarrays de ADN en función del objetivo que se persiga: 2.2.1. Resecuenciación génica fragmento de ADN a analizar se divide en fragmentos de entre 200 y 600 nucleótidos, y El descubrimiento de genes o la identificación posteriormente se marca e hibrida con las sondas mediante secuenciación de determinadas inmovilizadas. Al detectar la localización de la secuencias de ADN, requiere arrays con sondas hibridación mediante técnicas de análisis y que incluyan todas las posibles combinaciones de procesamiento de las señales, se puede identificar nucleótidos para una determinada longitud. El la secuencia total del fragmento de ADN. 20 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA La resecuenciación es una las últimas aplicaciones de los microarrays de ADN, que permite la identificación de mutaciones y SNPs en el genoma a partir de una secuencia conocida. Para cada base nucleotídica de una secuencia se diseñan cuatro sondas que difieren entre sí en un nucleótido (A,T,G,C) generalmente en su posición central. Posteriormente se marca el ADN de la muestra mediante reactivos fluorescentes, y se pone en contacto con las sondas inmovilizadas en el microarray. Los fragmentos de ADN que contengan una secuencia complementaria hibridarán únicamente con una de las cuatro sondas, dando lugar a una señal fluorescente20. La principal ventaja de esta técnica consiste en que permite conocer la secuencia de fragmentos de ADN de hasta 30 Kb de longitud. Fig. 5. Resecuenciación mediante microarrays de ADN. Fuente: Cutler, DJ, et al. (2001). High-throughput variation detection and genotyping using microarrays. Genome Res. 11(11):1913-25. 2.2.2. Análisis de la expresión génica niveles de proteínas que se producen durante un estado patológico o en una determinada situación metabólica. La expresión génica es el proceso por medio del cual la información codificada en el ADN se El análisis de la expresión génica mediante transforma en las proteínas necesarias para el microarrays de ADN requiere realizar previamente desarrollo y funcionamiento de la célula. Este la copia del ARNm a ADN complementario proceso tiene lugar por medio de una molécula mediante un proceso de transcripción inversa. intermediaria que transmite la información Este ADN copia (ADNc) posee una mayor genética denominada ARN mensajero (ARNm). estabilidad que el ARNm y además permite la Una de las principales aplicaciones de los adición de marcadores para su detección21. Las microarrays de ADN es la determinación del perfil moléculas marcadas de ANDc se hibridan a de expresión, es decir la cuantificación relativa de microarrays que contienen sondas de ADN los ARN transcritos, mediante la comparación de específicas para genes concretos. La señal que los ARNm aislados de dos muestras diferentes. emite el ADNc será indicativa de la presencia de Por tanto, los microarrays de ADN proporcionan expresión génica, que también puede ser indirectamente información de los distintos cuantificada. 20 21 CustomSeq™ Resequencing Arrays, Affymetrix (http://www.affymetrix.com/products/arrays/specific/custom_seq.affx). López, M.; Mallorquín, P.; Vega, M. (2001). Informe Sectorial de Vigilancia Tecnológica sobre Microarrays y Biochips de ADN. Genoma España. 21 Tejido sano Muestra A Tejido enfermo Muestra B Interpretación A>B B>A A=B Extracción ARNm A B Combinación de ambas señales fluorescentes ADNc marcado con sondas fluorescentes Hibridación con ADN inmovilizado Emisión de fluorescencia Incidencia luz fluorescente Fig. 6. Análisis de la expresión génica mediante microarrays de ADN. Fuente: Institute for Mikrobiology and Genetics, Georg-August-University of Göttingen, Functional Genomics Group. (http://wwwuser.gwdg.de/~aehrenr/arrays/c_arrays.html). El perfil de expresión génica de una célula No obstante, una de las aplicaciones más proporciona información sobre su fenotipo y su atrayentes es el empleo de microarrays de respuesta al medio (estado metabólico, ciclo expresión génica en clínica. La empresa celular, respuesta a condiciones de estrés, holandesa Agendia22 ha desarrollado microarrays presencia de toxinas o microorganismos de expresión génica que permiten predecir el patógenos). La medida de la expresión génica es riesgo de sufrir metástasis en pacientes con cáncer una importante herramienta para estudiar los de mama, así como arrays de expresión que mecanismos de regulación, rutas bioquímicas y facilitan la identificación de tumores primarios. La funciones celulares. empresa californiana Genomic Health23 posee entre sus productos un microarray de expresión Las aplicaciones de los microarrays de expresión génica que cuantifica la probabilidad de recurrencia génica son diversas, y actualmente el número de en pacientes con cáncer de mama, e incluso productos dirigidos a la industria farmacéutica se proporciona información acerca de las terapias más ha multiplicado considerablemente (ver Anexo I). efectivas para el paciente. Aplicaciones de los microarrays de expresión génica • Identificación de genes involucrados en procesos patológicos, fisiológicos y de desarrollo. • Caracterización de tumores. • Estudio de procesos de regulación génica. • Diagnóstico mediante la identificación de patrones de expresión relacionados con diferentes estados patológicos. • Identificación de dianas terapéuticas en el proceso de desarrollo de fármacos mediante la comparación de los genes expresados en tejido normal y tejido enfermo. 22 23 MammaPrint®, CupPrint™ (Agendia, BV; http://www.agendia.com). Oncotype DX™ (Genomic Health, Inc.; http://www.genomichealth.com/oncotype/hcphome.aspx). 22 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA 2.2.3. Genotipado de SNPs y de experimentos de secuenciación de fragmentos concretos de ADN. En la actualidad Menos del 0,1% del genoma humano presenta varias compañías biotecnológicas disponen de variaciones entre los distintos individuos, siendo tests farmacogenómicos que permiten la las formas más frecuentes de variación los SNPs o identificación de polimorfismos relacionados con el 24 polimorfismos de una sola base , que consisten metabolismo de fármacos. Los principales tests en sustituciones de una base por otra. La mayoría toxicogenómicos se centran en el genotipado de de los SNPs conocidos hasta hace unos años genes de enzimas de la familia del citocromo habían sido identificados a partir de proyectos de p450, relacionada con la toxicidad de un gran secuenciación como el Proyecto Genoma Humano, número de fármacos25. Fig. 7. Microarray de análisis farmacogenómico AmpliChip CYP450. Fuente: Roche Group, AmpliChip CYP450 Test (http://www.roche-diagnostics.com/products_services/amplichip_cyp450.html). 2.2.4. Hibridación genómica comparada Los microarrays de hibridación genómica comparada (CGH Arrays) son herramientas de análisis genómico de escaneado global que se emplean para detectar la presencia de ganancias (duplicación o amplificación) o pérdidas (deleción o nulisomía) de segmentos del genoma. Su aplicación en el campo de la oncología incluye la detección de nuevas amplificaciones genómicas asociadas a tumores humanos y murinos, la definición en detalle de regiones comúnmente amplificadas (amplicones), y la detección de deleciones asociadas a tumores. 24 25 26 27 Un ejemplo de este tipo de microarrays de hibridación genómica comparada es el Genosensor System de la compañía Vysis26 que permite establecer correlaciones entre el número de copias de un gen y una determinada enfermedad. Éste es un sistema que por el momento sólo se emplea en investigación en laboratorios y aún no se ha empleado con fines diagnósticos. En la actualidad, el Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO) está poniendo en marcha una plataforma para la producción de microarrays de hibridación genómica comparada que posean una cobertura completa de los genomas humano y murino27. Las diferencias entre las secuencias de ADN de los diferentes individuos y especies se deben primordialmente a mutaciones que alteran una de las cuatro letras del código ACGT. Tales cambios de una sola letra de posición variable son los SNP (Single Nucleotide Polymorphism). Además, se conocen otros sistemas de reordenamiento genético, tales como inserciones o deleciones de fragmentos de ADN. Prometheus Laboratories Inc., PRO-PredictRx TPMT (http://www.prometheuslabs.com). Roche Diagnostics, con tecnología de Affymetrix (http://www.roche-diagnostics.com). GE Healthcare, CodeLink P450 Bioarrays (http://www.gehealthcare.com). Jurilab, DrugMEtTM Genotyping Test (http://www.jurilab.com). Roche Group, AmpliChip CYP450 Test (http://www.roche-diagnostics.com). TM Bioscience Corp., Tag-ItTM Mutation Detection Kits (http://www.tmbioscience.com). Vysis (http://www.vysis.com). CNIO, Investigación de Transferencia en Cáncer: del Laboratorio a la Clínica (http://www.cnio.es/es/news/transferencia.htm). 23 3. Microarrays de proteínas Los microarrays y biochips de ADN se han contenida en el proteoma. El proteoma es el consolidado como una herramienta fundamental conjunto de proteínas expresadas por un tejido o para el análisis de la expresión génica a nivel por una célula en un momento determinado. Por genómico. Sin embargo, la determinación de la tanto, la proteómica es la disciplina que estudia cantidad de ARNm mediante microarrays de ADN globalmente la expresión génica a nivel de las no proporciona la información suficiente sobre las proteínas, aglutinando proteómica comparativa, proteínas que se traducen a partir de esta funcional y estructural. molécula. Esto es debido a que las proteínas sufren toda una serie de modificaciones post- Los microarrays de proteínas son de gran traduccionales a lo largo de su proceso de utilidad en el análisis proteómico funcional, y síntesis, que consisten fundamentalmente en consisten en chips de proteínas inmovilizadas en procesamientos proteolíticos, glicosilaciones28, y una posición concreta sobre una superficie sólida, formación de complejos proteicos. Por otra parte, dispuestas de forma similar a como se disponen las proteínas han de plegarse correctamente con las sondas en los microarrays de ADN. A la hora el fin de ser totalmente funcionales. de construir un microarray de proteínas es muy importante plantearse una serie de cuestiones Para completar el estudio de las funciones de las previas, al igual que sucedía con el diseño del proteínas se ha de recurrir a la información microarray de ADN: Factores de relevancia en el diseño de microarray de proteínas • Naturaleza de la superficie sobre la cual inmovilizar (soporte). • Proteínas a inmovilizar. • Método de inmovilización. • Formato del microarray. • Agente de captura (en el caso de microarray de detección). • Método de detección a emplear. 28 Glicosilación: proceso químico por el que se añaden cadenas de azúcares a una proteína. 24 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA Cada una de estas cuestiones lleva asociada una tecnología concreta, que al combinarse permiten la generación de microarrays de proteínas. En la siguiente figura se muestran las tecnologías asociadas a los microarrays de proteínas: Tecnología de producción Impresión por contacto Moléculas de captura Superficies Unión no covalente Impresión sin contacto Fluorescencia Diagnóstico Anticuerpos Receptor/ligando • Hidrofóbica Enzima/sustrato Aptómeros Litografía Aplicaciones Proteínas fusión • Electrostática • Reconocimiento molecular Detección Quimioluminiscencia Resonancia de plasmones superficiales Proteómica Cribado de fármacos Unión covalente Affibodies Radioactividad Espectrometría de masas Fig. 8. Tecnologías implicadas en la producción de microarrays. Fuente: Ojos, T. & Bachmann, J. (2003). Business Briefing: Future Drug Discovery. 1-4. 3.1. Diseño de un microarray de proteínas La complejidad y diversidad estructural de las proteínas ha hecho que el desarrollo de los microarrays de proteínas haya sido técnicamente complicado. Al contrario que los ácidos nucleicos, las proteínas no tienen una estructura homogénea ni un patrón de unión específico, sino que cada proteína posee unas características bioquímicas 29 particulares. En cuanto a los procesos de amplificación de muestra, no existe una técnica equivalente a la PCR capaz de amplificar la cantidad de proteína existente en una muestra. Por lo tanto, la tecnología de microarrays de proteínas se encuentra ante dificultades técnicas en cuanto a la adquisición y unión estable de proteínas a superficies donde puedan interaccionar con otras proteínas o ligandos y detectarse tal interacción29. Hardiman, G., et al. (2002). Protein microarrays: challenges and promises. Pharmacogenomics. Vol. 3 Nº 4: 1-10. 25 3.1.1. Tipos de soporte de microarrays de proteínas Durante el diseño de un microarray de proteínas la elección del soporte habrá de tenerse en cuenta en primera instancia ya que condicionará tanto el formato final del array como el método de detección preferible. De la misma forma, la tecnología de inmovilización elegida ha de tener en cuenta tanto la naturaleza del compuesto que se ha de inmovilizar como la superficie a la cual se acopla, manteniendo siempre la funcionalidad y accesibilidad de las proteínas presentes en el array. Características de un soporte ideal de proteínas • Estabilidad química. • Buena morfología de los puntos o spots. • Mínimas uniones no específicas. • Baja señal de fondo. • Alto ratio superficie/volumen. • Compatibilidad con los distintos sistemas de detección. • Baja autofluorescencia. En el caso del ADN, éste posee una carga negativa que podría aprovecharse para inmovilizar la molécula sobre la superficie del array mediante fuerzas electrostáticas. Por el contrario, la carga de las proteínas es muy variable, y por este motivo se han realizado grandes esfuerzos en la estandarización de materiales de soporte que sean adecuados para cada tipo de microarray de proteínas. Los soportes porosos como las membranas de nitrocelulosa, nylon o fluoruro de polivinilo, son más adecuados para la inmovilización de proteínas que los soportes lisos, ya que poseen mayor superficie y por tanto capacidad de unión30. 30 31 32 No obstante, la nueva generación de química de superficies de membrana y de vidrio ha logrado ofrecer una variedad de superficies de soporte que no requieren del empleo de agentes bloqueantes para eliminar el ruido de fondo, y que a la vez previenen el contacto directo de la proteína con la superficie mediante la introducción de grupos funcionales como polietilenglicol (PEG). Otras estrategias empleadas son capaces de aumentar la densidad de los grupos funcionales accesibles mediante el empleo de dendrímeros31,32. Espina, V., et al. (2004). Protein microarray detection strategies: focus on direct detection technologies. Journal of Immunological methods. Vol. 290: 121-133. Agenendt, P., et al. (2003). Next generation of protein microarray support materials: evaluation for protein and antibody microarray evaluations. Journal of Chromatography A. Vol. 1009:97-104. Los dendrímeros son agrupaciones esféricas de moléculas anidadas, de importante aplicación en la fabricación de dispositivos miniaturizados para el almacenaje de información. 26 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA PRINCIPALES SOPORTES EMPLEADOS EN LA INMOVILIZACIÓN DE PROTEÍNAS SOBRE ARRAYS Soporte Química de superficie Proveedor Placas de dendrímero (prototipo) Capa de dendrímero con grupos reactivos epoxi Chimera Biotech GmbH Placas de epoxi-PEG (prototipo) Capa de PEG con grupos reactivos epoxi Jen Sobek, Functional Genomics Center Placas Maxisorb Superficie de poliestireno modificada Nunc A/S Placas amino Grupos amino Telechem International Placas epoxi Grupos epoxi Telechem International Placas silanizadas Grupos amino Telechem International Placas FAST Matrices de nitrocelulosa Schleicher and Schuell Biosciences Placas en cultivo celular en poliestireno Poliestireno Nalge Nunc International Placas de aminosilanos Grupos amino Sigma Aldrich Chemie GmbH HydroGel Gel de poliacrilamida modificado Perkin-Elmer Microarray reflectivo Trietoxilsilano 3-amino propil Amersham Biosciencies Placas epoxi QMT Grupos epoxi Quantifoil Micro Tools GMBH Placas de polilisina Grupos amino Preparadas manualmente Placas de poliacrilamida Poliacrilamida Preparadas manualmente Tabla 5. Principales soportes empleados en la inmovilización de proteínas sobre arrays. Fuente: Angennendt, P. & Glöker, J. (2003). Protein and antibody microarray technology. Journal of Chromatography B Vol. 797: 229-240. Para favorecer la inmovilización de las proteínas es frecuente recurrir a moléculas adaptadoras de afinidad, que consisten fundamentalmente en proteínas33, poliaminoácidos34 o polipéptidos. Las estrategias más habituales se centran en el empleo de moléculas de afinidad ancladas en la superficie del array, que a su vez mantendrán unidas las proteínas por medio de una segunda molécula adaptadora35. 33 34 35 Biotina (unión a estreptavidina); Proteína G (unión a anticuerpo Fc); Proteína A (unión a anticuerpo Fc); GST, Glutation S-transferasa (unión a anti-GST); MBP, proteína de unión a la maltosa (unión a anti-MBP); TRX, tiorredoxina reductasa (unión a anti-TRX), GFP, proteína verde fluorescente (unión a anti-GFP). Poli-aminoácidos empleados como moléculas de afinidad en microarrays de proteínas: Poli-Histidina (soporte de resina de níquel); Poli-Lisina (uniones amida y bases de Schiff); Poli-cisteina (uniones tioéter). Hardiman, G., et al. (2002). Protein microarrays: challenges and promises. Pharmacogenomics. Vol. 3 (4): 1-10. 27 Proteína Molécula adaptadora Molécula de afinidad Soporte recubierto de una capa orgánica Fig. 9. Estructura de un microarray de proteínas. Fuente: Hardiman, G., et al. (2002) Protein microarrays: challenges and promises. Pharmacogenomics. Vol. 3 (4): 1-10. 3.1.2. Tipos de formato de microarrays de proteínas Los formatos que se pueden emplear para construir un microarray de proteínas son muy variados, aunque el más extendido es el formato de array plano que se comercializa por numerosas empresas: MICROARRAYS PLANOS DE MICROARRAYS DE PROTEÍNAS DISPONIBLES COMERCIALMENTE Empresa Producto Aplicación Schleicher & Schuell Bioscience ProvisiónTM HCA Perfil de citoquinas Zymoyx Inc. Simios protein profiling biochip system Perfil de citoquinas Pierce Biotechnology Inc. Search LightTMArrays Perfil de citoquinas RayBiotech Inc. RayBioTM Cytokine Arrays, Custom Ab Arrays Perfil de citoquinas BD Biosciences BD ClontechTM Ab Microarray Análisis comparativo de proteínas Sigma Aldrich Co. PanoramaTM Ab Microarray Cell Signalling KitTM Análisis comparativo de proteínas Protometrix Inc. The Yeast ProtoarrayTM Estudios de interacción de proteínas Molecular Staging Inc. Rolling circle amplification technology (RCATTM) Perfil de proteínas multiplexado Zeptosen AG ZeptoMARTM CeLyA Cell Lysate Arrays Screening reverso Ciphergen Biosystems inc SELDI Protein Chip® Technology Screening reverso Tabla 6. Microarrays planos de microarrays de proteínas disponibles comercialmente. Fuente: Joos, T. O. Microarray technology: an increasing variety of screening tools for proteomic research. Drug Discovery Today (2004). Vol. 3 (1): 24-31. 