FEMALE SILKWORMS HAVE THE SEX FACTOR
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Irene Millán Crespo Diciembre 2014 FEMALE SILKWORMS HAVE THE SEX FACTOR Marec, F. (2014) Female silkworms have the sex factor. Nature 509:570-571 INTRODUCCIÓN Antecedentes En insectos, la determinación del sexo es frecuentemente controlado por la regulación sexo-­‐ específica del gen doublesex1. En el gusano de seda Bombyx mori, al igual que en Drosophila melanogaster, la transcripción y el posterior procesamiento por splicing alterna=vo del gen doublesex da lugar a diferentes formas de mRNA en hembras y en machos2. Estos transcritos, a su vez, son responsables de la ac=vación de genes específicos de cada sexo1. Pese a que el mecanismo de splicing alterna=vo asociado a doublesex ha sido estudiado en profundidad en D. melanogaster, hasta el momento se desconoce el factor determinante de sexo que controla el splicing del alterna=vo del transcrito del gen doublesex de B. mori (Bmdsx)3. El gusano de seda Bombyx mori usa un sistema de determinación sexual basado en los cromosomas WZ. En este sistema, los machos =enen dos cromosomas Z mientras que las hembras cuentan con un cromosoma W y otro Z. El cromosoma W actúa de forma dominante frente al cromosoma Z, dando lugar al desarrollo de una hembra cuando está presente en el genoma de un embrión. Esto sugiere la existencia de un gen feminizador dominante en el cromosoma W. Sin embargo, estudios previos demuestran que el cromosoma W no posee genes que codifican para proteínas sino que consiste principalmente en transposones. Asimismo, se ha observado que los únicos transcritos producidos a par=r de este cromosoma son ARNs asociados a PIWI (piRNAs), es decir, pequeños RNAs que inhiben a los transposones en las gónadas mediante la interacción con proteínas PIWI. Sin embargo, la función de estos piRNAs en relación con la determinación sexual sigue siendo un misterio4. Obje,vo del estudio En este estudio Kiuchi et al. (2014)5 pretenden resolver los dos interrogantes recién planteados: -­‐ ¿Cuál es el factor determinante de sexo que controla el splicing alterna=vo en B. mori? -­‐ ¿Cuál es el papel de los piRNAs en la determinación sexual en B. mori? Asimismo, el estudio pretende desvelar por primera vez el funcionamiento de regulación de la determinación del sexo en Lepidoptera mediante la iden=ficación de los factores implicados. RESULTADOS Y MