Trabajos con utilidad práctica realizados en el Centre de Recerca

 Trabajos con utilidad práctica realizados en el Centre de Recerca en Sanitat Animal (CReSA) XIII Jornadas de Porcino de la UAB. 4 de febrero de 2011 Vacunación frente a Haemophilus parasuis en las madres altera la posterior colonización de esta bacteria en los lechones VIRGINIA ARAGÓN virginia.aragon@cresa.uab.cat H. parasuis es muy común y se encuentra en todas las granjas comerciales. Coloniza el tracto respiratorio superior de lechones a una edad muy temprana, pudiéndose aislar de la nariz de cerdos sanos como parte de microbiota (“flora”) respiratoria normal. Pero algunas cepas son virulentas, y pueden diseminarse hasta el pulmón produciendo neumonía y de allí a otros órganos, causando enfermedad sistémica. Es por esto que un buen equilibrio entre colonización e inmunidad es importante para evitar brotes de enfermedad. Por todo ello, en este trabajo estudiamos la dinámica de colonización de H. parasuis en dos grupos de lechones sanos: un grupo que provenía de madres vacunadas y otro que provenía de madres no vacunadas frente a esta bacteria. Observamos que los lechones de madres vacunadas presentaban niveles más elevados de anticuerpos frente a la bacteria, y más pronto que los lechones de madres no vacunadas. Estos diferentes niveles de anticuerpos influían en la colonización, pues los lechones de madres vacunadas eran colonizados por H. parasuis más tarde y en menor grado que los lechones de madres no vacunadas. Así mismo, se realizó el estudio de la relación genética de los aislados obtenidos en el estudio. Para dicho genotipado se usaron dos técnicas (enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC)‐PCR y multilocus sequence typing (MLST)), que permitieron determinar que en una granja se pueden encontrar un mayor número de cepas diferentes de lo que se creía hasta ahora (16 cepas en este estudio). Igualmente, se observó que había una mayor diversidad de cepas de H. parasuis en los lechones de madres no vacunadas que en los de madres vacunadas. Estos resultados indican que la vacunación de las madres en las granjas retrasa la colonización por esta bacteria en los lechones y reduce en éstos los niveles y diversidad de cepas de H. parasuis. www.cresa.cat ¿Pueden los autotransportadores triméricos mejorar las vacunas contra Haemophilus parasuis? ALEXANDRE OLVERA alex.olvera@cresa.uab.cat Este estudio se centró en la respuesta inmune contra unas proteínas de membrana de H. parasuis, las VtaA. Como muestras se utilizaron sueros de cerdos infectados con una dosis subclínica de cepa Nagasaki (106 UFC) y sueros de cerdos inmunizados con una bacterina de esta misma cepa (equivalente a 109 UFC). Se vio que los animales infectados con una dosis subclínica desarrollaban anticuerpos contra 6 de las 13 VtaA presentes en la cepa Nagasaki a los 42 días postinfección. Curiosamente, los animales vacunados con una bacterina de la cepa Nagasaki no desarrollaban anticuerpos contra las VtaA indicando que estas proteínas no se producen en las condiciones de cultivo de la bacterina. Posteriormente, se utilizaron las VtaA para inmunizar animales. Se analizó la respuesta de anticuerpos mediante ELISA comprobando la existencia de una buena respuesta de anticuerpos tanto de IgG y como de IgA. Se comprobó también la presencia de IgA en el tracto respiratorio, tanto en la nariz como en el pulmón. Se comprobó si esta respuesta de anticuerpos era protectiva desafiando un grupo control y un grupo vacunado (grupos 1 y 3) con 3 x 108 UFC de la cepa Nagasaki y los otros grupos control y vacunados (grupos 2 y 4) con 6 x 106 UFC. Se siguió la supervivencia durante 7 días y se constató la existencia de un 33% de animales protegidos contra un desafío altamente letal (3 x 108 UFC) y de un 57% de animales protegidos contra un desafío letal (6 x 106 UFC). Además, en los supervivientes se vio un incremento de las IgA nasales 7 días después de la infección indicando la posible existencia de memoria humoral. www.cresa.cat Variabilidad genética e inmunológica del virus del Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino y sus implicaciones en el animal LAILA DARWICH laila.darwich@cresa.uab.cat Las vacunas existentes frente al PRRSV otorgan al animal una protección que podemos considerar como parcial