28 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA Otros formatos alternativos están encaminados a disminuir la cantidad de muestra y reactivos necesarios por medio de la miniaturización y la combinación con tecnologías de microfluídica: • CD de centrifugación como el Gyrolab Bioaffy™ comercializado por Gyros36. El giro del CD hace que la fuerza centrífuga dirija la muestra a través de microcanales, que permiten la cuantificación de proteínas a escala nanométrica por medio de inmunoensayos tipo sándwich u otras técnicas. • Microcanales desarrollados por Biotrove 37 por medio de la tecnología Thru-Hole™, que consiste en una plataforma miniaturizada para el procesamiento en paralelo de alta densidad de muestras a escala nanométrica. CD 18 mm • 3D sobre superficies de silicio como Protein Profiling Biochip™ System de Zyomyx38 que permite la orientación de los anticuerpos gracias a su estructura en pilares. Esta plataforma permite la cuantificación de múltiples citoquinas presentes en suero de plasma humano y murino. Anticuerpo marcado Proteína 36 37 38 Microarray de proteínas sobre CD de centrifugación (Gyrolab BioaffyTM). Gyros AB (http://www.gyros.com). Microarray de microcanales. Biotrove (http://www.biotrove.com). Protein Profiling BiochipTM System de Zyomyx (http://www.zyomyx.com) (en la actualidad está en uso en centros de Investigación de GlaxoSmithkline y Partners Healthcare). Wagner, P.; Raymond, K. (2002). Protein biochips: an emerging tools for proteomic research. Current Drug Discovery. May: 23-28. 29 Las partículas en suspensión también pueden emplearse como base para el microarray, teniendo en cuenta que estas partículas pueden codificarse para su posterior identificación. Existen diferentes sistemas de codificación de estas partículas que emplean tecnologías muy diversas: • Microesferas sometidas a citometría de flujo, comercializadas por BD Biosciences bajo el nombre comercial de BDTM Cytometric Bead Array39: la captura de proteínas se realiza por medio de inmunoensayos tipo ELISA, mientras que la detección se basa en fluorescencia y la cuantificación se realiza por citometría de flujo. • Microesferas codificadas con colores, como el sistema Bio-Plex Protein Array System desarrollado por Luminex 40 y Bio-Rad 41. Mediante este sistema, se pueden medir las reacciones bioquímicas que tienen lugar en la superficie de las microesferas en función de las intensidades de las fluorescencias. Anticuerpos de captura Esferas marcadas con fluorescencia láser • Nanocristales de semiconductores codificadas con colores, que reciben el nombre comercial de Nanocristales Qdot®42 y han sido desarrollados por Quantum Dots Corp. Estos nanocristales están formados por materiales semiconductores que emiten luz en el espectro de luz visible, permitiendo el marcaje de proteínas dentro de las células. Nanocristal • Microesferas con códigos de barras como la tecnología UltraPlexTM desarrollada por Antígenos Smartbeads 43, que permite realizar ensayos multiplexados para una serie de anticuerpos identificados con su código de barras correspondiente. • Micropartículas con códigos de barras formadas por metales intercalados, como las nanopartículas NanobarcodesTM de Nanoplex Anticuerpos de detección Anticuerpos Micropartículas con códigos de barras Marcador fluorescente Proteína Technologies44, que permiten identificar con una gran precisión la molécula para la cual sirve de marcador. Anticuerpos Banda de plata Banda de oro 39 40 41 42 43 44 BDTM Cytometric Bead Array, BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com). Luminex xMAP technology (http://www.luminexcorp.com). Sistema Bio-Plex Protein Array System, Bio-Rad (http://www.bio-rad.com). Qdot® Nanocrystals (http://www.qdots.com). UltraPlexTM, Smartbeads (http://www.smartbead.com). Nanopartículas NanobarcodesTM, Nanoplex Technologies (http://www.nanoplextech.com). 30 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA 3.1.3. Técnicas de detección de la señal en microarrays de proteínas Los métodos de detección empleados en microarrays de proteínas se pueden clasificar en métodos libres de marcaje y métodos que emplean sondas marcadas con diferentes técnicas. Los métodos libres de marcaje presentan la ventaja de no necesitar un marcaje previo de las proteínas diana, evitando de esta forma modificar su actividad. Entre ellas destacan las siguientes: • Espectrometría de masas: técnica en la que las moléculas proteicas se ionizan y posteriormente se aceleran a través del vacío mediante un campo magnético. Las partículas de distinta relación masa/carga se separan por su deflexión (desviación de la dirección de la corriente) en un campo magnético. Dentro de la espectrometría de masas las variantes más representativas son la denominada espectrometría MALDI-TOFF45 y la espectrometría de masas en tandem (MS/MS). • Resonancia de Plasmones Superficiales Campo magnético e Luz polarizada Luz reflejada (SPR): técnica basada en fenómenos ópticos que tienen lugar sobre la superficie de un metal, permitiendo la detección de cambios de concentración de la masa del chip debidos a la unión de un ligando a la proteína inmovilizada. Dentro de las estrategias que emplean métodos de marcaje, se pueden clasificar a su vez en técnicas de detección directa si utilizan una sonda marcada que sea compatible con el sustrato, y métodos de detección indirecta, donde se marca directamente la proteína de interés46. En función del marcaje realizado, la técnica de detección empleada será diferente: • Detección cromogénica: los cromógenos son sustancias que sirven como sustratos para reacciones enzimáticas que generan productos coloreados. La detección cromogénica de microarrays de proteínas produce señales permanentes de fácil visualización para su análisis. Los cromógenos empleados con mayor frecuencia en microarrays de proteínas son la peroxidasa y la fosfatasa alcalina. • Detección por quimioluminiscencia: la emisión de la luz se produce por los productos de una reacción química en la que participa la enzima luciferasa. La quimioluminiscencia puede emplearse con cualquiera de los métodos de detección por marcaje de sonda. La principal ventaja de la detección por quimioluminiscencia 45 46 es que crea un registro permanente de los resultados con alta sensibilidad y rapidez. • Detección por fluorescencia: las moléculas fluorescentes (fluoróforos) absorben fotones de luz de una fuente externa, generalmente un láser monocromático, que provoca la excitación de los electrones de la molécula y la posterior emisión de luz en una longitud de onda mayor a la de la luz incidente. La principal limitación de esta técnica de detección es su incompatibilidad con los soportes que poseen autofluorescencia, ya que esta característica hace muy difícil distinguir la señal del ruido de fondo. Los principales fluoróforos empleados son fluoresceína, rodamina, ficobiliproteínas, acridinas y cianinas. MALDI-TOF: Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (desorción/ionización mediante láser asistida por matriz. Espina, V. (2004). Protein microarray detection strategies: focus on direct detection technologies. Journal of Immunological Methods. Vol. 290: 121-133. 31 • Detección por desintegración radiactiva: la posibilidad de incorporar 32 P en proteínas, ADN • Deshidratación de las proteínas: la miniaturización de los microarrays de proteínas es consecuencia y ARN permite la detección de las interacciones de los problemas de deshidratación e inactivación proteína-proteína, proteína-ADN, proteína-ARN y de las proteínas, que se acentúan bajo el empleo proteína-ligando. Sin embargo, el empleo de la de soportes de cristal. Por este motivo, la radiactividad como método de detección para nanotecnología y microfluídica son campos que microarrays no está muy extendido por están desarrollando nuevas estrategias como son cuestiones de seguridad. las estructuras de microcanales, que previenen la deshidratación de las proteínas debido a su Desafíos tecnológicos a los que se enfrentan arquitectura cerrada. Otra de las alternativas que los microarrays de proteínas se está estudiando consiste en el empleo de sustancias químicas que estabilicen las proteínas. El análisis de proteínas mediante microarrays se enfrenta a una serie de limitaciones referidas • Fenómenos de reactividad cruzada: dada la principalmente a problemas de detección de la naturaleza de los anticuerpos que en su mayoría interacción y de estabilidad de las proteínas se encuentran glicosilados, el fenómeno de inmovilizadas. reactividad cruzada sucede a menudo, creando falsos positivos y falsos negativos al formarse • Disponibilidad de proteínas y anticuerpos complejos de cierta estabilidad. Por ello, las específicos: en el caso de los microarrays de estrategias actuales van encaminadas a la anticuerpos, una de las principales limitaciones selección de anticuerpos altamente específicos, ante las que se enfrenta su fabricación no es o al empleo de otras moléculas de afinidad únicamente obtener grandes cantidades, sino al como los aptámeros o esqueletos proteicos. hecho de que es necesario obtener anticuerpos de gran diversidad. Para solucionar estos • Detección no uniforme de las interacciones problemas, se está recurriendo a la producción entre proteínas: el empleo de técnicas de de fragmentos de anticuerpos como scFvs o marcaje en microarrays de proteínas supone Fabs mediante librerías de fagos u otras, en una limitación importante, ya que es imposible lugar de producir anticuerpos en hibridomas que lograr un marcaje homogéneo en mezclas de suponen un alto coste. proteínas debido a su diversidad y complejidad. La detección de proteínas en un microarray • Detección específica de proteínas: una requiere un rango mucho más dinámico de alternativa para la detección de proteínas es el operaciones que el caso de los microarrays de empleo de aptámeros. Estas moléculas ADN, ya que la concentración de proteínas en el consisten en ácidos nucleicos generalmente interior de las células es muy variable. Esta cortos y obtenidos por métodos de selección in característica hace que sea necesario el empleo vitro, que son capaces de reconocer y unirse a de anticuerpos con afinidades variables, que una molécula específica como una proteína o un sean capaces de detectar proteínas a distintas ligando. concentraciones. 32 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA 3.2. Tipos de microarrays de proteínas En función de la aplicación que se persiga con el uso de microarrays de proteínas, se pueden Los microarrays de captura de proteínas se pueden construir mediante el empleo de diferentes agentes de captura, dando lugar a los microarrays de identificación de proteínas comerciales que se recogen en la tabla 7. Los agentes de captura empleados de manera más frecuente son: clasificar en microarrays de detección de proteínas y microarrays de función o interacción de proteínas. a. Anticuerpos: proteínas altamente específicas producidas por el sistema inmune que reconocen a los agentes infecciosos y otras sustancias extrañas que invaden el organismo. 3.2.1. Microarrays de identificación y cuantificación de proteínas b. Affibodies: moléculas que mimetizan las funciones de los anticuerpos y que se pueden sintentizar de manera sencilla con una Los microarrays de identificación de proteínas determinada especificidad y afinidad de manera constituyen herramientas muy útiles de que se dirijan a una diana específica. diagnóstico. Se basan en la captura de proteínas por medio de moléculas de diversa naturaleza que c. Aptámeros: moléculas de ADN o ARN capaces permanecen ancladas a la superficie del de reconocer y unirse a una molécula específica microarray. (proteína u otro ligando). Affibodies Aptámeros Anticuerpos Fig. 10. Modo de interacción de los affibodies, aptámeros y anticuerpos como agentes de captura. Fuente: Joos, T. O. (2004). Microarray technology: an increasing variety of screening tools for proteomic research. Drug Discovery Today. Vol. 3 (1):24-31. En el caso de los microarrays basados en anticuerpos como agentes de captura, se emplean dos estrategias de detección basadas en las técnicas de inmunoensayos. La primera consiste en un inmunoensayo tipo sándwich, donde los anticuerpos se inmovilizan sobre la superficie del array, y las proteínas que se unen a ellos serán detectadas por un segundo anticuerpo marcado. En el segundo tipo de inmunoensayo, las proteínas interaccionan de manera similar con los anticuerpos inmovilizados, pero en este caso las proteínas se marcan química o fluorescentemente antes de incorporarlas sobre el microarray, sin necesidad de utilizar un anticuerpo adicional. Sandwich Captura de antígenos Fig. 11. Estrategias de detección empleadas en los microarrays de proteínas. Fuente: MacBeath, G. (2002). Protein microarrays and proteomics. Nature Genetics Suppl. Vol. 32:526-532. 33 La ventaja de los microarrays de identificación de proteínas es que permiten la amplificación de la señal, si bien en contrapartida la detección de proteínas en bajas concentraciones es complicada ya que para su unión deben competir con otras proteínas presentes en mayores concentraciones. La principal limitación de estos microarrays radica en la necesidad de conseguir una elevada especificidad de los anticuerpos inmovilizados y en la precisión de la detección, que se encuentra limitada por la reproducibilidad del experimento, tanto de la preparación de la muestra como de su deposición. 47 Los microarrays de proteínas han alcanzado el mercado con una gran variedad tanto de superficies, de sistemas de inmovilización de los agentes de captura, y de agentes de captura en sí mismos. Por el contrario, la tecnología de detección de la señal empleada en estos ensayos es fundamentalmente la fluorescencia. Esta variedad de productos comerciales se muestra en la tabla 7 del presente informe. Un ejemplo de los microarrays de detección de proteínas que emplean anticuerpos es el desarrollado por la empresa Chemicon, que ha introducido en el mercado microarrays para la detección de los perfiles de expresión de citoquinas en muestras biológicas47. ChemiarrayTM, Chemicon International Inc. (http://www.chemicon.com/Product/Research.asp). 34 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA PRINCIPALES TECNOLOGÍAS EMPLEADAS EN MICROARRAYS DE PROTEÍNAS Empresa Material del chip Agente de captura Detección de la señal Ciphergen Biosystems Sílice recubierto de aluminio Afinidad de metales, cromatografía cargada o hidrofóbica, anticuerpos SELDI y MS Lumicyte Sílice Afinidad de superficie química, bioquímica o biológica SELDI y MS Biacore Vidrio recubierto con capa de oro, superficie de hidrogel de dextrano NHS/EDC superficie activada, superficie de Ni2+, anticuerpos, estreptavidina SPR HTS Biosystems Plástico con fina retícula en la superficie, recubierto por fina capa de oro Anticuerpos y fragmentos de anticuerpos SPR Large Scale Biology Plástico Anticuerpos Fluorescencia Biosite Diagnostics Plástico Anticuerpos Fluorescencia Zyomyx Sílice Anticuerpos y fragmentos de anticuerpos Fluorescencia Phylos N/A Estructuras de polipéptidos basadas en fibronectina Florescencia Somalogic N/A Aptámeros Fluorescencia Akceli Vidrio CADN expresado por células humanas embrionarias de riñón Fluorescencia Packard Bioscience Hidrogel de poliacrilamida Anticuerpos Fluorescencia Interactiva Biotechnology Alquiltioles de cadena larga en superficie de oro biotinilada Captura de las moléculas biotiniladas por estreptavidina Fluorescencia Protometrix Vidrio Superficie recubierta de Ni2+ para la captura de proteínas marcadas con Histidina Fluorescencia BD Biosciences Vidrio Anticuerpos Fluorescencia Molecular Staging Inc. Vidrio Anticuerpos y amplificación por círculo rodante Amplificación del ADN marcado asociado Tabla 7. Principales tecnologías empleadas en microarrays de proteínas. Fuente: Hardiman, G., et al. (2002). Protein microarrays: challenges and promises. Pharmacogenomics. Vol. 3 (4): 1-10. MS: Mass Spectrometry; NHS: N-hydroxysuccinimide; SELDI: Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization; SPR: Surface Plasmon Resonance. 35 3.2.2. Microarrays de función e interacción de proteínas Mediante los arrays de proteínas de función e interacción se puede estudiar de manera simultánea diferentes interacciones existentes entre proteínas, proteína-oligosacárido, proteínaADN, y proteína-fármaco. Además estos microarrays pueden emplearse en la verificación de la diana de un determinado anticuerpo o bien en la identificación del sustrato de una enzima, tal y como se ha representado en la siguiente figura: Receptor-ligando Enzima-sustrato Proteína-proteína Proteína-oligosacárido Proteína-ADN Fig. 12. Microarrays de función e interacción de proteínas. Fuente: Joos, T. O. (2004). Microarray technology: an increasing variety of screening tools for proteomic research. Drug Discovery Today. Vol. 3 (1):24-31. Las aplicaciones comerciales de los microarrays una huella de la actividad celular de la kinasa, de función e interacción se centran en los arrays analizar los efectos y especificidad de sus de interacción enzima-sustrato y proteína- inhibidores, y determinar la actividad kinasa en proteína: una mezcla compleja de enzimas. Otra de las empresas que desarrollan microarrays enzima- • Arrays de interacción enzima-sustrato: la sustrato es Jerini AG50, que ha lanzado el búsqueda de sustratos para enzimas se ha PepstarTM peptide microarray, con diferentes centrado en gran medida en el desarrollo de aplicaciones como el screening de sustratos nuevas aplicaciones orientadas a la específicos de enzimas y de proteasas, la identificación de sustratos para proteínas optimización de los sustratos enzimáticos ya kinasas. Esta aplicación de los microarrays de conocidos, el estudio de las rutas de proteínas es de gran relevancia, ya que la transducción de la señal, la detección de las identificación de los sustratos de este tipo de actividades enzimáticas contaminantes, o el proteínas es un paso clave en la comprensión mapeado de las regiones inmunodominantes de de su función. Hasta ahora, este tipo de los antígenos. identificación resultaba muy lenta y costosa, además de carecer de la sensibilidad necesaria48. • Arrays de interacción proteína-proteína: esta estrategia está siendo comercializada por la compañía Protometrix Inc. y ofrece un amplio Entre las empresas que desarrollan microarrays abanico de posibilidades para el estudio de la de proteínas para estudiar la función de kinasas interacción entre fármacos y proteínas, o bien 49 48 49 50 se encuentra PepScan . Esta empresa ha el efecto de un determinado fármaco sobre las lanzado al mercado el PepChip® Kinase interacciones proteína-proteína con productos microarray que permite la selección del como el array que comercializa bajo el nombre sustrato óptimo para ensayos de alto de Yeast ProtoarrayTM PPI Proteome rendimiento, de manera que se pueda generar Microarray. Invitrogen (http://www.invitrogen.com). PepScan (http://www.pepscan.nl). Jerini AG (http://www.jerini.com). 