II. CARACTERIZACIÓN DEL AROMA DE UN VINO PINOT NOIR DE ALTURA TROPICAL COLOMBIANO EN COMPARACIÓN CON VINOS CHILENOS Mario G. Olarte-Plata1* y Andrés F. Peralta B.1 Universidad de los Andes, Departamento de Química. Cra. 1 N° 18ª-10 Edificio Q, Lab. 702 Bogotá D.C. Colombia *mari-ola@uniandes.edu.co y aperalta@uniandes.edu.co RESUMEN Un bouquet de aroma complejo e intenso es el primer criterio de calidad buscado en un vino. Este es el resultado tanto de formación de compuestos aromáticos y precursores en las uvas, como la transformación de estos por vías enzimáticas y biológicas en la fermentación y añejamiento. Se caracterizó el perfil de volátiles de un vino Pinot Noir de altura tropical (Boyacá, Colombia) mediante microextracciòn en fase sólida por espacio de cabeza (HS-SPME) y análisis por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) y se comparó con otros Pinot Noir Chilenos de la misma añada. Se encontraron 58 compuestos volátiles en el vino Colombiano, en comparación a 51 y 48 en los vinos chilenos estudiados correspondiendo a los ésteres en su gran mayoría para los tres vinos. Los compuestos mayoritarios en Pinot Noir Marques de Puntalarga fueron 2hidroxibenzoato de metilo con 36.6% y alcohol isopentílico con 10%; en Sibaris fueron propanoato de ciclohexilo con 31% y hexanoato de metilo con 11.6%; en Costa Vera fueron octanoato de etilo con 31.5% y decanoato de etilo con 19.87%. La técnica HSSPME es ideal para esta caracterización puesto que no hay transformación de los compuestos volátiles ni formación de artefactos en la extracción. Palabras claves: HS-SPME, Aroma del vino, Pinot Noir, GC-FID, GC-MS ABSTRACTS The complexity and intensity of a wine bouquet is the most important quality criteria in wine industry. It is composed by aroma compounds and precursors formed in the plant and transformations of these during the fermentation and aging processes by biological enzymatic routes. The volatile compound profile of a tropical altitude Pinot Noir Wine (Boyacá, Colombia) was obtained by Head Space Solid Phase Micro extraction (HSSPME) and analyzed with a gas chromatography-flame ionization detector (GC-FID) and mass spectrometry (GC-MS); the result was compared with those obtained from two Chilean Pinot Noir of the same vintage. 58 aroma compounds were found in the Colombian wine, to be compared with 51 and 48 in the Chilean wines; the majority of these compounds were esters in all three wines. Major compounds in the Colombian Pinot Noir were methyl-2-hydroxy benzoate with 36.6% and isopentanol with 10%. The HS- SPME technique is ideal for this study because it does not create volatile compound transformations or artifact formation by the extraction process. Keywords: HS-SPME, wine aroma, Pinot Noir, GC-FID, GC-MS I. INTRODUCCIÓN El análisis de volátiles en vinos durante muchos años ha sido un criterio de control de calidad en la industria vinícola y gracias a ello se han desarrollado técnicas analíticas de punta, encontrado nuevos compuestos que contribuyen al conocimiento del aroma. El perfil de volátiles depende de factores ambientales, como suelo (terroir), cepa de levadura, variedad de vino y el método de vinificación. Mediante estos métodos se puede controlar denominaciones de origen y detectar fraudes, así como la verificación de la presencia de compuestos de aroma no deseados (off flavors). En Colombia, la producción de vinos de alta calidad está comenzando a