Presentación

Análisis calorimétrico como alternativa en
el diagnóstico de fibrosis hepática
Dr. Galileo Escobedo
Investigador en Ciencias Médicas “D”
Unidad de Medicina Experimental
Hospital General de México
Septiembre de 2011
Hígado normal (10X)
Sujetos sanos
Hígado1-3
Plasma4,5
5-7% de proteínas de matriz
extracelular (PME)
(colágeno I, III y IV, laminina,
fibronectina, elastina, ácido
hialurónico, condroitin sulfato, heparán
sulfato)
Fosfatasa ácida, ALT, AST, GGT,
albúmina, α-fetoproteína,
apolipoproteína A1, proteínas del
complemento, fibrinógeno,
haptoglobina, IGF-1, mioglobina,
factores de coagulación, insulina,
antitrombina III, pancreastatina.
Gressner AM, 1991. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 29:293-311. 2 Rojkind M, 1982. Fibrogenesis in The Liver: Biology and Pathobiology.
Raven Press. NY. pp 57-90. 3Burgerson and Olsen, 1990. Curr Opinion Cell Biol. 2:830-838. 4Skovgard-Veidal S et al., 2010. Dis Markers.
28:15-28. 5Anderson NL, 2010. Clin Chem. 56:177-185.
1
Hígado normal (10X)
Sujetos sanos
Hígado1-3
Plasma4,5
Hígado con fibrosis (10X)
Pacientes con fibrosis hepática
5-7% de proteínas de matriz
extracelular (PME)
(colágeno I, III y IV, laminina,
fibronectina, elastina, ácido
hialurónico, condroitin sulfato, heparán
sulfato)
20-40% de PME
Fosfatasa ácida, ALT, AST, GGT,
albúmina, α-fetoproteína,
apolipoproteína A1, proteínas del
complemento, fibrinógeno,
haptoglobina, IGF-1, mioglobina,
factores de coagulación, insulina,
antitrombina III, pancreastatina.
ALT, AST, GGT, albúmina,
haptoglobina, apolipoproteína A1, IGF1, factores de coagulación, bilirrubina,
ácido hialurónico, MMP1, MMP9,
TIMP1, laminina, colágeno IV and VI,
procolágeno III, propéptido procolágeno
C-terminal.
(colágeno I, III, IV y VI, laminina,
fibronectina, elastina, ácido hialurónico,
condroitin sulfato, heparán sulfato,
entactina, undulina, dermatan sulfato)
Gressner AM, 1991. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 29:293-311. 2 Rojkind M, 1982. Fibrogenesis in The Liver: Biology and Pathobiology.
Raven Press. NY. pp 57-90. 3Burgerson and Olsen, 1990. Curr Opinion Cell Biol. 2:830-838. 4Skovgard-Veidal S et al., 2010. Dis Markers.
28:15-28. 5Anderson NL, 2010. Clin Chem. 56:177-185.
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Hígado normal (10X)
Sujetos sanos
Hígado1-3
Plasma4,5
Hígado con fibrosis (10X)
Pacientes con fibrosis hepática
5-7% de proteínas de matriz
extracelular (PME)
(colágeno I, III y IV, laminina,
fibronectina, elastina, ácido
hialurónico, condroitin sulfato, heparán
sulfato)
20-40% de PME
Fosfatasa ácida, ALT, AST, GGT,
albúmina, α-fetoproteína,
apolipoproteína A1, proteínas del
complemento, fibrinógeno,
haptoglobina, IGF-1, mioglobina,
factores de coagulación, insulina,
antitrombina III, pancreastatina.
ALT, AST, GGT, albúmina,
haptoglobina, apolipoproteína A1, IGF1, factores de coagulación, bilirrubina,
ácido hialurónico, MMP1, MMP9,
TIMP1, laminina, colágeno IV and VI,
procolágeno III, propéptido procolágeno
C-terminal.
(colágeno I, III, IV y VI, laminina,
fibronectina, elastina, ácido hialurónico,
condroitin sulfato, heparán sulfato,
entactina, undulina, dermatan sulfato)
Gressner AM, 1991. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 29:293-311. 2 Rojkind M, 1982. Fibrogenesis in The Liver: Biology and Pathobiology.
Raven Press. NY. pp 57-90. 3Burgerson and Olsen, 1990. Curr Opinion Cell Biol. 2:830-838. 4Skovgard-Veidal S et al., 2010. Dis Markers.