36 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA 3.2.3. Microarrays de screening inverso de proteínas espectrometría de masas o bien mediante anticuerpos específicos. Mediante el screening inverso se inmovilizan lisados celulares que representan todo el repertorio de proteínas celulares en un determinado estadío celular. La interacción inespecífica de las proteínas con el soporte del microarray tiene lugar mediante interacciones electrostáticas, fuerzas iónicas o de Van der Waals. Las proteínas capturadas en estos tipos de arrays pueden ser identificadas mediante Gracias a estos microarrays es posible realizar un screening de todos los anticuerpos presentes en el suero de un paciente en busca de una determinada proteína diana. Las muestras de tejido inmovilizado o de células pueden ser empleadas para este tipo de ensayos. Estas técnicas tienen un enorme potencial en la detección de biomarcadores en análisis proteómicos. Lisado de proteínas (detección por EM) Lisado de proteínas (detección por anticuerpos) Células Tejidos Fig. 13. Microarrays de proteínas de screening inverso. Fuente: Joos, T. O. (2004). Microarray technology: an increasing variety of screening tools for proteomic research. Drug Discovery Today. Vol. 3 (1):24-31. La principal ventaja de este tipo de microarray reside en que las muestras inmovilizadas no requieren un paso previo de desnaturalización ni marcaje. Los microarrays de proteínas de screening inverso permiten la identificación de nuevos biomarcadores, el análisis de perfiles de expresión de proteínas y el perfilado temprano de la toxicidad y eficacia de fármacos potenciales. Empresas como Zeptosens AG51 ofrecen este tipo de plataformas de screening inverso, que en este caso emplea el nombre comercial de ZeptoMARKTM. 51 52 53 54 La empresa Ciphergen Biosystems Inc.52 también ha desarrollado tecnologías de screening inverso como SELDI53, que emplea espectrometría de masas como método de lectura. Mediante la comparación de los espectros de dos muestras diferentes se pueden identificar las proteínas que se expresan de manera diferencial a través de su masa molecular. La tecnología SELDI es muy apropiada para la detección rápida de las diferentes cantidades de proteína total en muestras diferentes, así como para la detección de proteínas pequeñas y péptidos, si bien su uso es limitado en proteínas de alto peso molecular o proteínas de membrana54. Zeptosens (http://www.zeptosens.com). Ciphergen (http://www.ciphergen.com). SELDI: desorción/ionización mediante láser asistida por matriz (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization). Joos, T.O. (2004) Microarray technology: an increasing variety of screening tools for proteomic research. Drug Discovery Today. Vol. 3 (1):24-31. 37 4. Microarrays de carbohidratos Los arrays de proteínas suministran una gran cantidad de información acerca de la función e interacciones de las proteínas que los arrays de ADN no pueden proporcionar. No obstante, los microarrays de proteínas no son suficientes para analizar las modificaciones post-traduccionales que sufren las proteínas, generalmente debidas a la unión covalente de azúcares en un proceso llamado glicosilación. Por otro lado, existe un amplio número de procesos celulares en los que están involucrados receptores de unión a azúcares, por lo que los microarrays de carbohidratos son una herramienta fundamental en el estudio de los procesos biológicos en los que están implicadas las proteínas de interés. Los carbohidratos o azúcares complejos están constituidos por mocosacáridos que pueden unirse de formas muy diversas, dando lugar a distintos tipos de oligosacáridos y polisacáridos con diferentes configuraciones y ramificaciones. Las interacciones entre proteínas y carbohidratos están implicadas en numerosos procesos biológicos de relevancia, que tienen lugar tanto en el interior como en el exterior de la célula. En los últimos años ha tenido lugar un desarrollo continuo de herramientas moleculares que permiten identificar estos oligosacáridos y las proteínas con las que interactúan, aumentando en gran medida la sensibilidad de los ensayos, principalmente gracias a la espectrometría de masas. Sin embargo, el progreso que han sufrido las técnicas relacionadas con la identificación de proteínas y ADN ha sido mucho mayor, por lo que el análisis de oligosacáridos clave es una asignatura pendiente. Una de las razones 55 56 57 principales radica en el hecho de que los oligosacáridos no pueden ser clonados ni amplificados, ya que son sintetizados por la acción conjunta de múltiples glicotransferasas y otras enzimas. Por otra parte, la cantidad de oligosacáridos que pueden ser aislados es generalmente muy limitada55. Existen dos categorías de microarrays de oligosacáridos en función del tipo de carbohidrato inmovilizado. Los primeros están compuestos por macromoléculas de tipo glicoproteínas y polisacáridos, inmovilizados sobre soportes como cristales cubiertos de nitrocelulosa o poliestireno. Estos microarrays tienen una aplicación directa en estudios serológicos con el fin de identificar interacciones con anticuerpos y otras proteínas. Este es el caso de microarrays de polisacáridos como el dextrano e inulina, empleados en análisis antigénicos de polisacáridos bacterianos. La principal desventaja de este tipo de microarrays de oligosacáridos radica en la imposibilidad de identificar la secuencia del oligosacárido una vez se ha producido la interacción. El segundo tipo de microarrays de carbohidratos está formado por monosacáridos como la N-acetilglucosamina, o disacáridos como la lactosa, celobiosa o manosa en forma de glucosaminas56. En este último tipo de microarrays, la inmovilización al soporte se consigue por medio de lectinas procedentes de plantas o anticuerpos modificados por medio de la enzima glicosiltransferasa. Una estrategia alternativa que sigue el Consorcio de Glicómica Funcional57 consiste en la biotinilización de oligosacáridos y su posterior anclaje a una superficie cubierta con estreptavidina. Fukui, S., et al. (2002). Oligosaccharide microarrays for high-throughput detection and specificity assignments of carbohydrate-protein interactions. Nature Biotechnology. Vol. 20: 1011-1017. Feizi, T., et al. (2003). Carbohydrate microarrays- a new set of technologies at the frontiers of glycomics. Current Opinion in Structural Biology. Vol. 13: 637-645. Consortium for Functional Glycomics, CFG, NIH (http://www.functionalglycomics.org/static/consortium). 38 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA Fig. 14. Espectrometría de masas para la identificación de los oligosacáridos Fuente: Consortium for Functional Glycomics, CFG, NIH. (http://www.functionalglycomics.org/static/consortium). Los neoglicolípidos58 son uno de los ejemplos de considerable de ellos con el objeto de estudiar la estos microarrays de carbohidratos. Los especificidad de anticuerpos y otras proteínas de neoglicolípidos inmovilizados en nitrocelulosa se unión a carbohidratos. Una alternativa a la síntesis han utilizado con proteínas específicas de unión a química consiste en la síntesis enzimática mediante carbohidratos para confirmar la predicción de las reacciones catalizadas por enzimas como las interacciones entre las proteínas y los glicosiltransferasas o glicosidasas. La ventaja de oligosacáridos59. esta técnica radica en que los sustratos que se utilizan en estas reacciones son naturales, mientras que su principal desventaja reside en la escasa 4.1. Diseño de un microarray de carbohidratos El elemento más importante a tener en cuenta a la hora de construir un microarray de carbohidratos reside en la obtención de monosacáridos u oligosacáridos puros. Los principales métodos de obtención de estos carbohidratos son la síntesis química o enzimática y la extracción de oligosacáridos a partir de fuentes naturales. La inmovilización de los oligosacáridos es el siguiente paso clave en el diseño de un microarray, y existen diversos procedimientos y soportes. disponibilidad de enzimas y su elevado coste60. 4.1.2. Aislamiento de oligosacáridos de fuentes naturales Los oligosacáridos con extremos reductores61 son ideales para la derivatización o modificación de sus grupos funcionales, necesaria en los procesos de inmovilización de carbohidratos. Estos oligosacáridos reductores pueden aislarse a partir de leche y orina tanto animal como humana, o bien pueden ser liberados de oligosacáridos mediante enzimas hidrolíticas específicas. La obtención de fragmentos de oligosacáridos a partir de los polisacáridos de plantas y bacterias también es posible mediante métodos químicos 4.1.1. Síntesis de oligosacáridos como la hidrólisis, acetolisis o degradación de Smith62. El aislamiento y purificación de A pesar de la dificultad de la síntesis química de oligosacáridos es un proceso muy laborioso que oligosacáridos debido a su complejidad estructural, implica la realización múltiples ensayos se ha conseguido sintetizar un número cromatográficos mediante HPLC63. 58 59 60 61 62 63 Los neoglicolípidos son oligosacáridos unidos a lípidos. Fukui, S., et al. (2002). Oligosaccharide microarrays for high-throughput detection and specificity assignments of carbohydrate-protein interactions. Nature Biotechnology. Vol. 20: 1011-1017. Feizi, T., et al. (2003). Carbohydrate microarrays- a new set of technologies at the frontiers of glycomics. Current Opinion in Structural Biology. Vol. 13: 637-645. Extremo reductor o libre (R): grupo funcional que en presencia de O2 tiene mucha tendencia a oxidarse (-OH, -NH, -SH), posibilitando la formación de nuevos compuestos y macromoléculas. Feizi, T., et al. (2003). Carbohydrate microarrays- a new set of technologies at the frontiers of glycomics. Current Opinion in Structural Biology. Vol. 13: 637-645. HPLC, High Performance Liquid Chromatography (Cromatografía líquida de alta resolución). 39 y lectinas. Las lectinas son grupo de proteínas de 4.1.3. Inmovilización de los carbohidratos origen no inmune presentes en la mayoría de los seres vivos, que comparten en común la La inmovilización de carbohidratos se puede llevar a cabo mediante dos estrategias, la inmovilización covalente y no covalente. La inmovilización no propiedad de unirse de forma específica y reversible a carbohidratos. Esta propiedad hace que las lectinas constituyan una herramienta muy valiosa para el estudio de la estructura de covalente inespecífica sobre placas de vidrio cubiertas de nitrocelulosa puede ser empleada con carbohidratos no modificados. Sin embargo, la membranas celulares, determinación de la patogenicidad de los microorganismos, tipaje de grupos sanguíneos, y estudio de otros procesos inmovilización de oligosacáridos mediante esta técnica es dependiente de la longitud de las cadenas de carbohidratos, siendo mayor la afinidad de oligonucleótidos de alto peso molecular por los soportes de nitrocelulosa. Ejemplos de carbohidratos inmovilizados no covalentemente son polisacáridos diversos, glicosaminoglicanos, glicoproteínas, o neoglicolípidos. La inmovilización covalente de carbohidratos se puede realizar tanto en soportes de cristal como de oro, que previamente han de ser funcionalizados mediante grupos tiol, maleimida o benzoquinona. La unión covalente entre estos grupos y los carbohidratos se realiza por medio de moléculas de enlace unidas a los extremos de los carbohidratos como los ciclopentanos y maleimidas64. de reconocimiento mediados por interacciones especificas de carbohidratos con receptores. Los principales ejemplos de microarrays de carbohidratos son los microarrays de antibióticos aminoglicósidos y los microarrays de manosa: • Los microarrays de antibióticos aminoglicósidos se han empleado en la determinación de las interacciones de los antibióticos con dianas terapéuticas y enzimas asociadas a resistencia frente a antibióticos. Esta herramienta es de gran utilidad, ya que permite acelerar el descubrimiento de nuevos antibióticos. • Los microarrays del monosacárido manosa han sido empleados en la caracterización de los carbohidratos que específicamente se unen a las 4.2. Aplicaciones de los microarrays de carbohidratos proteínas neutralizantes del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). Estos estudios podrían ser de gran relevancia para el desarrollo de vacunas anti-VIH basadas en carbohidratos65. La principal aplicación de los microarrays de carbohidratos es el descubrimiento de compuestos Un ejemplo de las diversas aplicaciones que un terapéuticos implicados en diversos procesos microarray de carbohidratos puede ofrecer se fisiológicos, desde la aparición de una respuesta encuentra en el producto comercial GlycoChip®, inmune hasta procesos inflamatorios o infecciosos desarrollado por la compañía israelí Glycominds. desencadenados por bacterias o virus. La mayoría Las aplicaciones de este microarray consisten en de los microarrays de carbohidratos han sido la identificación de nuevas proteínas con dominios empleados como sistemas modelo para la de unión a carbohidratos, y el cribado de investigación de interacciones entre carbohidratos anticuerpos frente a determinados glicanos. Fig. 15. GlycoChip® empleado en la identificación de las interacciones de glicanos con células T CD4. Fuente: Glycominds Ltd (http://www.glycominds.com). 64 65 Disney, M. & Seeberger, P. (2004). Carbohydrate arrays as tools for the glycomics revolution. Drug Targets Today: Targets. Vol. 3(4): 151-158. Seeberger, P. H., et al. (2004). Carbohydrate arrays as tools for the glycomics revolution. Drug Discovery Targets. Vol. 3 (4): 151-158. 40 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA 5. Microarrays de células Hasta la fecha, el análisis in vivo de la expresión que posteriormente expresan las proteínas génica se realizaba únicamente gen a gen, por codificadas por su secuencia. Una estrategia medio de la introducción de un gen en un célula, alternativa consiste en transfectar las células y la posterior observación de su efecto fisiológico inmovilizadas en el array con ARN interferente, de o fenotipo. Los microarrays de células permiten el modo que en vez de activarse la expresión de un análisis de la expresión génica in vivo a gran gen, se produzca el silenciamiento del mismo. Este escala en células humanas y animales. bloqueo de la expresión génica define un conjunto de puntos en el array que se corresponderán con la La estrategia empleada para su diseño consiste en expresión del fenotipo esperado. Las principales el cultivo de células sobre fragmentos de ADN técnicas de detección empleadas en los inmovilizados en un microarray. Estos fragmentos microarrays de células son la hibridación in situ, de ADN se transfectan o introducen en las células, inmunofluorescencia y autorradiografía. ADNc depositado en placa 1 3 2 Incubación de ADN con células de mamífero para su transfección Detección de las células transfectadas a partir del fenotipo Fig. 16. Diseño de un Microarray de células. Fuente: Howbrook, D. N., et al. (2003). Developments in microarray technologies. Drug Discovery Today Vol. 8 Nº 14:642-651. Aplicaciones de los microarrays de células • Identificación de dianas terapéuticas mediante la caracterización funcional a gran escala de productos génicos. • Evaluación de la especificidad de fármacos candidatos. • Identificación de las proteínas de unión en aquellos fármacos con mecanismos de acción desconocidos o bien identificados mediante análisis basados en fenotipo. • Análisis de pérdida de función mediante ARN interferente66. 66 El ARN de interferencia (ARNi) es una tecnología que se basa en el empleo de moléculas cortas de ARN de cadena sencilla o doble para bloquear la expresión de genes específicos. El mecanismo del ARNi está presente en la naturaleza como una respuesta celular innata que permite combatir las infecciones virales regulando la expresión del ARN. 41 Los microarrays de células ofrecen varias ventajas de modificación transcripcional necesarios para el frente a los microarrays de proteínas, debido a la correcto funcionamiento de las proteínas, como heterogeneidad de estas últimas y a la dificultad por ejemplo proteínas de membrana, un tipo de para mantener su estabilidad. El empleo de diana muy común. Los microarrays de células microarrays de células evita estos problemas, transfectadas tienen una serie de ventajas sobre además de permitir que tengan lugar los procesos otros métodos convencionales de expresión67: Principales ventajas de los microarrays de células • Miniaturización, automatización y multiplexado del ensayo. • Permite el empleo de diversos métodos de detección. • Emplean los mismos arrayers robóticos que los microarrays de ADN y por ello pueden llegar a densidades de hasta 6.000-10.000 clusters de células por soporte. • Posibilidad de inmovilizar células en el array, permitiendo la detección de fenotipos transitorios tales como cambios en la concentración de una determinada sustancia. • Las proteínas son sintetizadas por las células inmovilizadas en el array, aumentando la probabilidad de adquirir las necesarias modificaciones post-traduccionales. Principales limitaciones de los microarrays de células • El fenotipo observado debido a la transfección transitoria de las células puede no corresponderse con la función celular del gen in vivo. • Sólo es posible realizar esta técnica en células con eficiencias de transfección mayores del 1%. • Requiere el diseño previo de colecciones de ADNc. Cabe destacar el diseño de colecciones de ADNc como una limitación importante a la hora de elaborar arrays de células de alta densidad. Actualmente existen distintas iniciativas en marcha para la creación de colecciones de ADNc a partir del genoma humano68. 67 68 Sabatini, D. M. and Ziauddin, J. (2001). Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature. Vol. 411: 107-110. Bailey, S. N., et al. (2002). Applications of transfected cell microarrays in high-throughput drug discovery. DDT Vol. 7, Nº 18 (Suppl.): 1-6. Harvard Institute of Proteomics, Boston, MA, USA (http://www.hip.harvard.edu/research.html). Mammalian Gene Collection, MGC (http://mgc.nci.nih.gov/). 42 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA 6. Microarrays de tejidos Los microarrays de tejidos (TMAs, Tissue del análisis de tejidos de los pacientes Microarrays) constituyen una de las más recientes participantes en ensayos clínicos. Los métodos novedades en el campo de los biochips. Consisten empleados hasta el momento en el análisis y en colecciones miniaturizadas de hasta 1.000 caracterización de tal cantidad de muestras de muestras de tejidos inmovilizadas sobre un tejidos hacían que el proceso de descubrimiento y soporte, que permiten el screening de ADN, ARN desarrollo de fármacos fuera largo, de alto coste y y proteínas. Prácticamente la mayoría de los con una difícil estandarización. La tecnología de artículos publicados sobre microarrays de tejidos microarrays de tejidos permite el análisis in situ a están relacionados con el análisis de tumores, gran escala de muestras de tejidos70 y aunque aunque se ha demostrado su valor en otro tipo de básicamente se emplea en estudios relacionados patologías relacionadas con el sistema nervioso69. con el cáncer, son de gran utilidad en cualquier tipo de patologías en los que se necesitan El proceso de desarrollo de fármacos está muestras de tejidos como es el caso de estudios compuesto por una serie de etapas que requieren con tejido nervioso. Ventajas derivadas del empleo de microarrays de tejidos • Estandarización de los ensayos clínicos y moleculares en tejidos. • Pueden someterse a un amplio rango de técnicas (tinción histoquímica e inmunológica, hibridación in situ). • Requerimiento de pequeñas cantidades de reactivos. Limitaciones derivadas del empleo de microarrays de tejidos • La cantidad de tejido empleada podría no ser representativa del tejido del que deriva (ej. Displasias y carcinomas in situ). • Requiere material de partida fijado en formol e incluido en parafina. Según se muestra en la figura 17, la construcción de un microarray de tejidos requiere la extracción previa de muestras de tumor en forma de pequeños cilindros de 0,6 mm de diámetro que posteriormente se insertan en las cavidades a medida de un bloque de parafina. La transferencia de estas secciones de tejido a una placa se facilita mediante el empleo de láminas adhesivas. 