desarrollarse; el valle del sol (Boyacá) es una región con características ambientales aptas para cepas como Pinot Noir y Riesling; alta exposición solar, dos grandes periodos secos, temperaturas máximas altas en el día y mínimas bajas en la noche, entre otras permiten la producción de vinos de alta calidad comparables con aquellos producidos en regiones tradicionales. Las uvas de la mayoría de variedades de vitis vinífera usadas en la producción de vino presentan similitudes en su aroma, con algunas excepciones como monoterpenoides en variedades moscato, y 2-alquil-3-metoxypirazinas en cabernet sauvignon (Baumes, 1998). Estas uvas contienen diferentes grupos de precursores de aroma no volátiles como carotenoides, ácidos fenólicos, lípidos insaturados, conjugados de s-cisteìna, glicoconjugados y s-metilmetionina; estos compuestos son transformados a volátiles en diferentes etapas de la producción del vino, desde el momento de prensado de las uvas hasta la maduración del vino. Estos compuestos son generalmente metabolitos secundarios en procesos bioquímicos de la planta pero también son dependientes en factores ambientales y en prácticas enológicas. La composición del aroma en los vinos incluye una gran variedad de compuestos: alcoholes y ésteres, producidos en la fermentación y dependientes de la levadura usada aunque no hacen una contribución importante a la percepción sensorial final (Ebeler y Thorngate, 2009); terpenos, biosintetizados en las uvas, son influenciados por condiciones climáticas y de vinificación, contribuyen notas florales y cítricas importantes; Norisoprenoides, derivados de carotenoides y presentes a nivel de trazas, producidos por hidrólisis en la fermentación pueden contribuir en gran manera al aroma debido a sus bajos umbrales de olor, sus precursores son dependientes del clima, la exposición solar y madurez; componentes volátiles azufrados, contribuyen a olores no deseados en el vino y son producidos en su mayoría en la fermentación cuyos precursores son aminoácidos azufrados (Ugliano y Henschke, 2009). Con el desarrollo de la cromatografía de gases se empezó el análisis de compuestos volátiles mayoritarios (ésteres y alcoholes) y no fue hasta el desarrollo de técnicas de extracción como: destilación-extracción, simultáneas con disolvente (SDE) y extracción líquido-líquido (LL) que fue posible identificar la gran variedad de compuestos presentes en la fracción volátil del vino. En los últimos 20 años, se ha encontrado que por efectos de tratamiento de la muestra y comparando las técnicas entre sí existe formación de artefactos; técnicas como extracción con fluidos supercríticos (SFE), extracción por barra de agitación con adsorbente (SBSE) (Fang y Qian, 2006) y microextracción en fase sólida por espacio de cabeza (HS-SPME) (Tat et al., 2005) disminuyen la formación de artefactos. El presente trabajo muestra el perfil cromatográfico del aroma del vino Pinot Noir Rubí Marqués de Puntalarga producido en el Valle del Sol, Boyacá, Colombia y se comparó con Pinot Noir comerciales Chilenos. Extracción de Volátiles. La extracción de volátiles se realizó por el método de microextracción en fase sólida por espacio de cabeza (HS-SPME). Siguiendo la técnica de Demyttenaere et al. 2003. Se escogió la fibra de 65 m polidimetilsiloxano/divinil benceno (PDMS/DVB), (Supelco Inc., Bellefonte, USA) la cual fue activada de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para