y no universal. En estudios realizados en el CReSA se ha observado que diferentes aislados del virus (n=49) muestran diferentes patrones de secreción de citoquinas y que los distintos tipos celulares tienen capacidades de secreción distinta. El siguiente paso que se realizó fue determinar qué partes del genoma del virus estaban involucradas en estos hallazgos. Para ello, se secuenció el genoma completo de 6 cepas del estudio anterior con distintas capacidades inmunológicas. Las conclusiones más importantes extraídas del estudio han sido: las partes más variables del virus son nsp1b‐ nsp2, GP3 y GP4; las ORF5 y 7 no son las mejores opciones para reflejar la similitud entre cepas, pues son poco representativas del genoma completo. Por tanto, la complejidad del virus –variabilidad genética y variabilidad en las capacidades inmunológicas‐ se muestra como notable. Pero, ¿qué repercusión tienen estos hallazgos en el animal? ¿Cómo se reflejan las variaciones encontradas in vitro en una infección? Para poder responder a estas preguntas, en un reciente estudio de protección homóloga/heteróloga, se realizaron infecciones cruzadas con dos cepas de características in vitro y de secuencias genéticas distintas. El resultado fue que la protección frente al PRRSV puede ser incompleta incluso en desafíos homólogos en animales con una respuesta moderada de AN, mientras que la respuesta celular puede limitar la extensión de la infección en animales con niveles de AN nulos o muy bajos. En conclusión, la suma de ambos compartimentos de la respuesta inmune –es decir, respuesta celular y AN‐ parecen ser necesarios para la obtención de una protección total frente a un desafío. www.cresa.cat La gripe porcina: dogmas científicos y verdades GERARD MARTÍN gerard.martin@cresa.uab.cat La gripe porcina, desde su primera detección hasta el presente, ha sido descrita como una infección que provoca una clínica aguda, caracterizada por signos respiratorios, fiebre alta, postración, abortos y anorexia. Otra característica típicamente reportada de la enfermedad es una elevada transmisibilidad, afectando a la gran mayoría de los animales presentes en la explotación provocando un brote con una aparición explosiva. Además, la infección previa de una cepa de influenza genera anticuerpos que serán los encargados de proteger frente futuras infecciones frente a esa misma cepa. No obstante, estas afirmaciones que han llegado a plantearse como los dogmas que caracterizan la enfermedad en cuestión se ponen en duda cuando las seroprevalencias observadas de los virus de la influenza A en el cerdo son muy superiores al número de casos clínicos reportados de gripe porcina. Finalmente, un punto clave de la gripe porcina es que el cerdo se ha descrito tradicionalmente como un crisol donde pueden producirse nuevas recombinaciones de virus, demostrándose con la aparición de virus como el H1N1 pandémico a principios del 2009, el que contenía genes tanto porcinos como aviares y humanos. No obstante, este punto tampoco ha sido demostrado en condiciones de campo. Durante la segunda mitad del 2009 y la primera mitad del 2010 se realizaron dos trabajos de muestreo longitudinal en dos explotaciones de ciclo cerrado seropositivas a influenza. El muestreo se realizó semanalmente en un lote entero de cerdos en cada explotación para determinar la dinámica de la infección del virus. En una de las dos explotaciones se detectó una circulación del subtipo de influenza H1N2 en la semana 17 de vida afectando al 72% de los animales muestreados. Se observó una clínica respiratoria muy leve y los animales seroconvirtieron posteriormente. En la otra explotación se detectó excreción vírica en las semanas 3, 4, 7, 13, 15, 17 y 20 de vida, con valores máximos y mínimos de prevalencia del 26% al 3% respectivamente. Se aislaron dos cepas del subtipo H1N1 (H1N1a y H1N1b) parcialmente distintas a nivel de la neuraminidasa en las semanas 3, 4, 7 y 13, y solo H1N1a en las semanas 15, 17 y 20. Además, se detectó la seroconversión de los animales entre semanas 17 y 20 frente al subtipo H3N2 del que no se obtuvo aislado. No se detectó clínica claramente compatible con gripe en ningún momento del estudio. En la primera explotación, se observó un brote clásico de influenza, causado por la entrada de una cepa de gripe no presente