69 70 Sauter, G., et al. (2003).Tissue microarrays in drug discovery. Nature Review: Drug discovery 2: 962-972. Hillan, K., et al. (2003). Tissue microarrays in drug discovery. Nature Reviews in Drug Discovery. Vol. 2 (962-972). 43 b c e a d Fig. 17. Diseño de un microarray de tejidos. Fuente: Hillan, K., et al. (2003). Tissue microarrays in drug discovery. Nature Reviews in Drug Discovery. Vol. 2 (962-972). Una de las posibilidades que ofrecen los microarrays de tejidos es su combinación con microarrays de ADNc para la validación de los resultados obtenidos con estos últimos. De esta manera, se pueden obtener perfiles de expresión mediante microarrays de tejidos para aquellos genes que se expresen de manera diferencial en tejidos sanos y enfermos. Aplicaciones de los microarrays de tejidos en combinación con microarrays de ADNc: • Determinación de la distribución celular y subcelular de las dianas moleculares. • Integración de la información obtenida a nivel de ADN, ARN y proteína sobre una misma diana molecular. • Validación in vivo de los resultados obtenidos del análisis de líneas celulares o de modelos animales de enfermedades en muestras de tejidos de pacientes. • Extensión de los resultados obtenidos del análisis de un número limitado de arrays de ADNc a una cohorte epidemiológicamente representativa mediante arrays de tejidos. • Exploración de la prevalencia de las potenciales dianas en diferentes estados de progresión del tumor. • Correlación de los datos moleculares con evidencias clinicopatológicas de los pacientes. 44 Ventajas • Requieren pequeñas cantidades de reactivos. • Amplio rango de técnicas de detección (tinción histoquímica e inmunológica, hibridación in situ). • Estandarización de los ensayos clínicos y moleculares en tejidos. • Análisis de proteínas que sufren modificaciones posttranscripcionales. • Detección de fenotipos transitorios (ej. cambios en la concentración). • Empleo de diversos métodos de detección. • Miniaturización, automatización y multiplexado del ensayo. • Análisis de las modificaciones post-traduccionales de glicosilación que sufren ciertas proteínas. • Análisis de proteínas que sufren modificaciones posttranscripcionales. • Análisis proteómico funcional. • Análisis de expresión génica, genotipado, e hibridación genómica comparada. • Estandarización y amplio desarrollo de la técnica. Tabla 8. Ventajas y desventajas de los distintos tipos de microarrays. Fuente: Elaboración propia. Microarrays de tejidos Microarrays de células Microarrays de carbohidratos Microarrays de proteínas Microarrays de ADN Tipos de microarrays Desventajas • Requiere material de partida fijado en formol e incluido en parafina. • La cantidad de tejido empleada podría no ser representativa del tejido del que deriva. • Requiere el diseño previo de colecciones de ADNc. • Eficiencia de transfección necesaria mayor del 1%. • El fenotipo observado debido a la transfección transitoria de las células puede no corresponderse con la función celular del gen in vivo. • La cantidad de oligosacáridos que pueden ser aislados es generalmente muy limitada. • Los oligosacáridos no pueden ser clonados ni amplificados. • Menor desarrollo que otros tipos de microarrays. • Detección no uniforme de las interacciones entre proteínas. • Fenómenos de reactividad cruzada. • Deshidratación de las proteínas • Detección específica de proteínas. • Disponibilidad de proteínas y anticuerpos específicos. • Requieren de moléculas adaptadoras para anclar las proteínas al soporte. • Dependencia de la calidad y cantidad de información existente para el diseño de las sondas. • No permiten analizar proteínas que sufren modificaciones post-transcripcionales. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS DISTINTOS TIPOS DE MICROARRAYS APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA 45 7. Aplicaciones de los microarrays en salud humana Las principales aplicaciones de las tecnologías de microarrays en salud humana son muy diversas y están interrelacionadas entre si, pudiéndose emplear clasificaciones que hacen referencia a los usuarios de la tecnología (industria farmacéutica, clínica o académica), o bien al tipo de estudio que se puede llevar a cabo (genotipado o expresión génica). Para los propósitos del presente informe, las aplicaciones de los microarrays se han dividido en cinco sectores que se corresponden con la identificación de dianas terapéuticas, descubrimiento y desarrollo de fármacos, diagnóstico clínico, farmacogenómica y farmacogenética, e investigación básica. 7.1. Identificación de dianas terapéuticas La comparación de los niveles de expresión de genes en tejidos enfermos y sanos permite la identificación de genes implicados en enfermedades de interés, así como la asociación con las proteínas que forman parte del proceso patológico. Esta información es imprescindible para el desarrollo de fármacos que actúen bloqueando o modulando los mecanismos moleculares de la enfermedad. Las técnicas de análisis de la expresión génica mediante microarrays de ADN se emplean en la identificación de nuevas dianas terapéuticas, como parte de las primera etapas del proceso de investigación en la industria farmacéutica. El estudio de interacciones proteína-proteína es también otra de las estrategias tenidas en cuenta, para la cual los microarrays de proteínas son de gran utilidad. Descubrimiento de dianas Identificación de dianas Validación de dianas Descubrimiento de fármacos Selección de compuestos Optimización de compuestos Desarrollo de fármacos Fase Preclínica Fase Clínica Fig. 18. Fases principales del desarrollo farmacológico. Fuente: Whittaker P. A. (2003). What is the relevance of bioinformatics to pharmacology? Trends In Pharmacological Sciences, 24 (8):434-439. 46 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA 7.2. Descubrimiento y desarrollo de fármacos El proceso de descubrimiento y desarrollo de fármacos se ha beneficiado del uso de herramientas genómicas de alto rendimiento como los microarrays de ADN, que hacen posible el análisis de la expresión génica en miles de muestras simultáneamente. El empleo de biochips permite analizar de forma rápida los cambios de expresión génica que tienen lugar durante la administración de un fármaco, así como la localización de nuevas posibles dianas terapéuticas y efectos toxicológicos asociados. Por otra parte, los microarrays de carbohidratos poseen un papel fundamental en el descubrimiento de compuestos terapéuticos implicados en diversos procesos fisiológicos, desde la aparición de una respuesta inmune hasta procesos inflamatorios o infecciosos desencadenados por bacterias o virus. El objetivo principal de la toxicogenómica radica en el estudio de los cambios que se producen en el perfil de expresión génica como respuesta a sustancias tóxicas para el organismo. Los microarrays pueden ser utilizados por tanto en ensayos de toxicidad, seguridad y efectividad del fármaco candidato como parte integral de los estudios clínicos. Las principales ventajas del empleo de microarrays durante los estudios de toxicidad radica en que permiten reducir el empleo de animales en los ensayos clínicos y proporcionan una herramienta de gran utilidad en enfermedades complejas para los cuales no existen modelos animales disponibles. La determinación de la toxicidad de un fármaco durante las primeras fases del desarrollo farmacéutico permite ahorrar tiempo y dinero, de forma que sólo superen estas etapas preliminares los candidatos más adecuados. Fase I Test de seguridad en individuos sanos (30-100 indiv.) Fase II Test de seguridad e impacto en el estado patológico (cientos de pacientes) Fase III Fase IV Test de seguridad, impacto, dosificación y estudios comparativos (miles de pacientes) Tecnologías de microarrays ETAPAS DEL DESARROLLO DE UN FÁRMACO Monitorización del fármaco (estudios post-marketing) Fig. 19. Situación de los estudios toxicológicos en las distintas fases de ensayos clínicos que forman parte del proceso de desarrollo de fármacos. Fuente: Elaboración propia. 47 Por otra parte, la identificación de microorganismos patógenos (virus, bacterias, hongos o protozoos) mediante microarrays de ADN es de gran utilidad en el diagnóstico de patologías infecciosas y otra serie de aplicaciones relacionadas con la microbiología clínica71. Los microarrays de ADN pueden emplearse 7.3. Diagnóstico clínico El diagnóstico molecular de enfermedades se realiza principalmente mediante microarrays de ADN, que permiten el estudio de los posibles polimorfismos y la detección de mutaciones en genes complejos asociados a una enfermedad concreta. Por otro lado, los microarrays también se pueden emplear en el ámbito clínico para la diagnosis de diferentes tipos de tumores gracias a sus perfiles de expresión génica o patrones moleculares. El análisis de la expresión génica de los pacientes y la consiguiente identificación de patrones de expresión posee un impacto directo en el diagnóstico molecular del cáncer. De esta forma, cuanto mayor sea la capacidad para clasificar un tumor determinado, se dispondrá de mayor información acerca de la biología y el pronóstico del tumor. en la detección simultánea de un amplio número de microorganismos, incluyendo bacterias, virus, parásitos y hongos. La finalidad del empleo de microarrays en microbiología abarca múltiples aplicaciones, que van desde la comprensión de la biología de los microorganismos, el estudio de los mecanismos de resistencia frente a antibióticos, la identificación de las cepas o serotipos, a la caracterización de nuevas dianas génicas con valor terapéutico. Tanto los análisis de SNPs como de expresión génica mediante microarrays de ADN permitirían identificar los mecanismos implicados en la resistencia de patógenos a ciertos agentes antimicrobianos72. EBV HHV-6 KSHV HIV-1 Amplificación por PCR Infection HTLV-1 HTLV-2 HCV Fabricación del chip Marcaje fluorescente Hibridación Aislamiento de ADN • Detección de secuencias virales y subtipos Detección de la señal y análisis Fig. 20. Aplicación de los microarrays en el diagnóstico de VIH. Fuente: Shieh, B. & Li, C. (2004). Multi-faceted, multi-versatile microarray: simultaneous detection of many viruses and their expression profiles. Retrovirology 26 May, 1:11. 71, 72 48 Doménech-Sánchez, A. & Vila, J. (2004). Fundamento, tipos y aplicaciones de los arrays de ADN en la microbiología médica. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 22(1):46-54. Bryant, P. A., et al. (2004). Chips with everything: DNA microarrays in infectious diseases. Lancet Infect. Dis. 4:100-111. APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA Es interesante señalar que no sólo los microarrays de ADN se emplean en las aplicaciones relacionadas con el diagnóstico, ya que los microarrays de proteínas muestran un gran potencial como herramientas de diagnóstico clínico en alergias humanas de distinta índole. Otra posible aplicación de este tipo de microarrays de proteínas es la posibilidad de desarrollar estudios de inmunogenicidad para su potencial aplicación en el desarrollo de vacunas. En este tipo de estudios se podrían inmovilizar diferentes epítopos73 y analizar que anticuerpos presentan una mayor respuesta, o bien analizar simultáneamente una gran cantidad de anticuerpos frente a un mismo antígeno. Principales aplicaciones de los microarrays en microbiología clínica: • Estudio epidemiológico molecular de microorganismos: identificación de los genes responsables de una menor patogenicidad en determinadas cepas de microorganismos. Ejemplo: Microarray de ADN con genes de 19 cepas diferentes de M. tuberculosis. • Diagnóstico microbiológico: la mayoría de los arrays empleados hasta le fecha en diagnóstico clínico consisten en arrays de baja densidad. Ejemplos: estos arrays se centran fundamentalmente en la detección de varias especies de un mismo género de bacterias (Staphylococcus sp. Pseudomonas sp.), presencia de parásitos infecciosos (Cryptosporidium sp.), o en el ámbito de la virología clínica, básicamente en su utilización en el genotipado del virus VIH. • Estudio de los mecanismos de acción y de resistencia a los agentes antimicrobianos: los microarrays de ADN se han empleado para el estudio del mecanismo de acción de ciertos compuestos frente a determinados microorganismos, así como en el análisis de la resistencia a antibióticos mediante detección de genes específicos o mutaciones. Ejemplo: Microarrays de ADN para la detección de resistencia a rifampicina en M. tuberculosis. 7.4. Farmacogenómica y farmacogenética El último objetivo de la farmacogenómica consiste en definir una enfermedad a nivel molecular de tal manera que las herramientas preventivas y terapéuticas de las que se disponga puedan Las estrategias de farmacogenética y farmacogenómica constituyen otras de las áreas de aplicación de los microarrays de ADN. La farmacogenética consiste en el estudio de las bases genéticas que influencian la respuesta individual a los fármacos, mientras que el término farmacogenómica es más amplio y se suele referir a frenar o mitigar los efectos de la enfermedad. Las aplicaciones clínicas de la farmacogenómica se encuentran dirigidas al empleo de estrategias terapéuticas más efectivas en función del perfil genómico del paciente, permitiendo identificar aquellos fármacos y dosificaciones de los mismos las aplicaciones comerciales de la tecnología para los cuales el paciente ofrece una respuesta genómica en el desarrollo de fármacos y terapia. La óptima. De la misma forma, es posible identificar combinación de los datos obtenidos a partir de la los medicamentos o concentraciones de los identificación de SNPs, junto con la información mismos que desencadenan reacciones de recopilada del estudio de perfiles de expresión toxicidad en algunos pacientes. Esta génica, permite establecer una correlación entre el estratificación de la enfermedad en función del genotipo y el fenotipo de un determinado individuo. genotipo del paciente, haría posible además la 73 Epítopo: región de la superficie de un antígeno que las moléculas de anticuerpos pueden identificar y a la cual se pueden fijar. Antígeno: Sustancia que el organismo reconoce como extraña y posiblemente perjudicial. 49 salida al mercado de nuevos fármacos, dirigidos a llevará a cabo a través de estudios de segmentos de la población para los cuales los epidemiología genética. medicamentos actuales no resultan eficaces. Por Otro de los usos más prometedores de los poblaciones permitirá conocer la predisposición microarrays consiste en el empleo de los patrones individual de cada persona a sufrir algún tipo de de expresión como predictores de la respuesta al enfermedad, antes incluso de que aparezcan los tratamiento. Se conocen datos confirmatorios en síntomas, permitiendo así la realización de una relación con el tratamiento de linfomas, leucemias mejor y auténtica medicina preventiva. Esto se agudas y cáncer de mama74. { último, el conocimiento del perfil genético de las ARNm Microarrays Subgrupo 1: gen inactivo Subgrupo 2: gen activo Distinto Genotipo Respuesta a fármacos, toxicidad, predisposición a desarrollar determinadas enfermedades, etc. Fig. 21. Tecnologías de microarrays de ADN aplicadas a la farmacogenómica. Fuente: Elaboración propia. 7.5. Investigación básica de servir como paso previo en el proceso de desarrollo de fármacos. Los microarrays de ADN permiten estudiar la función de los genes El estudio de la regulación de genes por medio de facilitando la identificación de aquellos que están microarrays de ADN ha proporcionado ingentes activados de forma diferencial cuando se cantidades de datos de gran valor para la comparan dos condiciones diferentes, como por identificación de genes involucrados en procesos ejemplo un tejido sano y otro afectado por algún patológicos, fisiológicos y de desarrollo, además tipo de patología. 74 Cigudosa, J. C. (2004).The microarray revolution in biomedical research: types of platforms, uses and perspectives in oncology .An. Sist. Sanit. Navar. 27 (1): 11-20. 50 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA Cultivos celulares Tejido sano Tejido enfermo ARNm Microarrays Distinta expresión génica Identificación de genes implicados en procesos biológicos de interés Fig. 22. Tecnologías de microarrays de ADN aplicadas a la investigación básica. Fuente: Elaboración propia. Este tipo de estudios se pueden complementar con microorganismos, tipaje de grupos sanguíneos, y análisis realizados mediante otros tipos de otros procesos de reconocimiento mediados por microarrays, como por ejemplo microarrays de interacciones especificas de carbohidratos con proteínas, anticuerpos, células o tejidos. Por otra receptores. Los microarrays de ADN también se han parte, los microarrays de carbohidratos ofrecen empleado en la investigación de patógenos grandes ventajas como sistemas modelo para la bacterianos, tanto de los factores de patogenicidad investigación de interacciones entre carbohidratos y del organismo, como de la respuesta de la célula lectinas. Éstas constituyen un grupo de moléculas hospedadora frente a la acción del microorganismo muy valiosas para el estudio de la estructura de (Ejemplo: Microarrays de ADN que contienen genes membranas celulares, patogenicidad de constituyentes del genoma de H. pylori75). APLICACIONES DE LAS TECNOLOGÍAS DE MICROARRAYS EN SALUD HUMANA Tipos de microarrays ADN Proteínas Carbohidratos Células Tejidos Identificación de dianas terapéuticas √ √ √ √ √ Descubrimiento y desarrollo de fármacos √ √ √ √ √ Fármacogenómica √ Diagnóstico clínico √ √ √ Investigación básica √ √ √ √ √ Tabla 9. Aplicaciones de las tecnologías de microarrays en salud humana. Fuente: Elaboración propia. 75 Doménech-Sánchez, A.; Vila, J. (2004). Fundamentos, tipos y aplicaciones de los arrays de ADN en la microbiología médica. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. Vol. 22 (1):46-54. 