28:15-28. 5Anderson NL, 2010. Clin Chem. 56:177-185.
1
Hígado normal (10X)
Sujetos sanos
Hígado1-3
Plasma4,5
Hígado con fibrosis (10X)
Pacientes con fibrosis hepática
5-7% de proteínas de matriz
extracelular (PME)
(colágeno I, III y IV, laminina,
fibronectina, elastina, ácido
hialurónico, condroitin sulfato, heparán
sulfato)
20-40% de PME
Fosfatasa ácida, ALT, AST, GGT,
albúmina, α-fetoproteína,
apolipoproteína A1, proteínas del
complemento, fibrinógeno,
haptoglobina, IGF-1, mioglobina,
factores de coagulación, insulina,
antitrombina III, pancreastatina.
ALT, AST, GGT, albúmina,
haptoglobina, apolipoproteína A1, IGF1, factores de coagulación, bilirrubina,
ácido hialurónico, MMP1, MMP9,
TIMP1, laminina, colágeno IV and VI,
procolágeno III, propéptido procolágeno
C-terminal.
(colágeno I, III, IV y VI, laminina,
fibronectina, elastina, ácido hialurónico,
condroitin sulfato, heparán sulfato,
entactina, undulina, dermatan sulfato)
Gressner AM, 1991. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 29:293-311. 2 Rojkind M, 1982. Fibrogenesis in The Liver: Biology and Pathobiology.
Raven Press. NY. pp 57-90. 3Burgerson and Olsen, 1990. Curr Opinion Cell Biol. 2:830-838. 4Skovgard-Veidal S et al., 2010. Dis Markers.
28:15-28. 5Anderson NL, 2010. Clin Chem. 56:177-185.
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Conclusión #1:
La fibrosis hepática lleva a cambios composicionales
tanto a nivel local (hígado) como a nivel sistémico
(plasma).
La calorimetría es una técnica de análisis fisicoquímico capaz de determinar
variaciones composicionales en un compuesto particular, con base en sus
valores de capacidad calorífica, flujo de calor y temperaturas de transición 3,4.
Capacid
ad
calorífic
a
Temperat
ura de
transición
Flujo de
calor
Jelesarov and Bosshard, 1999. Journal of molecular recognition. 12:13-18. 2Dean JA, 1995. The analytical chemistry handbook. New York, McGraw Hill, Inc. pp. 15.1-15.5. 3Liang Y et
al., 2001. European Journal of Biochemistry. 268:4183-4189. 4Grinberg VY et al., 2000. Journal of biotechnology. 79:269-280.
1
La capacidad calorífica es la cantidad de calor requerido para modificar la temperatura de un
compuesto en una cantidad determinada. El flujo de calor es la cantidad de energía térmica
transferida de los alrededores al compuesto. La temperatura de transición o de transición de
fase es la temperatura a la que el compuesto cambia de un estado fisicoquímico a otro 1.
Estas propiedades térmicas varían dependiendo de la composición molecular del compuesto.
1
Dean JA, 1995. The analytical chemistry handbook. New York, McGraw Hill, Inc. pp. 15.1-15.5.
Conclusión #2:
La calorimetría es capaz de determinar cambios en la
composición de un material.
Tomando en cuenta que:
1. Es necesario diseñar métodos de diagnóstico enfocados en determinar los estadios inicial
(F1) e intermedio (F2) de la fibrosis hepática.
2. La fibrosis hepática lleva a cambios composicionales en el hígado y en el plasma.
3. La calorimetría es capaz de determinar
material.
variaciones en la composición de cualquier
Hipótesis
A nivel plasmático y hepático, la capacidad calorífica, el
flujo de calor y la temperatura de transición son
significativamente distintos entre sujetos sanos y sujetos
con distintos grados de fibrosis hepática.
Metodología
F1
1 mes
F2
2.5 meses
20 mg/200
µL
F3
5 meses
Análisis
calorimétrico
Capacidad Calorífic
Flujo de Calor
Temp. de transición
Vehículo = aceite de olivo, 2 mL/Kg de peso
CCl4 = 2:5 v/v en aceite de olivo, 2 mL/Kg de peso
Resultados preliminares
F0
F1
F2
F3
**
**
*
*P<0.05; **P<0.001
Resultados preliminares
Plasma
Resultados preliminares
Tejido hepático
Conclusiones
El plasma de ratas sanas es calorimétricamente distinto al proveniente
de ratas F2 (capacidad calorífica 3 veces mayor en F2 que en F0) .