cada extracción se midieron 7,5 mL de vino y se colocaron en un vial de 15 mL bajo agitación magnética a 100 min-1 y a un baño de refrigeración de 25 °C durante 15 min para establecer el equilibrio en la fase de vapor. Después de este tiempo, la fibra para SPME se expuso para adsorber los volátiles del espacio de cabeza durante 30 min y se desorbió en el inyector del cromatógrafo (Demyttenaere et al., 2003; Quijano y Pino, 2007). Análisis cromatográfico. Cromatografía de Gases acoplada a detector de llama (GC-FID) II. MATERIALES Y MÉTODOS Materiales. Muestras de Vino. Se escogieron 3 vinos para el presente estudios Pinot Noir cosecha del 2008, de ellos dos fueron chilenos (Sibaris, Costa Vera) comprados en el comercio y el Pinot Noir Rubí Marques de Punta Larga Valle del Sol, Boyacá, Colombia. El viñedo del vino colombiano se encuentra situado en la Cordillera Oriental de los Andes (5.78 °N, 72.98 °O) en, entre 2500 y 2600 metros de altitud. Se usó un equipo HP 6890 con detector de llama (FID) equipado con una columna capilar HP-5MS marca Agilent de (30 m x 0.25 mm x 0,25 m) no polar con fase estacionaria de (5%-fenil)metilpolisiloxano. El gas de arrastre fue helio a razón de 1 mL/min, la temperatura del inyector y del detector se mantuvo a 230 °C. La fibra para cada muestra fue introducida en el inyector del GC para desorción de los volátiles durante 4 min en el modo de splitless. La temperatura para la columna fue de 50 °C durante 4 min, luego se incrementó la temperatura a razón de 4 °C/min hasta 230 °C y se mantuvo a esta última durante 10 min hasta terminar la separación. Posteriormente se limpió la fibra durante 10 min en el inyector a una temperatura de 230 °C. Los índices de retención de Kovats ( Kovtas, E, 1958) se calcularon con ayuda de una mezcla de parafinas de C7 a C25 (Ik entre 700 y 2500). Cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (GC-MS) Se empleó un equipo HP 6890 Series II acoplado a un detector de masas HP5973N. Las condiciones de separación y el programa de temperatura fueron similares a las usadas para GC-FID en todos los casos. Los espectros de masas se obtuvieron en modo de ionización electrónica (EI) a 70 eV con un barrido de 1.8 scans/s y con un rango de m/z 35300. III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Análisis de Volátiles. El contenido de cada compuesto fue calculado por integración de los picos de áreas de los componentes obtenidos por GC-FID. El área de los picos se expresó en porcentaje teniendo en cuenta las desviaciones estándar de las réplicas y el contenido total de volátiles en los cromatogramas (Quijano y Pino, 2007). Los constituyentes fueron identificados por comparación de los espectros de masas con las referencias estándar de la bases de datos propia FLAVORLIB o comerciales (NBS y NIST) y con el apoyo de los índices de retención lineales para una columna HP5 (Adams, 2001; Alves and. Jennings, 1979), y comparados con aquellos obtenidos por el grupo de investigación. La técnica HS-SPME (Harmon, A.D. 2002), es ideal para el análisis de componentes volátiles y de concentraciones traza por su gran sensibilidad y rapidez de la determinación. Se encontraron 78 compuestos en total en las muestras estudiadas, de estos fueron identificad La tabla 2, muestra los compuestos identificados, el porcentaje de cada uno de ellos, referidos a la suma de las áreas obtenidas en los cromatogramas os 72 en 3 vinos: Pinot Noir (PN): Marqués