51 8. Barreras existentes para la implantación de los microarrays La técnica de microarrays cuenta con una serie de portabilidad. Algunos estudios recientes ya barreras a su desarrollo que, si bien durante los señalan la relevancia de la estandarización en la últimos años se está trabajando de manera activa utilización correcta de microarrays77. La FDA78 en solventarlas, no dejan de seguir siendo ha puesto en marcha en el año 2005 un importantes. proyecto denominado MAQC (MicroArray Quality Control Project)79, que pretende proporcionar a • Entre las principales limitaciones de los la comunidad científica herramientas de control microarrays está su precio, ya que pese al de calidad en microarrays. El objetivo último de descenso paulatino de su coste, sigue siendo este proyecto consiste en la elaboración de una una técnica cara que en muchos casos no guía de referencia que facilite la estandarización permite incorporarla como un análisis rutinario. del uso de microarrays, como complemento a la guía sobre farmacogenómica publicada a • En cuanto a las limitaciones técnicas, la comienzos del año 2005 por la misma agencia80. reproducibilidad de los arrays de expresión es la que más se cita entre los usuarios de esta • Hasta ahora, la cantidad de muestra tecnología. Hay que tener en cuenta que la necesaria para ser analizada era un factor variabilidad de los parámetros implicados en limitante, pero gracias a la aportación de estos análisis ha de ser mínima y la detección diferentes tecnologías de miniaturización como de pequeños cambios en la expresión de genes la microfluídica y la nanotecnología, el problema únicamente deberían ser atribuidos a la biología de la cantidad de muestra está reduciendo de la muestra en sí. En la actualidad existe la progresivamente su impacto. posibilidad de cuantificar la integridad del ADN, favoreciendo la fiabilidad y robustez de los • El Proyecto Genoma Humano ha permitido la microarrays. Varios estudios publicados en el construcción de mapas genéticos y físicos último año destacan el descenso de la detallados del genoma humano, así como variabilidad técnica entre las principales determinar su secuencia y localizar la posición de plataformas tecnológicas de microarrays de los genes que lo componen. Esta información ha ADN, lo que indica un mejor conocimiento de sido de gran valor a la hora de desarrollar esta tecnología y mayor experiencia en el microarrays de ADN, a pesar de que la anotación correcto uso de dichas herramientas76. incorrecta o incompleta de secuencias del genoma puede dar lugar a errores que pueden • Dado que es una tecnología que aún se 76 77 78 79 80 pasar desapercibidos. La anotación de secuencias encuentra en desarrollo, resulta difícil su va paulatinamente ganando en exactitud a medida estandarización, una necesidad que está que se dispone de más información, lo que favoreciendo el uso de microarrays de oligos permite no sólo identificar la secuencia, sino frente al ADNc por su mejor estandarización y además describir su función. Sherlock, G. (2005). Of fish and chips. Nature Methods 2:329-30; Irizarry, et al. (2005). Multiple-laboratory comparison of microarray platforms. Nature Methods 2: 345-50; Larkin et al. (2005). Independence and reproducibility across microarray platforms. Nature Methods 2: 337-44; Weis, B. K. (2005). Standardizing global gene expression analysis between laboratories and across platforms. Nature Methods 2:351-356. Michiels, S., et al. (2005). Prediction of cancer outcome with microarrays: a multiple random validation strategy. Lancet. 5-11;365(9458):488-92. FDA, Food & Drug Administration, USA (http://www.fda.gov/default.htm). MicroArray Quality Control (MAQC) Project (http://www.fda.gov/nctr/science/centers/toxicoinformatics/maqc). Guidance for Industry: Pharmacogenomic Data Submissions (2005). FDA, March. (http://www.fda.gov/cder/guidance/6400fnl.pdf). 52 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA • Por último, una característica inherente a las tecnologías basadas en microarrays es la gran cantidad de información que se genera a partir de ellas. El manejo de los datos obtenidos a partir de estos experimentos y su análisis posterior es uno de los mayores retos ante los que se enfrenta esta tecnología81. Para lograr superar esta barrera, se está avanzando considerablemente en el desarrollo de herramientas bioinformáticas entre las que podemos mencionar las técnicas de minería de datos como el clustering, el análisis estadístico, 81 los algoritmos genéticos, las redes neuronales, las herramientas de preprocesamiento de datos, la representación de modelos biológicos, la biología computacional o la minería de textos. Actualmente se está avanzando considerablemente en el desarrollo de herramientas bioinformáticas en el contexto de la genómica funcional, que permiten el almacenaje de información, agrupación de genes en base a una determinada característica, selección de características relevantes y su correlación. The ABRF MARG Survey 2005: Taking the Pulse of the Microarray Field. (http://www.abrf.org/index.cfm/group.show/Microarray.30.htm). 53 9. Perspectivas de mercado de los microarrays y biochips en salud humana Hace unos años las perspectivas de las tecnologías de microarrays y biochips auguraban un futuro prometedor en este campo, aunque todavía no se observaba una implantación generalizada de la técnica. La situación actual confirma estas previsiones al revelar un aumento exponencial en cuanto a las publicaciones relacionadas con microarrays y biochips, así como un crecimiento en las patentes concedidas en los últimos años, lo que demuestra alto interés comercial por las tecnologías de microarrays y biochips. Nº de publicaciones 12.000 8.000 4.000 0 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 Año 600 Nº de patentes 500 400 300 200 100 0 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 Año Fig. 23. Crecimiento del número de publicaciones y patentes relacionadas con microarrays y biochips. Fuente: Elaboración propia (datos obtenidos de PubMed, USPTO, esp@cenet). 54 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA Según datos publicados en octubre de 2004 por la valor de 875 millones de dólares para esta fecha, empresa consultora estadounidense Freedonia mientras que la demanda de productos Group82, la demanda de productos y servicios relacionados y servicios, tales como reactivos, relacionados con biochips está sufriendo instrumentación, software, soporte técnico y aumentos progresivos anuales desde el año 2003, contratación de servicios, completarán el total de que alcanzarán la cifra de 2.100 millones de los 2.100 millones de dólares. Las tendencias dólares en el año 2008. La demanda de detectadas por este estudio se resumen en el microarrays o biochips por separado tendrá un siguiente cuadro. Perspectivas de demanda de productos y servicios relacionados con biochips en el año 2008 (Freedonia Group, Inc.): • Los microarrays de ADN continuarán siendo los principales productos que generan la mayor demanda, aunque los microarrays de proteínas sufrirán una expansión mucho más rápida debido al crecimiento del campo de la Proteómica en los últimos años. • Los microarrays de alta sensibilidad y kits de procesamiento de muestras proporcionarán un valor añadido y oportunidades de crecimiento. • La demanda total para instrumentación de biochips se espera que alcance los 263 millones de dólares en el año 2008, con un crecimiento anual del 13% a partir del 2003. • Las oportunidades de crecimiento para la detección, preparación de muestras y equipamiento en hibridación continuarán expandiéndose debido a la diversificación de las investigaciones proteómicas. • La demanda de software especializado aumentará considerablemente ya que cada vez es más frecuente el empleo de programas sofisticados por parte de los investigadores. Estos programas son capaces de almacenar inmensas cantidades de datos procedentes de los microarrays, así como descifrar la complejidad de los perfiles de expresión de genes y proteínas. • Se prevé que el mercado relativo a los servicios relacionados con biochips crecerá a un ritmo del 19% anual a partir del 2003, alcanzando los 600 millones de dólares para el año 2008. • En cuanto a las labores de consultoría y contratos de investigación el crecimiento del 23% continúa situándolos en cabeza, debido principalmente a que las grandes compañías farmacéuticas contratan estas labores a terceros con mayor frecuencia. • Por último, las oportunidades de crecimiento de la demanda en soporte técnico y mantenimiento de instalaciones en microarrays se mantendrán en alza, como consecuencia de la renovación de instalaciones antiguas por otras más modernas. El crecimiento de la demanda de productos y servicios relacionados con biochips estará dirigido principalmente por las aplicaciones en descubrimiento de fármacos e investigación epidemiológica, siendo el análisis de proteínas y del perfil de expresión génica las técnicas que se expanden con mayor velocidad. 82 Debido a que el descubrimiento de fármacos sigue siendo la principal aplicación de los biochips, el mercado de la industria de los biochips está compuesto fundamentalmente por empresas farmacéuticas, biotecnológicas y grandes centros de investigación. Otros mercados secundarios como proveedores médicos, agencias gubernamentales de salud, medicina forense y agroalimentación, no serán tan relevantes, limitándose a aprovechar nichos de mercado en productos concretos. Freedonia Group, Inc. Freedonia Study “Biochips” (http://www.freedoniagroup.com/pdf/1854smwe.pdf). 55 10. Situación de la investigación y desarrollo en España en el área de microarrays aplicados a la salud humana Una de las principales aplicaciones de los uno de los ejemplos a resaltar. Este microarray ha microarrays de ADNc es el estudio de los niveles sido desarrollado a partir de la actividad de expresión de genes orientado a la investigadora de la Fundación de caracterización de tumores. Cabe destacar dentro Hipercolesterolemia Familiar con la de esta aplicación el esfuerzo llevado a cabo por colaboración del Departamento de Bioquímica y el Centro Nacional de Investigaciones Biología Molecular de la Universidad de Oncológicas (CNIO) para el desarrollo del Zaragoza, y con el soporte tecnológico de OncoChip83, que constituye la única plataforma Progenika-MedPlant. El Lipochip® constituye el de análisis de expresión génica múltiple primer test genético para el diagnóstico de la específicamente dedicada a cáncer que se fabrica Hipercolesterolemia Familiar y recoge 224 en España. El Oncochip representa alrededor mutaciones del gen que codifica el Receptor LDL, de 9.300 genes de las formas de cáncer más cuyo mal funcionamiento es el responsable de frecuentes y relevantes como el cáncer de mama, esta enfermedad. Gracias a la detección precoz de colorrectal, pulmón, linfomas, leucemia y tumores este tipo de enfermedad, se puede establecer un urinarios como el de riñón, vejiga o próstata. El tratamiento adecuado que reduce 80% de los genes representados en el Oncochip considerablemente los riesgos cardiovasculares han sido seleccionados por su función biológica asociados a esta enfermedad. directamente relacionada con procesos tumorales como angiogénesis, adhesión celular, apoptosis y En la misma línea de diagnóstico, la empresa metástasis, o por su expresión anómala en tejidos Progenika en colaboración con el Servicio de tumorales. El 20% restante son genes de interés Gastroenterología del Hospital Clínico de por su localización en regiones cromosómicas Barcelona ha desarrollado un chip de ADN capaz donde se detectan frecuentes alteraciones. El de analizar el diagnóstico y pronóstico de la empleo de este microarray en la caracterización Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII) a de tumores permitirá establecer la relación de los través del análisis de un panel de polimorfismos patrones de expresión génica de los distintos de nucleótidos (SNPs). En el caso del biochip para tipos de tumor con el comportamiento clínico de la EII, la información obtenida del análisis de los mismos, y definir criterios de tratamiento cada SNP aporta información sobre factores de diferenciado para cada tipo de tumor basados en riesgo distintos, como la agresividad de la su perfil de expresión génica. dolencia, la necesidad de cirugía o la localización de la patología a lo largo de todo el tracto En cuanto a la utilización de los microarrays de digestivo. Esta nueva herramienta genética ADNc en el diagnóstico, tratamiento y dirigida al diagnóstico de la colitis ulcerosa y la seguimiento de enfermedades, el Lipochip®84 enfermedad de Crohn, cuenta hasta el momento comercializado por Laboratorios Lácer, S.A. es con 46 genes relacionados con esta enfermedad. 83 84 CNIO OncoChip (http://bioinfo.cnio.es/data/oncochip). Lipochip® (http://www.meiga.info/documentos/lipochip.pdf). 56 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA Además de los genes de mayor importancia en la EII, como el PAI-1 (inhibidor de la activación del plasminógeno), el CRAD-15 o el HLA de clase 2, también se han incluido otros relacionados con la respuesta del organismo del paciente a los fármacos con los que se trata la patología gástrica, con el fin de valorar cómo reaccionan ante determinados tratamientos. En el anexo II y III se recogen las empresas españolas con productos y servicios de microarrays así como las empresas con desarrollos bioinformáticos aplicados a microarrays. Por otra parte, los principales proyectos de investigación llevados a cabo por grupos españoles se encuentran recogidos en el anexo IV del presente informe. El empleo de microarrays de ADN por parte de grupos de investigación españoles se ha visto potenciado por medio de iniciativas para el fomento del uso de estas tecnologías como la de Genoma España. Con esta convocatoria, se pretende incentivar el empleo de microarrays de ADN para medir la expresión de los genes gracias a la cofinanciación de Genoma España, que permite por tanto rebajar el precio final de las casas comerciales. De momento existen ya cuatro agrupaciones (Genochip, Aginet, AEMCES y CEMAB), que ofrecerán distintos servicios, aunque la convocatoria sigue abierta hasta noviembre del 2006. 57 “Convocatoria de ayudas para el fomento del uso de tecnologías microarrays de ADN para el análisis de expresión génica” (20 de diciembre de 2005) Objetivo y duración El objetivo de esta convocatoria de Genoma España es aumentar la competitividad de la investigación pública española en genómica, biomedicina y biotecnología mediante el incremento del consumo de microarrays para el análisis de expresión génica. Esta iniciativa ha supuesto un ahorro en los costes de un 40%. El plazo de presentación de solicitudes comienza el 15 de noviembre de 2004 y la convocatoria se mantiene abierta hasta el 14 de noviembre de 2006. Situación económica Genoma España dispone de 1.000.000 de euros para el presente año. Entre las cuatro agrupaciones se han requerido un total de 1.490.878 euros y a cada una se le ha concedido la cantidad que ha solicitado contra justificación de los servicios prestados. El reparto de la cantidad total es el siguiente: Agrupación Primeros seis meses Total anual GENECHIP AGINET AEMCES CEMAB 386.900,00 € (1.250 servicios) 139.860,00 € (600 servicios) 120.000,00 € (400 servicios) 98.679,00 € (378 servicios) 773.800,00 279.720,00 240.000,00 197.358,68 € € € € Participantes Agrupación Genechip (empresa proveedora: Affymetrix Co.) • Centro de Investigación del Cáncer de Salamanca (CIC). • Institut d´Investigacions Biomédiques August Pi i Sunyer, Hospital Clinic de Barcelona (IDIBAPS). • Centro Nacional de Biotecnología de Madrid (CNB-CSIC). • Facultad de Medicina de Valencia. Universidad de Valencia (UVEG). • Asociación Genika de Bilbao (GENIKA) • Parque Científico de Madrid. Universidad Complutense de Madrid (PCM-UCM) • Institut de Recerca. Hospital de la Santa Creu i Sant Pau de Barcelona (IR- HSCSP). • Institut de Recerca del Vall d’Hebron de Barcelona (IR-HUVH). Agrupación Aginet (empresa proveedora: Agilent Technologies) • Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas de Madrid (CNIO). • Centro de Regulación Genómica de Barcelona (CRG). • Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares de Madrid (CNIC). • Hospital Clínico San Carlos de Madrid (HCSC). • Oryzon Genomics de Barcelona (ORYZON). • Fundación Gaiker de Vizcaya (GAIKER). • Dominion Pharmakine, SL de Vizcaya (DPK). • Parque Científico de Barcelona (PCB). Agrupación Aemces (empresa proveedora: Amersham Biosciences, ahora parte de General Electric Healthcare) • Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares de Madrid (CNIC). • Instituto de Investigaciones Biomédicas de Madrid (IIB-CSIC). • Centro de Investigaciones Biológicas de Madrid (CIB-CSIC). • Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Universidad Autónoma de Madrid (CBM-CSIC). Agrupación Cemab • Centro Nacional de • Centro Nacional de • Institut de Recerca (empresa proveedora: Applied Biosystems, en España, Applera Hispania) Investigaciones Cardiovasculares de Madrid (CNIC) Investigaciones Oncológicas (CNIO) Biomédica- Parc Cientific de Barcelona (IRB-PCB). Coordinadores: • Dr. Xosé Ramón García Bustelo del Centro de Investigación del Cáncer de Salamanca (CIC) coordina la agrupación Genechip que utiliza la tecnología de Affymetrix. • Dr. Miguel Ángel Piris del Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO) coordina la agrupación Aginet que utiliza la tecnología de Agilent Technologies. • Dra. Ana Dopazo del Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) que coordina las agrupaciones Aemces y Cemab bajo las tecnologías Amersham Biosciences y Applera Hispania respectivamente. 58 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA 11. Conclusiones La situación actual de las tecnologías de microarrays y biochips con aplicaciones en salud humana ha cambiado considerablemente en España y resto del mundo respecto a los últimos años, tanto en el entorno investigador como en el empresarial. Las promesas que surgieron hace unos años respecto a esta tecnología se han cumplido con creces, y hoy por hoy supone una herramienta imprescindible en cualquier proyecto de genómica y proteómica. Resulta de especial importancia no sólo el mayor número de proyectos de investigación que emplean estas tecnologías en España, sino las diferentes aplicaciones que han surgido de ella. Las tres grandes áreas donde los microarrays están cobrando cada vez mayor relevancia son el diagnóstico molecular, farmacogenética, y el desarrollo de fármacos. En el caso del diagnóstico molecular, los microarrays se emplean en la clasificación de enfermedades, mejorando el pronóstico en patologías como el cáncer. En las aplicaciones dirigidas a farmacogenómica y desarrollo de fármacos, los microarrays ofrecen la posibilidad de diseñar tratamientos personalizados con fármacos dirigidos a grupos específicos de pacientes, ya que mediante el análisis del perfil de expresión de cada tumor individual se puede anticipar la respuesta a un determinado tratamiento. Gracias a las posibilidades que ofrecen estas aplicaciones han surgido grandes proyectos de genotipado en España para el estudio de patologías como el cáncer, enfermedades psiquiátricas y cardiovasculares. El panorama actual en cuanto al acceso de la tecnología es muy diferente, y la mayoría de centros de investigación españoles disponen de infraestructuras de apoyo que permiten el empleo de los microarrays. Además, existen iniciativas públicas como la convocada por Genoma España para aumentar la competitividad de la investigación pública en genómica, biomedicina y biotecnología gracias al aumento del consumo de este tipo de herramientas. Esta iniciativa ha dado como resultado la creación de cuatro agrupaciones para el fomento del uso de tecnologías microarrays de ADN para el análisis de expresión génica (GeneChip, Aginet, Aemces y Cemab) con diferentes empresas líder en este campo como proveedoras de la tecnología. En cuanto al entorno empresarial, el gran interés de las industrias farmacéuticas por los microarrays reside en la posibilidad que ofrecen para agilizar el proceso de descubrimiento de fármacos, desde su contribución a la identificación y validación de potenciales dianas terapéuticas, hasta la validación de nuevos fármacos facilitando los ensayos de toxicidad. A este hecho se suma la posibilidad de realizar estudios a gran escala de genes en mucho menor tiempo maximizando los recursos disponibles. Existe actualmente una auténtica carrera tecnológica entre las empresas por posicionarse como líderes de esta tecnología, y las empresas que en España surgen en este entorno tienden a ser proveedoras de servicios o buscan nichos de mercado a los que dirigirse con productos muy específicos como el Hepatochip, Onchochip o Lipochip entre otros. En cuanto al almacenamiento y procesado de información por medio de herramientas bioinformáticas, todavía no se ha superado este cuello de botella, que por otro lado es el campo que muestra mayor producción de I+D a nivel mundial. Iniciativas nacionales ya en marcha como el Instituto Nacional de Bioinformática (INB), deben contribuir a generar y aplicar soluciones bioinformáticas de proyectos de investigación con un enfoque genómico y proteómico. Por último, es preciso que se haga un esfuerzo global para propiciar la puesta en marcha de proyectos multidisciplinares, que no consistan meramente en la adquisición de tecnologías de microarrays a gran escala, sino en proyectos enfocados hacia intereses estratégicos para la industria y la comunidad científica. 