previamente en el grupo de animales, con una rápida transmisión y signos clínicos, si bien muy leves, compatibles con gripe. En la segunda explotación, en cambio, se observan múltiples picos de infección que no tienen el patrón de transmisión típico de la gripe, afectando a un bajo porcentaje de animales en distintas semanas de vida que, además, no se reflejan en sintomatología clínica. Cabe destacar que existen animales que se infectan en dos momentos distintos por la misma cepa, lo que sugiere una protección parcial no esterilizante que no es capaz de impedir la infección pero si la clínica. Esta situación implica la presencia de varios virus de la influenza de forma endémica y subclínica en la explotación, lo que facilitaría, en caso de entrada de otras cepas distintas, nuevas recombinaciones del virus. En conclusión, los resultados observados en la segunda explotación no se explican, en ningún caso, por lo que sería esperable en referencia a lo que se sabe de la infección por el virus de la influenza en el cerdo. Bajo nuestro punto de vista, debería tenerse en cuenta en relación a los planes de vigilancia epidemiológica de la gripe debido a las implicaciones en sanidad pública que ello podría conllevar. www.cresa.cat Desarrollo de nuevas estrategias vacunales frente al virus de la peste porcina Africana FERNANDO RODRÍGUEZ fernando.rodriguez@cresa.uab.cat La peste porcina Africana (PPA) es una enfermedad altamente infecciosa de declaración obligatoria por la Organización Internacional de Sanidad Animal (OIE), la cual afecta al ganado porcino, provocando grandes pérdidas económicas en los países afectados. El agente causal de la enfermedad es el virus de la peste porcina africana (VPPA), clasificado en la familia Asfaviridae. A día de hoy no existe una vacuna eficaz frente al VPPA, por lo que su erradicación depende de un diagnóstico rápido y eficaz de la enfermedad, acompañado del sacrificio de los animales infectados y/o expuestos al virus. La PPA sigue siendo un problema en la mayoría de los países del África subsahariana, donde el virus se mantiene en un ciclo selvático entre los cerdos salvajes y las garrapatas del género Ornithodoros, afectando ocasionalmente a los cerdos domésticos. Fuera de África la enfermedad sigue siendo una amenaza constante, como se ha demostrado con la reciente aparición de un nuevo brote de la enfermedad en la zona del Cáucaso que podría extenderse a las regiones vecinas. Así pues, el principal objetivo de nuestra línea de investigación, fruto de la colaboración entre el CReSA y otros centros de investigación nacionales e internacionales, es el desarrollo de nuevas estrategias vacunales frente al VPPA, utilizando la inmunización con ADN como herramienta principal. Lógicamente, para la evaluación de los prototipos vacunales diseñados se cuenta con un modelo de reproducción de la PPA en cerdo doméstico, el cual se realiza en las instalaciones de bioseguridad de nivel 3 del CReSA. En un principio, nuestras vacunas experimentales se centraron en tres proteínas inmunodominantes del VPPA (p30, p54 y HA) como antígenos vacunales. Así, se pudo demostrar que la respuesta inmune inducida con las vacunas ADN en el cerdo, podían ser mejoradas dirigiendo los antígenos a las células presentadoras de antígeno (CPAs). Del mismo modo, se pudo demostrar que una vacuna ADN codificando estos tres antígenos fusionados al polipéptido celular ubiquitina, era capaz de conferir una protección parcial frente al desafío con una dosis letal del VPPA, en ausencia de anticuerpos. Los datos demostraron no sólo la relevancia de la respuesta inmune celular en la protección conferida, sino además la necesidad de elegir tanto el antígeno ideal como la estrategia de vacunación adecuada a la hora de conferir protección frente a esta enfermedad. Partiendo de estos datos, actualmente nos encontramos caracterizando nuevos candidatos vacunales de entre los antígenos del VPPA (codifica para más de 150 y sólo hemos utilizado 3 en nuestra primera vacuna experimental). Estos nuevos antígenos podrían ser incorporados en un futuro más o menos próximo en una nueva formulación vacunal, más eficiente que la actualmente disponible. Los prometedores resultados preliminares obtenidos en el laboratorio serán discutidos durante la presentación. www.cresa.cat