La temperatura de transición en el tejido hepático sano ocurrió a los
90-95°C, mientras que para el tejido F2 este cambio se observó a los 73,
77, 83 y 90°C. Para el tejido F3 se registraron cinco cambios de fase a los
67, 75, 80, 84 y 90°C.
El grado de fibrosis parece ser proporcional al aumento en el número de
transiciones de fase del tejido hepático.
En términos de capacidad calorífica, el plasma de ratas con daño
hepático moderado (F2) por administración de CCl 4 es distinto al
proveniente de ratas con un nivel inicial de daño (F1).
El tejido hepático F1 muestra dos transiciones de fase (90 y 95°C)
mientras que el F0 muestra una (94°C).
En términos calorimétricos, las muestras plasmáticas de ratas sanas y
F1 son iguales.
La proteómica es una herramienta molecular útil en la separación, cuantificación e
identificación de una proteína en particular o de un grupo de estas 1,2,3.
Gel 1: Sujeto sano
Propiedades Fisiopatológicas
Gel 2: Cirrosis (NAFLD)
No.
Proteína
Regulación
1
Apolipoproteína
A1 Isoforma 1
2
Apolipoproteína
A1 Isoforma 2
3
Apolipoproteína
A1 Isoforma 3
-
4
Apolipoproteína
A4
+
5
Ag parecido a CD5
+
Cheung KJ et al., 2009. J Viral Hepatol, 16:418-429. 2Diamond DL et al., 2006. Hepatology, 44:299-308. 3Anderson NL, 2010. Clin Chem, 56:177-185.
1
La proteómica es una herramienta molecular útil en la separación, cuantificación e
identificación de una proteína en particular o de un grupo de estas 1,2,3.
Gel 1: Sujeto sano
¿Hay un mapa proteómico-calorimétrico
asociado con la fibrosis hepática?
Propiedades Fisiopatológicas
Gel 2: Cirrosis (NAFLD)
Propiedades Térmicas
No.
Proteína
Regulación
Capacidad
Calorífica
Flujo
de
Calor
Temp. de
Transición
1
Apolipoproteína
A1 Isoforma 1
¿?
¿?
2
Apolipoproteína
A1 Isoforma 2
¿?
¿?
¿?
3
Apolipoproteína
A1 Isoforma 3
-
¿?
¿?
¿?
¿?
4
Apolipoproteína
A4
+
¿?
¿?
¿?
5
Ag parecido a CD5
+
¿?
¿?
¿?
Cheung KJ et al., 2009. J Viral Hepatol, 16:418-429. 2Diamond DL et al., 2006. Hepatology, 44:299-308. 3Anderson NL, 2010. Clin Chem, 56:177-185.
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Perspectivas
Analizar las propiedades calorimétricas de muestras séricas
provenientes de sujetos sanos y pacientes con distintos grados de
fibrosis/cirrosis por distintos agentes etiológicos.
Analizar las propiedades proteómico-calorimétricas de muestras séricas
provenientes de sujetos sanos y pacientes con distintos grados de
fibrosis/cirrosis por distintos agentes etiológicos.
¿Qué se ha obtenido?
Resultados preliminares (go on!)
Financiamiento por parte de la Fundación Mexicana para la Salud
(Proyecto F-583 Antonio Ariza Cañadilla para Jóvenes Investigadores) y el
CONACYT (Proyecto CB-2009-01-129316 Apoyo a Iniciativas de Jóvenes
Investigadores).
¿Qué falta?
Sueros de pacientes con distintos grados de fibrosis/cirrosis asociada a
HCV, ALD, NAFLD, PBC (n=45).
Cámara de Isoelectroenfoque.
Agradecimientos
Dr. David Kershenobich
Dr. José Luis Arjona
Dr. Guillermo Robles
Dra. Adela Rodríguez
Dra. Gabriela Gutiérrez
Dra. Yolanda López Vidal
Dra. Carolina Guzmán
Dr. Gonzalo Castillo Rojas
Dr. Joselín Hernández
Dr. Antonmaría Minzoni
Dr. Jesús Aguirre
QFB. Karina Suárez Álvarez
pQFB. Giuliana López
Navarrete