59 Glosario • ADNc: ADN complementario que ha sido sintetizado a partir de un ARN-mensajero. • Análisis de expresión génica: identificación de los genes que se expresan de manera diferente en la célula y cuantificación de los niveles de expresión de aquellos genes de especial relevancia en funciones celulares como metabolismo, transporte o desarrollo entre otros. Los análisis de expresión permiten establecer relaciones entre los perfiles genéticos de pacientes y respuestas a fármacos o agentes tóxicos que actúan, alterando la función celular. • Expresión génica: fenómeno que incluye la transcripción de un gen en ARN mensajero y su posterior traducción a proteína. • Farmacogenética: estudio de la respuesta a un determinado fármaco como consecuencia de la herencia genética del paciente. • Farmacogenómica: estudio de la importancia que presentan las variaciones genéticas en la eficacia y toxicidad de los fármacos. • Aptámero: moléculas de ADN o ARN capaces de reconocer y unirse a una molécula específica (proteína u otro ligando). • Fotolitografía: técnica de fabricación de un microarray de ADN que se basa en la unión de nucleótidos protegidos por un agente químico fotodegradable sobre un soporte de vidrio que posee determinados grupos reactivos. • ARN de interferencia: tecnología que se basa en el empleo de moléculas cortas de ARN de cadena sencilla o doble para bloquear la expresión de genes específicos. • Genómica funcional: disciplina que estudia la relación existente entre un gen y su función, de manera que permita comprender el funcionamiento de los sistemas biológicos. • ARN mensajero: molécula de ARN que proviene de la transcripción de un gen que codifica una proteína, después de experimentar un proceso de corte y empalme. La información codificada en la molécula de ARNm se traduce a un producto génico en los ribosomas. • Glicosilación: proceso químico por el que se añaden cadenas de azúcares a una proteína. • bDNA (branched DNA o ADN ramificado): el ADN ramificado contiene múltiples cadenas ramificadas a manera de árbol y cada una de estas ramas es un sitio de hibridización con una sonda marcada con una enzima, que reacciona con un sustrato que permite la demostración colorimétrica o quimioluminiscente. • Carbohidrato: término general utilizado para denominar a los azúcares y compuestos relacionados que contienen carbono, hidrógeno y oxígeno, habitualmente con la fórmula empírica (CH20)n. 60 • Hibridación: proceso por el cual dos hebras sencillas complementarias de polinucleótidos se asocian para formar una doble hélice. • Microarray: conjunto de moléculas de ADN, proteínas, hidratos de carbono, muestras de tejidos o células, inmovilizadas sobre una superficie sólida que nos permite el estudio de niveles de expresión génica a nivel genómica, función, modificaciones post-traduccionales de proteínas o de los niveles de expresión génica in vivo, respectivamente. • Oligosacáridos: grupo de hidratos de carbono de cadena corta (de 2 a 8 unidades de Carbono). APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA • PCR (“polymerase chain reaction” o “reacción en cadena de la polimerasa”): sistema de amplificación genética que permite obtener millones de copias de un determinado fragmento de ADN o ARN mensajero, incluso a partir de muestras muy reducidas. • PNA (“Peptide Nucleic Acid” o “Ácido Nucléico Peptídico”): análogo artificial del ADN en el que el esqueleto no es azúcar y fosfato, sino entidades similares a péptidos o proteínas. • Proteoma: conjunto de proteínas que se expresan en un momento concreto en un determinado tejido u organismo. • Toxicogenómica: disciplina que estudia las bases genéticas que permiten explicar los mecanismos de toxicidad en respuesta a fármacos o compuestos tóxicos. • Transcriptoma: conjunto de mRNAs que a partir de un genoma se pueden sintetizar en un momento concreto en un determinado tejido. • Validación de dianas: proceso que tiene por objeto demostrar que una determinada diana molecular está implicada en la aparición y progresión de una enfermedad. La validación de una diana permite establecer una relación entre la modificación de la diana y su potencial terapéutico. • Screening: término inglés derivado de la palabra “screen” o “pantalla” cuyo significado, dentro del campo de la biología molecular o la biotecnología se refiere al seguimiento o la monitorización de un proceso. • Sonda: segmento de material biológico marcado radioactivamente (o con algún grupo químico fácilmente visualizable), utilizado para detectar secuencias de ácidos nucleicos o proteínas complementarios mediante hibridación. 61 Anexos Anexo I: Principales aplicaciones de los microarrays disponibles comercialmente PRINCIPALES APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS DE ÁCIDOS NUCLEICOS DISPONIBLES COMERCIALMENTE Empresa Producto Características StaphyChips™ Microarray para la detección de las secuencias de ADN de las 5 especies más importantes de Staphylococcus, así como para la detección de resistencia a antibióticos beta-lactámicos Rat HepatoChips Determinación del patrón de genes expresados en cultivos de hepatocitos incubados en presencia de compuestos químicos o contaminantes ambientales Lymphochip Clasificación molecular de linfomas GeneChip® Porcine Genome Array Análisis del transcriptoma completo del cerdo doméstico GeneChip® Maize Genome Array Análisis del transcriptoma completo del maíz Zea mays MammaPrint® Análisis del riesgo de metástasis en cáncer de mama CupPrint® Análisis del perfil genético para localización del tumor primario en pacientes diagnosticados con cáncer de localización primaria desconocida Agilent G4130A Microarray para el screening del genoma de rata y estudios toxicogenómicos para la determinación de los efectos en el organismo de una sustancia tóxica, fármaco o pesticida Human 1B Oligo Microarray Análisis de expresión génica en desarrollo de fármacos y estudio de enfermedades Rice Oligo Microarray Kit 60-meR Determinación de la actividad de genes en arroz y cereales. Identificación de variedades con alta tolerancia a sequía, salinidad, frío o pestes para sembrar en terrenos poco cultivables BioDoor4000 Análisis de expresión de 4.000 genes humanos completos BiodoorHCV Diagnóstico de Hepatitis C BioForce Nanosciences, Inc. ViriChip™ Perfil de expresión de ARN y detección de virus Canberra LLC IntelliGene™ Análisis de Arabidopsis, cáncer humano, citoquinas humanas, disrupción endocrina, ORF, ratón y E. coli Advanced Array Technology SA Affymetrix, Inc. Agendia Agilent Technologies, Inc. BioDoor Gene Technology Ltd. 62 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA Empresa DR. Chip Biotechnology Inc. Producto Características DR. EV™ chip Diagnóstico de enterovirus DR. BLAD™ Chip Detección de las mutaciones del gen responsable de la Deficiencia de Adhesión Leucocitaria Bovina DR. Mastitis™ Chip Detección de S. agalactiae, S. aureus, S. bovis, S. uberis, S. dysgalactiae, y E. coli DR. Food Pathogen Chip Detección de Salmonella spp., E. coli, y Staphylococcus aureus DR. HBV™ Chip Detección de hepatitis B virus en suero e identifica genotipos de HBV A, B, C, D, E, F y dos variantes resistentes a amivudina: YIDD y YVDD DR. RV IVD Kit Detección de infección por coronavirus (SARS) DR. Milk Kit18 Detección de siete agentes causantes de mastitis Streptococcus spp., S. agalactiae, S. bovis, S. ysgalactiae, S. uberis, Escherichia coli, and S. aureus DR. EV IVD Kit Detecta infección por enterovirus sin reactividad cruzada entre adenovirus, herpes simplex virus tipo I y tipo II, citomegalovirus humano Detecta género enterovirus y dos serotipos: enterovirus 71 y coxsackie A16 DR. Food Kit Detecta nueve de los patógenos más comunes en alimentos: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Listeria BassChip® EcoArray, L.L.C. Fathead MinnowChip® Análisis de la expresión de genes de importancia toxicológica DualChip™ human general Análisis de expresión génica diferencial en humanos DualChip™ human aging Análisis de expresión génica diferencial en genes humanos relacionados con el estrés y el envejecimiento DualChip™ rat GPCR Análisis de expresión génica diferencial de los genes GPCR de rata DualChip™ hepato microarray series Patrones de expresión génica de genes importantes toxicológicos en células de hígado de rata Eurogentec GEArray® Análisis de expresión de genes involucrados en rutas de señalización Genomic Health Oncotype DX™ Análisis de probabilidad de recurrencia de cáncer de mama tras tratamiento con tamoxifeno Eppendorf AG 63 Empresa GeneMaster Lifesciences Co. Ltd. GeneScan Europe AG Greiner Bio-One GmbH/Lambda GmbH Icoria, Inc. Producto GeneMaster MegiC” Diagnóstico de meningitis GMOChip Detección de organismos modificados genéticamente en alimentos NUTRI®Chip Presencia de bacterias patogénicas en alimentos ParoCheck™ I Identificación y detección cualitativa de ADN de patógenos periodontales CarnoCheck® Identificación y detección cualitativa de 8 especies animales en alimentos y piensos PapilloCheck® Tipaje de 17 papilomavirus humanos (HPV) involucrados en cáncer cervical ParoCheck™ I Detección cualitativa e identificación de ADN de patógenos periodontales PapilloCheck® Tipaje de 17 tipos de papilomavirus humanos involucrados en cáncer cervical CarnoCheck® Food and feed DNA-C Identificación y detección cualitativa de 8 especies animales en alimentos y piensos Magnaporthe grisea microarray Detección del patógeno del arroz Magnaporthe grisea DermArray™ GeneFilters® IntegriDerm PharmArray® Ipsogen, Luminy Biotech Entreprises Iris BioTechnologies, Inc. Lácer Memorec Biotec GmbH 64 Características Análisis de expresión de genes involucrados en enfermedades epiteliales y dermatológicas MLL Fusionchip Detección de reordenamientos de MLL en leucemia aguda y la determinación del gen asociado ProfileChip Biochip para el estudio de cáncer Genetic Profiling Microarray™ Detecta deleciones y amplificaciones del número de copias y mutaciones puntuales BioPharma™ GPM System Descubrimiento y desarrollo de fármacos LipoChip® Detección de mutaciones del receptor LDL asociadas a Hipercolesterolemia Familiar PIQOR™ Immuno/Onco, human and mouse Análisis de expresión de 1.076 genes relacionados con respuesta inmune, matriz extracelular, muerte celular, y transducción de señales PIQOR™ Cytokines & Receptors, human and mouse Análisis de expresión de 288/274 genes de citoquinas y receptores PIQOR™ Cell death, human and mouse Análisis de expresión de 500/509 genes involucrados en muerte celular PIQOR™ Kinase, human and mouse Análisis de expresión de 498/481 genes de kinasas PIQOR™ Toxicology, human and rat Análisis de expresión de 1.252/1.107 genes involucrados en citotoxicidad APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA Empresa Mergen Ltd. NEN Life Science Products Inc. Operon GmbH Origene Technologies, Inc. Producto Características ExpressChip™ Perfiles de expresión de diferentes categorías de genes: apoptosis, ATPasa, GTPasa o ATP, proteínas de unión a GTP, canales, citoesqueleto, asociados a enfermedades, transducción de señales, factores de transcripción, supresores de tumores MICROMAX™ Human Oncogenes and Tumor Suppressor Genes Array Análisis de la expresión de oncogenes y genes supresores de tumores MICROMAX™ Human Kinase & Phosphatase Array Análisis de la expresión de genes de quinasas y fosfatasas MICROMAX™ Human transcription factor array Análisis de expresión de genes de factores de transcripción MICROMAX ™ Human Ion Channel, Transporter & Receptor Array Análisis de expresión de genes de canales de iones, transportadores y receptores OpArray® Human collagen Array Análisis de expresión de genes de colágeno OpArray® Human Apoptosis Array Análisis de expresión de genes involucrados en apoptosis OpArray® Human Stress y Aging Array Análisis de expresión de genes involucrados en estrés y envejecimiento OpArray® Yeast collage Array Análisis de expresión de genes de levadura SensiChip Human Kinase Análisis de expresión de genes de quinasas Smart set 1 Análisis de expresión de genes receptores nucleares de hormonas y correguladores Smart set 2 Análisis de expresión de genes factores de transcripción Homeobox/bZIP/bHLH Smart set 3 Análisis de expresión de genes factores de transcripción inducibles/específicos de tejido Smart set 4 Análisis de expresión de genes tirosinquinasas y fosfatasas Smart set 5 Análisis de expresión de genes proteínas G y receptores acoplados a proteína G Smart set 6 Análisis de expresión de genes de canales de iones Smart set 7 Análisis de expresión de genes de proteínas de transportadores Smart set 8 Análisis de expresión de genes de proteinasas Smart set 9 Análisis de expresión de genes de citoquinas, quimioquinas y receptores Smart set 10 Análisis de expresión de genes de moléculas de adhesión 65 Empresa PamGene International B.V. Producto Características PamChip® Genotipado, perfiles de expresión y proteómica PicoArrays™ Rheumatism Rheumatoid Arthritis and Inflammation Estudio de las bases patogénicas de enfermedades inflamatorias PicoArrays™ Apoptosis Análisis de la expresión de los principales genes involucrados en muerte celular, diferenciación y proliferación celular Qiagen N.V. SensiChip Human Kinase DNA Array Bar Análisis de la expresión génica de todas las quinasas y fosfatasas conocidas F. HoffmannLa Roche Ltd. AmpliChip CYP450 Identificación de polimorfismos en dos genes, CYP2D6 y CYP2C19 implicados en el metabolismo de medicamentos ImmunoChip RZPD1.2 Human cDNA microarray Análisis de la expresión génica de 1.137 genes involucrados en procesos inmunológicos Oncochip RZPD1 Análisis de la expresión génica de 1.544 genes de importancia en procesos cancerígenos sciTRACER Inflammation 170 Estudio de la expresión diferencial de genes relacionados con enfermedades inflamatorias sciTRACER CardioVascular 350 Estudio de genes humanos involucrados en enfermedades cardiovasculares Panorama™ Gene E. coli Gene Arrays E. Coli Análisis de todos los genes codificantes para proteínas de E.coli Panorama™ Gene Helicobacter pylori Gene Arrays Helicobacter pylori Análisis de todos los posibles genes codificantes para proteínas de H. pylori Panorama™ Gene B. subtilis Gene Arrays B. Subtilis Análisis de todos los genes codificantes para proteínas de B. subtilis Panorama™ Gene Human Cytokine Gene Arrays — Panorama™ Gene Human Apoptosis Gene Arrays Amplicones de las regiones codificantes para proteínas de genes involucrados en procesos apoptóticos Human Cancer OligoArray™ Genes involucrados en apoptosis, angiogénesis, ciclo celular, metástasis, oncogenes, transducción de la señal, factores de transcripción y supresores de tumores Spectral Genomic, Inc. Spectral Chip™ 2600 DNA Array Hibridación genómica comparativa con aplicación a citogenética e investigación del cáncer STEAG microParts GmbH Lilliput® Chip Empleados en microbiología clínica para la automatización de los test de susceptibilidad a antibióticos e identificación de bacterias PicoRapid Technologie GmbH RZPD Deutsches Ressourcenzentrum für Genomforschung GmbH Scienion AG Sigma-Genosys 66 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA Empresa Producto Características GeneConnection™ Discovery Microarray Genes de 29 tejidos humanos GeneConnection™ Control Microarray Genes Housekeeping y de control exógeno Stratagene human GEArray® human ChoiceGEArray® Superarray, Inc. mouse GEArray® Fragmentos de ADNc de genes involucrados en una determinada ruta de transducción de señales mouse ChoiceGEArray® IntelliGene™ Functional DNA Chip Human Brain ver 1 Contiene 1.700 genes (fragmentos de ADNc) con cambios específicos en la expresión en el cerebelo, hipocampo y amígdala Functional DNA Chip Rat Toxicology Ver.1.0 Análisis de la expresión de genes involucrados en el metabolismo de fármacos 9801A ICAN DNA Fragmentos de unos 1.800 genes humanos (incluyendo 356 citoquinas ) X001 IntelliGene Cyano CHIP Ver. 2.0 Fragmentos de ORF de especies de Synechocystis PCC6803 IntelliGene Cyano CHIP Ver. 2.0 Fragmentos de ORF (Open Reading Frame) de la bacteria Synechocystis Virginia Commonwealth Center Brain Tumour Biochip Oligo DNA microarrays Análisis de expresión génica de tumores cerebrales Vysis, Inc. GenoSensor™ Microarray System Detección del número de copias de genes. Asesoramiento sobre las anormalidades cromosómicas, de genes individuales en cromosomas y secuencias específicas en los genes XeoExp Human Cancer chip Análisis de expresión de genes humanos de importancia en cáncer XeoEX SARS chip Análisis de los genes de coronavirus para la detección de SARS Xenopus Xeochip Análisis de genes de Xenopus para estudios de desarrollo neuronal Takara Bio Inc. Xeotron Corp. 67 PRINCIPALES APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS DE PROTEÍNAS COMERCIALIZADOS Empresa Advanced Gene Technology, Corp. Producto HerboChip® Búsqueda de compuestos activos en plantas. HerboLink®(AGTChip) TranSignal™ WW domain arrays Axcell Biosciences Aplicación Determinación de interacción entre proteínas TranSignal™ PDZ domain arrays Determinación de la función de proteínas TranSignal™ SH3 domain arrays Designarray™ Análisis de enfermedades concretas Specifictargetarray™ Análisis de dianas terapéuticas Azign Bioscience A/S BD Biosciences Clontech Ab Microarrays BioForce Nanosciences, Inc. NanoArray™ Análisis completo de perfiles de expresión de proteínas Preactivated ProteinChip® Arrays Hydrophobic ProteinChip® Arrays Hydrophilic ProteinChip® Arrays Ciphergen Cation Exchange ProteinChip® Arrays Determinación de la interacción entre proteínas y distintos ligandos. Immobilized Metal affinity ProteinChip® Arrays Chromatographic surface ProteinChip® Arrays Echelon Biosciences Inc GeneMaster Lifesciences Co., Ltd. 68 Microarray PIP Array™ Determinación de la selectividad y sensibilidad relativa fosfoinosítidos GeneMaster MegiC™ Diagnóstico de meningitis GeneMaster NICE-Tha™ Diagnóstico de alfa-talasemia GeneMaster HLA Typing Chip™ Búsqueda de compatibilidad en transplante de órganos APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA Empresa Producto Aplicación AntibodyArray™ Signal Transduction Antibody 400 anticuerpos contra proteínas de señalización bien caracterizadas Apoptosis AntibodyArray 150 anticuerpos contra proteínas que regulan la apoptosis CellCycle AntibodyArray 60 anticuerpos contra proteínas involucradas en ciclo celular Invitrogen Protoarray™ Human Protein Microarray Screening de 1.800 proteínas de diferentes familias génicas como quinasas, proteínas asociadas a membrana, proteínas de señalización celular y proteínas implicadas en metabolismo Pepscan Systems Pep-Chip™ Kinase Búsqueda de sustratos para kinasas y búsqueda de la especificidad de inhibidores de kinasas Phylos, Inc. TRINECTIN™ Proteome Chip Detección de proteínas en tejidos expresadas en respuesta a fármacos o a una enfermedad Hypromatrix, Inc. Discover Light™ Proteome Arrays SearchLight™ Proteome Arrays Pierce Biotechnology Inc. SearchLight™ Cytokine Arrays