de Puntalarga (MP), Sibaris (S) y Costa Vera CV). TABLA 1. Composición de volátiles en los vinos Pinot Noir Ikt Ikex Compuesto % %S %CV MP 1 528 2 Acetaldehído 1,56 3,85 0,58 NI 0,64 1,31 0,13 - 0,20 0,04 3 646 propanoato de etilo 4 648 Crotonaldehído 0,13 - 0,47 5 668 Etanol 1,23 3,20 0,08 6 690 isobutanoato de metilo 0,27 - - 7 733 731 2-metil-1-butanol 8,04 9,89 8,42 8 734 733 alcohol isopentílico 10,05 4,47 1,27 9 736 737 3-metil-1-butanol 4,81 - 1,71 10 739 739 2-metil -1-butanol 0,12 0,43 0,55 11 785 786 ciclopentanol - 0,39 0,12 787 NI (ester) 0,68 0,26 0,11 12 13 789 789 2,3-Butanodiol 0,24 0,16 0,14 14 803 804 butanoato de etilo 0,56 0,66 0,37 15 809 810 2-hidroxipropanoato de etilo (lactato) - 1,21 0,74 16 838 840 Pentanol 1,59 - - 17 858 861 isopentanoato de etilo 1,82 1,24 0,22 18 867 864 1-hexanol 2,51 0,48 0,30 19 880 878 acetato de 2-metilbutilo 0,68 0,17 3,39 20 883 882 acetato de 3-metil-3-buten-1ol 0,11 - 3,39 21 892 894 heptanona 0,15 - - 22 906 906 2-etilpirazina 0,64 4,57 0,06 23 911 912 ácido pentanoico - 0,14 0,08 24 961 958 Benzaldehído 0,34 - - 25 965 963 1,3,5, trimetil benceno - 0,21 0,08 26 967 968 1-Heptanol 0,05 - 0,06 27 972 972 propanoato de pentilo 3,49 - - 28 979 979 1-Octen-3-ol 1,10 - - 29 986 985 2-pentil furano 0,31 - - 30 988 990 1,5-octadien-3-ol 4,36 - - Ikt Ikex Compuesto % %S %CV 0,31 11,66 8,48 - 0,27 - MP 31 998 999 hexanoato de metilo 32 1003 1000 a-terpineno 33 1004 1003 acetato de (E)-3-hexilo 0,08 0,16 - 34 1007 1005 E-2-hexenoato de etilo - 0,15 - 35 1026 1030 heptanoato de metilo 1,00 - - 36 1027 1032 δ-3-careno 0,16 0,19 - 1035 Ni ( parafina ramificada) - 0,12 0,08 0,31 6,27 - 37 38 1032 1034 alcohol bencílico 39 1033 1036 Limoneno - 0,13 - 40 1062 1063 2-hidroxipropanoato de isobutilo - 0,16 0,09 41 1068 1066 2-hidroxihexanoato de etilo - 0,10 0,09 42 1071 1073 1-octanol 0,66 0,20 0,13 43 1089 1088 -terpinoleno - 1,14 - 44 1098 1097 heptanoato de etilo 2,00 - 0,08 45 1102 1103 Nonanal 1,59 - - 46 1110 1112 alcohol feniletílico 0,26 - 5,34 47 1133 1335 propanoato de ciclohexilo - 31,08 - 48 1159 1160 ácido benzoico 0,08 - - 49 1160 1164 cis-dehidro-β-terpineol 0,27 - 0,10 50 1171 1173 1-Nonanol 0,29 0,13 - 51 1179 1189 succinato de dietilo 0,32 8,67 8,65 52 1192 1194 salicilato de metilo 36,36 0,07 0,15 53 1197 1198 octanoato de etilo 0,11 0,08 31,58 54 1199 2000 -terpineol 0,01 0,10 0,05 55 1211 1208 acetato de octilo 0,05 0,27 - 56 1256 1258 hexanoato de isopentilo 0,11 0,21 0,07 57 1265 1269 Geranial - 0,32 - 58 1270 1272 pentanoato de furfuilo 0,22 - - 59 1281 1284 Vitispirano 0,04 0,84 0,36 60 1294 1297 nonanoato de etilo 0,01 0,34 0,10 61 1355 1356 1,2-dihidro-1,1,6-trimetil naftaleno - 0,18 0,02 Ikt Ikex Compuesto % %S %CV - 0,33 0,09 MP 62 1370 1375 Undecanol 63 1382 1381 4-decenoato de etilo 0,80 0,83 0,52 1383 NI 7,52 0,09 0,04 1385 propanoato de isobornilo - 0,07 - 1387 (3S,4R,5S,6R,7S)-Aristol-9-en-3-ol (Tentativo) - - 0,06 0,08 0,14 19,87 - 0,23 0,16 0,95 - - - 0,63 0,21 64 65 1382 66 67 1398 1399 decanoato de etilo 68 1450 1451 octanoato de 2-metilbutilo 69 1469 1472 -decalactona 1536 14-beta pregnano ( tentativo) 70 71 1554 1552 9-hexadecenoato de etilo 0,05 - - 72 1597 1593 dodecanoato de etilo ( laurato de etilo) 0,11 1,75 0,77 73 1724 1721 tetradecanoato de metilo 0,17 - 0,38 1733 7-Hidroxi-2-metil-octa-3,5-dienol (tentativo) 0,07 - - 74 75 1876 1875 1-hexadecanol 0,05 - - 76 1922 1923 hexadecanoato de metilo 