SearchLight™ Chemokine Arrays Análisis de proteínas, lisados celulares o anticuerpos en formatos de baja densidad SearchLight™ Human Phosphorylated Kinase Array SearchLight™ Human Angiogenisis Array2 Procognia Gen p53 y principales variantes SNP Análisis de la función del gen p53 RayBio™ human angiogenesis antibody arrays RayBiotech, Inc. RayBio™ human atherosclerosis antibody arrays Arrays de anticuerpos de citoquinas para humanos, ratas y ratones RayBio™ human inflammation antibody arrays Schleicher & Schuell Bioscience ProVision™ Human Cytokine Array Determinación simultánea de la presencia de 16 citoquinas diferentes Sigma-Genosys Panorama™ Ab Microarray Cell Signaling Kit Análisis de 224 anticuerpos de proteínas implicadas en señalización celular 69 Empresa Producto Aplicación SomaLogic Inc. Aptamer Arrays Determinación simultánea de la concentración de las proteínas correspondientes a los fotoaptámeros empleados VBC-Genomics Bioscience Research GmbH ISAC® Análisis de alergenos PRINCIPALES APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS DE CARBOHIDRATOS DISPONIBLES COMERCIALMENTE Producto Empresa Caracteristicas Glycominds Ltd. GlycoChip™ Microarray de alto rendimiento de carbohidratos complejos para el análisis de las interacciones proteína-glicano. Aplicaciones a genómica funcional, desarrollo de fármacos, prebióticos, ensayos enzimáticos, screening de anticuerpos e infecciones bacterianas PicoRapid Technologie GmbH PicoArrays™ GlycoProfiler Microarray para el estudio de los genes que controlan la glicosilación de lípidos y proteínas PRINCIPALES APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS DE CÉLULAS DISPONIBLES COMERCIALMENTE Producto Empresa Caracteristicas Biolog, Inc. Phenotype MicroArrays Identificación y validación de cabezas de serie y dianas respectivamente, biología funcional y toxicogenómica. Disponibles para células bacterianas y fúngicas Cellomics, Inc. CellChip™ Análisis múltiple de péptidos y proteínas Zeptosens AG ZeptoMARKTM Cell Lysate Arrays de densidad media/alta para análisis multiple de péptidos y proteínas 70 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA PRINCIPALES APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS DE TEJIDOS DISPONIBLES COMERCIALMENTE Empresa Producto Características Ambion, Inc LandMark™ Tissue MicroArrays Análisis del perfil de expresión diferencial de dianas específicas Ardais Corp. Ardais Tissue Arrays (ATAs) Validación de dianas de alto rendimiento BD Biosciences Clontech BD Clontech™ Cancer Cell Line Profiling Array Perfil de expresión génica de 26 líneas celulares representadas en 11 tejidos Chemicon Inc. Chemicon's TMAs Perfil de expresión de proteínas en diferentes tipos de tumor Clinomics Biosciences, Inc HER-2neu response array, ckit response array Caracterización de alteraciones genéticas y patrones de expresión HistoChip™ Expression Pathology, Inc Liquid Tissue™ Determinación de cambios cuantitativos en la expresión de proteínas en un gran número de muestras de tejido enfermo y sano. Identificación y validación de marcadores proteicos Imgenex Corp. Tissue Array/Histo-Array™ human Perfil de expresión de proteínas en diferentes tipos de tumor Invitrogen Corp VastArray™ Perfil de expresión de proteínas, screening de anticuerpos, estudios de especificidad de tejido y análisis de modelos de ratón Oligene GmbH Tissue Arrays Microarrays construidos a partir de sus bancos de tejidos para estudios de expresión y screening in situ de ARNm Research Genetics, Inc. VastArray™ Tissue Arrays Estudios de expresión de proteínas, screening de anticuerpos, especificidad de tejidos y determinación patológica Zymed Laboratories, Inc. MaxArray™ Screening de anticuerpos, análisis de expresión, especificidad de tejido, análisis de fenotipo frente a genotipo, hibridación in situ de ARN o ADN (FISH o CISH™) Zyomyx Inc. Human Cytokine Biochip Desarrollo de fármacos empleando análisis paralelo de proteínas Tabla 10. Principales aplicaciones de los microarrays disponibles comercialmente. Fuente BioChipNet (http://www.biochipnet.com) 71 Anexo II. Empresas españolas que operan en el área de microarrays Biomedal, S.L. Área de aplicación Salud humana Misión Desarrollo de tecnologías innovadoras para el progreso de la investigación post-genómica y la producción industrial eficiente de nuevas biomóleculas útiles para la sociedad Servicios relacionados con microarrays • Lectura y procesamiento de ADN arrays • Asesoramiento y gestión de proyectos de I+D en biomedicina (estudios de expresión semi-cuantitativa empleando tecnologías de DNA arrays) I+D • Desarrollo de vectores para genómica funcional en un amplio rango de organismos • Desarrollo de herramientas para mejorar la eficiencia en la expresión y purificación de proteínas • Desarrollo de herramientas para diagnóstico molecular Acuerdos y colaboraciones científicas Universidad de Sevilla, Université Clermont-Ferrand, Universidad Miguel Hernández, Universidad Pablo de Olavide, Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC), Instituto de Biomedicina “López Neyra” (CSIC) Contacto Dirección: Avenida Américo Vespucio nº 5, Bloque E - Planta 1ª Módulo 12, Isla de la Cartuja, 41092, Sevilla Web: http://www.biomedal.es/espanol/index.htm Dominion Pharmakine, S.L. Área de aplicación Salud humana Misión Compañía biofarmacéutica enfocada al desarrollo de productos y servicios que permitan avanzar en la investigación, el diagnóstico y tratamiento del cáncer Productos relacionados con microarrays Arrays de tejidos: • Human Hepatic Colon-Carcinoma Metastasis Tissue Array • Organ-Specific Metastasis Melanoma Tissue Array • Multi-Organ Animal Tissue-Arrays • Arrays de tejido personalizados Arrays de células: • Array específico de células hepáticas (humano, rata, ratón) • Array de líneas celulares de melanoma humano Arrays de células personalizados Servicios relacionados con microarrays Genómica funcional: • Análisis de la expresión génica • Diseño de microarrays de ADN personalizados • Construcción de librerías de ADNc • Análisis de sistemas de expresión modificados Contacto Dirección: Parque Tecnológico de Bizkaia, Edificio 801, 1ª planta Web: http://www.pharmakine.com 72 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA Neocodex, S.L. Área de aplicación Salud humana Misión Empresa dedicada a la investigación y desarrollo en biomedicina y al diagnóstico molecular de enfermedades humanas Servicios relacionados con microarrays Expresión génica mediante microarrays de ADN I+D Trazado de marcadores de susceptibilidad genética en la población española. Acuerdos y colaboraciones científicas Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas de Madrid (CNIO), Centro de Investigaciones Biológicas de Madrid (CIB/CSIC), Hospital Clínico San Carlos, Hospital Doce de Octubre (Madrid), Hospital Virgen del Rocío y Valme (Sevilla) Genetix (UK), Universidad de Utrech (Holanda), Universidad Tor Vergata (Roma) Contacto Dirección: Avda. Averroes nº8 Ed. Acrópolis, Mod. 110-111, Sevilla Web: http://www.neocodex.es Oryzon Genomics, S. A. Área de aplicación Salud humana, Agroalimentación Misión Construcción de una plataforma tecnológica versátil que nos permita identificar de forma muy procesiva las relaciones entre los genes y sus funciones Productos relacionados con microarrays Tethys: sistema de alto rendimiento para diseñar un conjunto óptimo de oligonucleótidos con el objetivo de construir un chip de DNA para un cierto organismo Servicios relacionados con microarrays • Análisis de la expresión génica mediantes chips de ADN: Toxicogenómica, Cardiovascular, Enfermedades Neurodegenerativas, Inflamación, Enfermedades Humanas, Genes de Cáncer, Variantes de Splice en tumores • Genotipaje: chips de ADN humano SNPs-INDELs I+D Bioinformática Contacto Dirección: C/Josep Samitier 1-5, 08028 Barcelona Web: http://www.oryzon.com 73 Owl Genomics, S.L. Área de aplicación Salud humana Misión Identificación de marcadores moleculares y agentes terapéuticos para el diagnóstico temprano y tratamiento de enfermedades hepáticas Productos relacionados con microarrays Hepatochip: chip de ADN que permite conocer la presencia de esteatohepatitis no alcohólica (NASH) a partir de la coexpresión de 85 genes I+D Diagnóstico temprano de esteatosis hepática (EH) y esteatohepatitis no alcohólica (NASH) Acuerdos y colaboraciones científicas Universidad de Navarrra, Centro de Estudios e Investigaciones Técnicas de Guipúzcoa, Hospital Clínico de Barcelona, Hospital Gregorio Marañón, Hospital Universitario Príncipe de Asturias, Hospital Italiano de Buenos Aires, Noray Bioinformatics, Progenika, Proteómica Contacto Dirección: Parque Tecnológico de Bizkaia, Edificio 801, planta 2ª, 48160 Derio Web: http://www.owlgenomics.com Progenika Biopharma, S.A. Área de aplicación Salud humana Misión Identificación y validación de genes y proteínas implicadas en procesos patológicos, y su empleo en el desarrollo de nuevos fármacos y métodos de diagnóstico Productos relacionados con microarrays Affymetrix genechip® probe arrays Microarrays de Genotipado: • Human Familiar Hypercholesterolemia DNA Array (Lipochip, comercializado) • Human Blood genotyping DNA Array (Bloodchip) • Inflammatory Bowel Disease DNA Array (IBDchip) Arrays de análisis de la expresión génica: • Human Blood Neoplasias Classification Array (hematochip) • Rat Genome 5K Microarray • Pseudomonas putida Genome Array • Pseudomonas aeruginosa Genome Array • Medplant Small Cell Lung Cancer Chemotherapy Resistance microarray (en fase de validación clínica) I+D Identificación y validación de genes y proteínas relacionadas con enfermedades psiquiátricas, neurológicas y cáncer Acuerdos y colaboraciones científicas Owl Genomics Contacto Dirección: Parque Tecnológico de Zamudio, Edificio 801 -A- 48160 Derio Web: http://www.progenika.com 74 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA Sistemas Genómicos, S.L. Área de aplicación Salud humana y agroalimentación Misión En el área de la Biomedicina, crear y proveer a la sociedad de métodos de diagnóstico que mejoren la salud y la calidad de vida. En el área de la Agroalimentación, satisfacer aquellas necesidades analíticas de las empresas del sector que únicamente pueden cubrirse mediante el análisis de ADN de los alimentos Productos relacionados con microarrays Aplicaciones en el desarrollo de chips de ADN I+D Predicción de Riesgo: Diagnóstico Molecular Medicina personalizada: Farmacogenómica Contacto Dirección: Parque Tecnológico de Valencia, Avda. Benjamín Franklin, 12, 46980 Paterna (Valencia) Web: http://www.sistemasgenomicos.com 75 Anexo III. Empresas españolas que desarrollan productos de bioinformática aplicados a microarrays Bioalma, S.L. Área de aplicación Salud humana Misión Bioinformática Servicios relacionados con identificación y validación de dianas Consultoría, formación y desarrollo de software aplicado a los microarrays de ADN I+D Bioinformática aplicada a microarrays de ADN Sistemas de extracción de información Acuerdos y colaboraciones científicas CNIO, Genetrix Contacto Dirección: Centro Empresarial Euronova, Ronda de Poniente, 4 2ª planta, Unidad C-D, 28760 Tres Cantos, Madrid Web: http://www.almabioinfo.com Ebiointel, S.L. Área de aplicación Salud humana Misión Desarrollo de plataformas bioinformáticas para el análisis de secuencias, de la diversidad genética y de datos génomicos en general, con el objetivo de simplificar y acelerar la investigación biomédica. Servicios relacionados con identificación y validación de dianas EbioSNP: plataforma para la representación y análisis de la diversidad genética Servicio de análisis experto en los siguientes campos: asociación de factores genéticos y rasgos fenotípicos, búsqueda de dianas farmacológicas, análisis epidemiológicos y filogenéticos I+D Diseño de plataformas bioinformáticas Acuerdos y colaboraciones científicas Noray Bioinformatics Contacto Dirección: Edifici M - Campus de la UAB, Vivero de Empresas de Biotecnologia y Biomedicina (VE3B), 08193, Bellaterra, Barcelona Web: http://www.ebiointel.com 76 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA Integromics, S.L. Área de aplicación Salud humana Misión Proporcionar soluciones tecnológicas que faciliten la adquisición, manejo, procesamiento y análisis de grandes volúmenes de datos en la era postgenómica Servicios relacionados con identificación y validación de dianas ArrayHub© (gestión de datos de análisis de la expresión génica) Formación en bioinformática Acuerdos y colaboraciones científicas Applied Biosystems, Spotfire Contacto Dirección: Parque Científico de Madrid, Ciudad Universitaria Cantoblanco, C/ Einstein nº 13, Pabellón C, 1ª planta. 28049 Madrid Web: http://www.integromics.com Noray Bioinformatics, S.L. Área de aplicación Salud humana Misión Diseño, desarrollo e implantación de software a medida, con el objeto de servir como soporte al sector de la biotecnología en tecnologías de la información Servicios relacionados con identificación y validación de dianas Genómica funcional: software para el análisis correlacional de datos clínicopatológicos con datos genómicos en estudios de cáncer (BITIATM) Servicios: consultoría bioinformática, herramientas de gestión y explotación de resultados de laboratorio, proyectos de outsourcing en bioinformática. I+D Bioinformática Acuerdos y colaboraciones científicas Azeretia, H.U. La Paz, Dominion Pharmakine, Advancell, Owl Genomics, Aethia Universidad de Barcelona, Biolex, Judo, PharmaDatum, eBiointel. Contacto Dirección: Parque Tecnológico, 801 A, 48160 Derio, Bizkaia Web: http://www.noraybio.com 77 ANEXO IV. Proyectos de investigación españoles relacionados con tecnologías de microarrays PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN ESPAÑOLES RELACIONADOS CON TECNOLOGÍAS DE MICROARRAYS Centros de investigación pertenecientes al CSIC Centro Centro de Investigaciones Biológicas, CIB (CSIC) Departamento Título del proyecto Duración Financiación Genómica funcional para la resolución de problemas medioambientales y biotecnológicos 2002-2005 MCyT Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, CBM (UAM-CSIC) Análisis bioinformático de microarrays para la detección de rutas determinantes de la malignidad asociada a mutaciones del receptor de andrógenos en cáncer de próstata 2001-2003 MCyT Instituto de Ciencias de los Materiales de Madrid, ICMM (CSIC) Inmovilización de anticuerpos y oligonucleótidos en partículas magnéticas para el diseño de sistemas de detección precoz de marcadores tumorales 2000-2003 MCyT Desarrollo de un microarray de ADN basado en transporte e inmovilización por campo eléctrico 2001 MCyT Microbiología Molecular Materiales Particulados A core DNA microarray facility serving the fudged integrated project Inmunología y Oncología Desarrollo de un microarray de ADN basado en transporte e inmovilización por campo eléctrico 2001-2004 CICYT Instalación de microarrays de cDNA al servicio del proyecto integrado FUGEDAD 2002-2005 MCyT Biotecnología Microbiana Modelos de evolución de la resistencia a los antibióticos. Proteómica y genómica de Pseudomonas aeruginosa 2001-2004 MCyT Biología Molecular y Celular Genómica funcional para la resolución de problemas medioambientales y de salud 2002-2005 MCyT — Análisis de la conexión entre la regulación global del metabolismo, la resistencia de los antibióticos y la virulencia de Pseudomonas utilizando microarrays de ADN 2005 CAM Análisis Estructural y Química Ambiental Diseño y construcción de micro-chips para análisis rápido y sensible de proteínas marcadoras de tumores cerebrales 2003-2006 MCyT Centro Nacional de Biotecnología, CNB (CSIC) Instituto de Química Orgánica General, IQOG (CSIC) 78 MCyT APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA Centros de investigación pertenecientes al CSIC (Continuación) Centro Instituto de Catálisis y Petroleoquímica, ICP (CSIC) Departamento Biocatálisis Laboratorio de Biología Molecular y Celular del Cáncer Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols”, IIB (UAM-CSIC) Laboratorio de Regulación de la Expresión Génica Laboratorio de Endocrinología Molecular Título del proyecto Duración Financiación Desarrollo de una plataforma tecnológica de farmacogenómica funcional basada en DNA microarrays 2001-2001 MCyT Diseño de un microchip de cDNA para la detección de resistencia a la quimioterapia en pacientes con cáncer de pulmón 2001 MCyT Estudio de los factores moleculares predictivos de respuesta al tratamiento de cáncer no microcítico de pulmón (NSCLC) mediante análisis del transcriptoma a través de microarrays 2002-2004 FIS Aplicación de la tecnología de los microarrays de cDNA para analizar la expresión diferencial de genes entre mujeres afectadas de síndrome de ovario poliquístico y normales 2002-2004 CAM Estudio del perfil de expresión génica múltiple en tumores de Ewing como base para la búsqueda de nuevos marcadores y dianas terapéuticas 2001-2003 MCyT Desarrollo de un microarray específico para la identificación de alteraciones genéticas con valor diagnóstico y pronóstico en tumores sólidos infantiles 2003 MCyT Genética molecular del retinoblastoma: nuevas metodologías para detección de portadores, relaciones fenotipo/genotipo en pacientes de baja penetrancia y clasificación molecular de los tumores con técnicas de expresión en matrices de ADN 2005 Comunidad Autónoma de Madrid Estudio genómico mediante arrays de oligonucleótidos de un modelo humano de resistencia insulínica: Síndrome de ovario poliquístico y obesidad 2003-2004 CAM Aplicación de la tecnología de los microarrays de cDNA para analizar la expresión diferencial de genes entre mujeres afectadas de síndrome de ovario poliquístico y normales 2002-2003 CAM Implementación y aplicación de una técnica de “cDNA microarrays” para el estudio simultáneo de la expresión de miles de genes 2000-2002 MCyT 79 Centros de investigación pertenecientes al CSIC (Continuación) Centro Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols”, IIB (UAM-CSIC) Instituto de Microelectrónica de Madrid, IMM (CNM-CSIC) Centro de Investigación del Cáncer (USALCSIC) Departamento 80 Duración Financiación Implementación y aplicación de una técnica de “cDNA microarrays” para el estudio simultáneo de la expresión de miles de genes 2002 PN Desarrollo de nanobiochips de ADN con tecnología micro/nanoelectrónica 2002 MCyT Integrated Opto-Nanomechanical biosensor for functional genomic analysis (OPTONANOGEN) 2002-2005 UE The application of functional genomic and proteomic technologies to the study of development and dissease 2002-2005 MCyT Prototipo de un nanobiodispositivo para la detección de alteraciones en genes humanos (NANOBIOGEN) 2002-2003 MCyT Microsistema Biosensor Optonanomecánico para análisis en genómica funcional 2003-2006 MCyT Investigación básica Análisis de alteraciones moleculares de los activadores de Ras en tumores usando la tecnología convencional de RT-PCR y ampliada con la tecnología de los chips microarrays 2001 MCyT Bioinformática y genómica funcional Análisis estadístico y biológico por métodos informáticos de resultados de chips genómicos de hemopatías malignas 2003-2005 FIS Investigación aplicada Perfil genómico y de expresión génica en gliomas humanos. Relación con las características histopatológicas y el pronóstico 2002-2005 FIS Utilización de la técnica de arrays para determinar perfiles de expresión relativa de moléculas efectoras de la lesión intestinal en la enfermedad celíaca 2004-2005 ACM Análisis genético de cuasiespecies virales mediante chips de DNA para la