0,34 - - 77 2078 2072 Octadecanol 0,12 - - 78 2125 2133 octadecanoato de metilo - 0,24 0,23 Ikt e IKex son Indices de retención teóricos y experimental en columna HP-5 MS, (% MP) Porcentajes en Marquéz de Punta larga, (%S) porcentajes en Sibera , (%CV) porcentaje en Costa Vera, NI, compuesto no identificado. La tabla 1, muestra la composición del aroma de los vinos estudiados, el porcentaje de cada uno de ellos, referidos a la suma de las áreas obtenidas en los cromatogramas y los Indices de Kovats, teóricos y experimental para una columna cromatográfica HP-5MS. Las gráficas 1, 2 y 3, muestran los porcentajes para cada vino teniendo en cuenta las cantidades por grupo funcional. Como se aprecia hay una baja concentración en ácidos orgánicos volátiles en los tres vinos, esto les confiere buenas características sensoriales, debido a que estos son productos de la oxidación de los alcoholes presentes en el vino. Figura 1. Distribución de compuestos en el perfil de volátiles de PN MPL. Figura 2. Distribución de compuestos en el perfil de volátiles de PN Sibaris. Figura 3. Distribución de compuestos en el perfil de volátiles de PN Costa Vera. El mayor porcentaje por grupo funcional de compuestos corresponde a los ésteres en las tres muestras, seguido en menor proporción por los alcoholes y aldehídos, sin embargo esta tendencia no se observa en todos los vinos. De acuerdo con la tabla, el que presenta mayor contenido de ésteres en número es el MP seguido por CV y S. estos compuestos aportan gran importancia sensorial en el bouquet de los vinos. Se identificaron compuestos muy interesantes como son los hidroxiésteres químicamente importantes por la presencia de carbonos quirales. Solamente en MP se encontró decalactona, éster cíclico proveniente de un hidroxicompuesto, también de gran interés sensorial. Otros compuestos de gran aporte al aroma son los terpenos, en su mayoría monoterpenos y algunos de ellos oxigenados. Por otra parte, los alcoholes alifáticos hidroxilados en el carbono 1 son comunes en todos los vinos, de C5 a C11, algunos también metilados en el carbono 2 y 3 fueron identificados en los 3 vinos. Un compuesto proveniente de la degradación de carotenoides como C13 norisoprenoide fue identificado e igualmente un vitispirano al que se le alude una sensación fresca frutal. IV. CONCLUSIONES En los vinos estudiados para volátiles se encontraron 58 compuestos en Marqués de Puntalarga, 51 en Sibaris y 48 en Costa Vera. Los compuestos mayoritarios en Pinot Noir Marques de Puntalarga fueron 2hydroxi benzoato de metilo con 36.6% y alcohol isopentílico con 10%; en Sibaris fueron propanoato de ciclohexilo con 31% y hexanoato de metilo con 11.6%; en Costa Vera fueron octanoato de etilo con 31.5% y decanoato de etilo con 19.87%. Es muy posible que la altitud del viñedo juegue un rol importante en la formación de compuestos y precursores aromáticos; el vino Marqués de Puntalarga tiene todas las características sensoriales aptas para competir internacionalmente en el mercado de los vinos de alta calidad. V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Adams, R. P. (2001). 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New York. p: 313-392. AGRADECIMIENTOS Al Dr. Marco Quijano, por facilitar las muestras de los vinos y el acceso a las instalaciones de los viñedos en Punta Larga (Boyacá) y a la Dra. Clara E Quijano por su colaboración y guía en el desarrollo del presente trabajo.