planificación de tratamientos antivirales (Proyecto VIROCHIP) 2002-2005 MCyT Detección de genomas minoritarios en cuasiespecies. Aplicación al desarrollo de un nuevo método de diagnóstico de virus patógenos basado en memoria molecular 2001-2003 CAM Laboratorio de Endocrinología Molecular Dispositivos, Sensores y Biosensores Instituto de Biología y Genética Molecular, IBGM (CSIC-Universidad de Valladolid) Centro de Astrobiología, CAB (CSIC-INTA) Título del proyecto Laboratorio de Evolución Molecular APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA Centros de investigación pertenecientes al CSIC (Continuación) Centro Departamento Laboratorio de Evolución Molecular (cont.) Centro de Astrobiología, CAB (CSIC-INTA) Instituto de Biomedicina de Valencia, IBV (CSIC) Laboratorio de Ecología Molecular Unidad de Genética Molecular Título del proyecto Duración Financiación Hacia un nuevo tipo de biosensor basado en el uso de ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) y nanopartículas magnéticas 2004-2005 CSIC Microarrays de ADN para estudios de biodiversidad 2003-2005 FIS Desarrollo de tecnologías basadas en microarrays para la detección de biomarcadores de interés astrobiológico y medioambiental 2004-2006 MCyT Identificación de genes relacionados con el síndrome de Parkinson 2002-2005 MCyT Universidades Centro Departamento Título del proyecto Lab. Investigación Metabólica, Lab. Biotecnología, Dpto. Cirugía, Dpto. Endocrinología. Clínica Universitaria de Navarra Estudio del patrón diferencial de expresión génica en tejido adiposo de pacientes obesos e individuos con normopeso mediante la técnica de microarrays 2001-2002 Gobierno de Navarra Fisiología y nutrición Susceptibilidad o resistencia al desarrollo de obesidad inducida por la grasa de la dieta en humanos: identificación de genes de tejido adiposo implicados mediante tecnología de microarray 2002-2004 Gobierno de Navarra Centro de Investigación Médica Aplicada, Universidad de Navarra Grupo de Farmacogenómica del Cáncer Farmacogenómica en cáncer de colon metastásico mediante tecnología microarray 2004-2007 Fundación de Investigación Médica Mutua Madrileña Automovilista Universidade da Coruña Bioloxía Celular e Molecular Sistema de determinación de niveles de expresión génica por microarray — — Anatomía Patológica Estudio de microarrays de cDNA para la identificación de genes de expresión diferenciada como potenciales marcadores de riesgo de transformación maligna en células bronquiales 2002 FIS Biología Molecular y Bioquímica I Acción antitumoral de los cannabinoides: análisis de la expresión génica en gliomas mediante arrays de DNA 2005 CAM Universidad de Navarra Universidad Complutense de Madrid Duración Financiación 81 Universidades (Continuación) Centro Departamento Título del proyecto Duración Financiación Instituto Universitario de Oncología Análisis del Fracaso Primario y del rechazo usando chips de ADN en injertos de islotes 2004-2006 FIS Facultad de Medicina Valor pronóstico de variables biológicas definidas mediante tissue microarrays (TMA) en cáncer de próstata. Influencia del tratamiento hormonal sobre el perfil de expresión 2002 FIS — Estudio, mediante microarrays, de la inhibición de la maduración de las células presentadoras de antígenos como mecanismo de inducción de tolerancia inmunológica postrasplante 2005 Junta de Castilla y León Universidad de Valladolid Bioquímica, Biología Molecular y Fisiología Analisis de la respuesta a hipoxia de las células quimiorreceptoras del cuerpo carotideo de raton mediante microarrays de oligonucleotidos 2003-2004 Universidad de Castilla la Mancha Ingeniería eléctrica, electrónica y automática, Área de Tecnología Electrónica Biochips de ADN con control electrónico 2003-2004 MCyT Universitat Autònoma de Barcelona Bioquímica y Biología molecular Creación y distribución de microchips de la levadura S. cerevisiae 2002 MCyT Universidad Politécnica de Valencia Grupo de Sistemas RadioFibra Óptica Sensores biofotónicos: estudio de la detección de ADN usando dispositivos basados en cristales fotónicos 2D 2003-2005 — Universidad de Huelva Ingeniería Electrónica, de Sistemas Informáticos y Automática Extracción de conocimiento de los microarrays de ADN usando tecnología difusa 2003 MEC Ciencias de la computación e inteligencia artificial Extracción de conocimiento de los microarrays de ADN usando tecnología difusa 2003-2006 MCyT Ciencias Computacionales Procesos de regulación genética sobre microarrays usando extracción de conocimiento 2004 PN Universidad de Oviedo Universidad de Salamanca Universidad de Granada 82 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA Universidades (Continuación) Centro Universidad de Sevilla Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Departamento Duración Financiación Grupo de Expresión Génica en Eucariontes Nuevas técnicas de genómica funcional: análisis mediante DNAarrays de potenciales genes blanco de los immunosupresores en células linfoides y granulocíticas 2003-2005 FIS Grupo de Tecnología Electrónica Sistema de producción masiva de biochips matriciales (microarrays) ultradensos 2001-2004 MCyT Ciencias Clínicas Identificación de perfiles de expresión génica hormonodependientes: aplicación de biochips al estudio de los mecanismos moleculares de la hormona de crecimiento humana 2002-2003 Pharmacia Spain S.A. Microbiología y Parasitología Detección de genes de virulencia de Escherichia coli patógenos para seres humanos y animales por nuevas tecnologías de biología molecular: PCR clásica, PCR cuantitativa en tiempo real y chips de DNA/RNA microarrays 2002 Plan Gallego de Investigación y Desarrollo Tecnológico (2002-2005) Desenvolvemento dun método de detección de mutacións en xenoma mitocondrial mediante arrays de oligonucleótidos e análises de fluorescencia 2002-2005 Xunta de Galicia Desarrollo de “Microarrays” de ADN para diagnóstico de paternidad mediante el análisis de SNPs 2001-2003 PN Análisis de bajo número de copias ADN en problemas forenses usando polimorfismos nucleotídos simples y miocroarrays de ADN 2003-2005 PN Genética Microarrays y análisis computacional de genes del desarrollo y la regeneración en Drosophila 2002-2004 MCyT División de Ciencias Experimentales Funcion de las proteinas asociadas al nucleoide h-ns y hha en la regulacion de la expresion genica global en salmonella. Estudio por dna array 2001-2007 DGI Universidad de Santiago de Compostela Instituto de Medicina Legal Universidad de Barcelona Título del proyecto 83 Hospitales Centro Departamento Título del proyecto Red temática de investigación cooperativa “Estudio genético, metabólico, clínico, terapéutico y epidemiológico de las hiperlipemias hereditarias genéticas en España” Patrón de expresión génica mediante microarrays en las hiperlipemias genéticas 2003-2005 FIS Grupo de Investigación en Endocrinología Molecular Identificación de marcadores tumorales del adenocarcinoma endometrial a partir de un panel de 297 secuencias diferencialmente expresadas aisladas por hibridación de microarrays 2002 FIS Hormonodepend encia y tumores sólidos Identificación de marcadores tumorales del adenocarcinoma endometrial a partir de un panel de 297 secuencias diferencialmente expresadas halladas por hibridación de microarrays 2003-2005 FIS Anatomía Patológica Perfiles de expresión inmunohistoquímica y de amplificación genética en cáncer de endometrio estudiados mediante matrices de tejidos (tissue microarrays) 2003-2005 FIS Hospital Universitario La Paz (UAM) Oncología Pediátrica Identificación de marcadores moleculares de diagnóstico y pronóstico en sarcomas de Ewing mediante el empleo de microarrays 2004-2005 Investigación en Oncología Pediátrica Fundación Enriqueta Villavecchia Hospital Universitario de La Princesa (UAM) Anatomía Patológica Diferenciación celular en linfomas B de célula pequeña. Análisis de expresión con microarrays de cDNA 2000-2003 CAM Oncología Médica Estudio farmacogenómico mediante microarrays y técnicas de Biología Molecular Clásica de resistencia a quimioterapia en pacientes con cáncer colorectal metastásico tratados en primera línea con una combinación de oxaliplatino y una fluopirimidina 2003-2005 Gobierno Vasco Hospital Clínic Barcelona Expresión génica del componente infiltrante de los gliomas: investigación de nuevos marcadores y dianas 2004-2006 AECC Hospital Doce de Octubre Análisis del valor pronóstico y predictivo del perfil de expresión génica tumoral, mediante arrays de oligonucleótidos, en la evolución de los pacientes con cáncer de pulmón Hospital Ramón y Cajal Hospital Vall d'Hebron (Universitat Autònoma de Barcelona) Hospital Materno-Infantil de Las Palmas de Gran Canaria Hospital Las Cruces - Centro Vasco de Investigación en Cáncer, CVIC 84 Servicio de Oncología Duración Financiación FIFO APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA Otros centros de investigación Centro Departamento Título del proyecto Duración Financiación Laboratorio de Microarrays Estudio genómico funcional del gen LRRN6A en la diferenciación neuronal. Optimización de metodologías experimentales y bioinformáticas para la aplicación de los microarrays a estudios de expresión 2004 MCyT — Función del gen neuronal lern1. Optimización de microarrays para detección de aneuploidías en poblaciones celulares heterogéneas 2003 MCyT — Acción especial de ayudas para el fomento de tecnologías microarrays de DNA para el análisis de expresión génica — Fundación Genoma EspañaAgilent Ciencias Clínicas Aplicación de la tecnología de biochips al estudio de los mecanismos moleculares de la hormona de crecimiento - Identificación de perfiles de expresión génica inducidos por hormonas 2003 Fundación Universitaria de Las Palmas Institut de Biotecnologia i Biomedicina "Vicent Villar Palasi" Tecnologia de microarrays aplicada a l'anàlisi genòmic de tumors de bufeta i a la validació de marcadors tumorals 2002-2005 — Institut de Biotecnologia i de Biomedicina (IIB-UAB) Línea de investigación: citogenètica molecular de tumors sòlids: Hibridació Genòmica Comparada en microarrays de DNA. — — Aplicación de la CGH array para la detección de reordenamientos genómicos responsables de retraso mental de causa desconocida 2004 MCyT Genómica funcional del ratón: biochips y modelos genéticos en cáncer 2002-2005 MCyT Genómica funcional del ratón: biochips y modelos genéticos 2002-2005 Fundación Ramón Areces Diseño de una estirpe de ratón por reemplazamiento génico necesaria para la generación de mutantes condicionales: un útil de uso universal para el desarrollo de la genómica funcional 2001-2004 MCyT Centro de Regulación Genómica, Parc de Recerca Biomèdica de Barcelona Instituto Canario contra el Cáncer, ICIC Unitat de Citogenètica Fundación para la Investigación Hospital Universitario la Fe Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas, CNIO Programa de Oncología molecular 85 Otros centros de investigación (Continuación) Centro Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas, CNIO Departamento Programa de Patología molecular Programa de Biotecnología 86 Título del proyecto Duración Financiación Identificación de nuevas dianas de inactivación epigenética (metilación aberrante del DNA y alteraciones de la cromatina) en cáncer humano usando microarrays y otras técnicas genómicas 2002-2004 FIS Perfil de expresión génica en linfomas no Hodgkin a partir de un biochip de 400 cDNA procedentes de genes relacionados con el proceso tumoral 2001 CAM Diferenciación celular en linfomas B de célula pequeña. Análisis de expresión con microarrays de cDNA 2002-2004 CAM Patrones de expresión genética en cáncer de endometrio: estudio mediante micro-arrays de cDNA 2002-2004 FIS Aproximación multidisciplinaria al cáncer de mama hereditario no asociado a mutaciones en los genes BRCAs. Desarrollo de un biochip de expresión de cDNAs 2002-2004 MCyT Extracción de conocimiento de los microarrays de ADN usando métodos estadísticos 2003-2006 MCyT Estudio mediante arrays de cDNA de los genes implicados en la sensibilidad y resistencia a paclitaxel en cáncer de mama y ovario 2002-2004 MCyT Aplicación de nuevas tecnologías al estudio del linfoma de Hodgkin: tissue arrays (matrices de multitejidos), microdisección y análisis de expresión con microarrays de cDNA 2002-2004 FIS Perfiles de expresión inmunohistoquímica y de amplificación genética en cáncer de endometrio estudiados mediante matrices de tejidos (“tissue microarrays”) 2003-2005 FIS Diseño y fabricación de un biochip de expresión para la predicción de la respuesta a gemtabicina en pacientes con cáncer de mama: GEMZACHIP 2004-2007 MCyT Cáncer colorrectal: estudio proteómico de expresión diferencial mediante microarrays de proteínas encaminado a mejorar la detección precoz y el diagnóstico molecular 2005 CAM APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA Otros centros de investigación (Continuación) Centro Departamento Programa de Biotecnología Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas, CNIO Programa de Genética del Cáncer Humano Título del proyecto Duración Financiación Diseño y fabricación de un biochip de DNA de baja complejidad para la evaluación pronóstica del cáncer de mama 2003 MCyT Desarrollo de metodologías de matrices de DNA en soportes interactivos (CDROM) para análisis de polimorfismos y expresión génica (CD-DNA) 2001-2003 MCyT Genomic approaches to microarray data analysis 2003 European Science Foundation Desarrollo de nuevos métodos de selección de genes y construcción de predictores para el pronóstico de parámetros clínicos usando microarrays de ADN 2005 CAM Desarrollo de los modelos estadísticos para el análisis conjunto de arrays de CGH y de expresión génica para el estudio de neoplasias humanas — Mutua Madrileña Automovilista Marcadores genéticos del mal pronóstico en leucemias mieloides agudas y mielodisplasias: análisis por citogenética molecular y perfiles de expresión con cDNA arrays 2002-2004 MCyT Diseño y producción de biochips de ADN (CGH-arrays) con cobertura completa de los genomas humano y de ratón 2005 CAM Caracterización mediante CGH-arrays de reordenamientos genómicos de cambios de dosis génica en procesos neoplásicos 2005-2007 FIS Búsqueda de genes implicados en patogénesis de Feocromocitomas/Paragangliomas, y de marcadores asociados a curso clínico usando 3 aproximaciones: cDNA arrays, CGH e inmunohistoquímica sobre arrays de tejido 2005-2007 FIS Caracterización molecular e inmunohistoquímica mediante matrices de tejido, y búsqueda de alelos de baja penetrancia en el cáncer colorrectal no polipósico familiar 2005-2008 FIS Caracterización de la heterogeneidad molecular de los linfomas T humanos mediante microarrays: implicación de la ruta de activación de NFKB 2005 CAM 87 Otros centros de investigación (Continuación) Centro Instituto de Salud Carlos III Departamento Título del proyecto Bioinformática y salud pública Sistemas de Identificación Rápida de Agentes Biológicos Agresivos SIRABAD Duración 2003-2005 Financiación Ministerio de Defensa Empresas Centro Título del proyecto Duración Financiación Análisis genético de cuasiespecies virales mediante chips de ADN para la planificación de tratamientos antivirales 2003 PROFIT Desarrollo de un microarray específico para la identificación de alteraciones genéticas con valor diagnóstico y pronóstico en tumores sólidos infantiles 2003 PROFIT Desarrollo de sistemas de diagnóstico molecular basados en microarrays de baja densidad 2003 PROFIT Diseño de un microchip de ADNc para la detección de resistencia a la quimioterapia en pacientes con cáncer de pulmón 2003 PROFIT Proyecto linfo-chip: desarrollo de un ADN-chip para el diagnóstico diferencial de neoplasias hematológicas 2003 PROFIT Proyecto Iberoeka Medchip - desarrollo de sistemas de diagnóstico precoz e identificación de dianas terapéuticas, mediante tecnología ADN-chip 2003 PROFIT Neocodex, S.L. Desarrollo de SNPs y Biochips aplicables al diagnóstico molecular de la esterilidad humana 2003 PROFIT Bioalma Desarrollo e implementación de sistemas de clasificación de muestras para datos de microarrays de expresión génica o de tejidos 2003 PROFIT Genetrix, S.L. Genómica, S.A. Medplant genetics, S.L. Tabla 11. Proyectos de investigación españoles relacionados con tecnologías de microarrays Fuente: Elaboración propia Acrónimos: PN, Plan Nacional; FIS, Fondo de Investigaciones Sanitarias; MCyT, Ministerio de Ciencia y Tecnología; CAM, Comunidad de Madrid; DGESI, MEyC, Ministerio de Educación y Cultura; FRA, fundación Ramón Areces; CICYT, Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnología; UAB, Universidad Autónoma de Barcelona; UE, Unión europea; PGI y DT, Plan Gallego de Investigación y Desarrollo Tecnológico; DGES, Dirección General de Enseñanza Superior; FCRG, Fundación Centro de Regulación Genómic; NIH, National Institutes of Health, USA; NIH/ NHLBI, National Institutes of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI); CSIC, Consejo Superior de Investigaciones Científicas; Asociación Española Contra El Cáncer (AECC); Fundación para la Investigación y Formación en Oncología (FIFO). 88 APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA ANEXO V. Patentes recientes en Microarrays Patentes recientes en Microarrays Nº de Patente Título Solicitante Fecha de Publicación WO2005018796 Microarray support for bioprobe synthesis PamGene (Hertogenbosch, Países Bajos) 03/03/2005 US20050048580 Nucleic-acid programmable protein arrays Harvard Collage (Cambridge, MA, USA) 03/03/2005 US20050048554 Method of making and using hybrid polymeric thin films for bio-microarray applications Zhou J; Zhou X 03/03/2005 US20050046758 Method of transcribing biomolecular patterns, method of manufacturing chip boards, and method of manufacturing biochips Omron KK (Tokyo); Aoyama S; Matsushita T; Nisjikawa T; Norioka S; Tsuda Y; Wazawa T 03/03/2005 US20050048648 Compositions & methods for reformulating biological membranes for arrays Fang Y; Ferrie AM 03/03/2005 US20050048531 Methods for genetic analysis Affymetrix (Santa Clara, CA, USA) 03/03/2005 Novel dendrimer compound, a biochip using the same and a fabricating method thereof Pohang Iron and Steel Co.; Pohang University of Science and Technology Foundation (Pohang, Korea) 24/02/2005 US20050042363 Method for fabrication of biochips with a macroporous polymer substrate Chernov BK; Gemmell MA; Golovaj B; Kukhtin AV; Yershov GM 24/02/2005 WO2005014852 Microarrays of immobilized biomolecules, production thereof, and use thereof SusTech GmbH & Co. (Darmstadt, Germany) 17/02/2005 KR2004094982 A method for highly concentrating a target material in a sample using a scanning probe microscope to manufacture a highly integrated nano-bioarray Sogang University (Seoul, Korea) 12/11/2005 WO2005016869 Tabla 12: Patentes recientes en Microarrays. Fuente: Recent patent applications in microarrays. Patents. (2005). Nature Biotechnology 23:550. 89 Referencias bibliográficas • Angenendt, P,. et al. (2003). Next generation of protein microarray support materials: evaluation for protein and antibody microarray evaluations. Journal of Chromatography A. Vol. 1009:97-104. • Doménech-Sánchez, A.; Vila, J. (2004). Fundamentos, tipos y aplicaciones de los arrays de ADN en la microbiología médica. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. Vol. 22 (1) :46-54. • Angenendt, P.; Glökerm, J. (2003). Protein and • Espina, V., et al. (2004). Protein microarray detection strategies: focus on direct detection technologies. 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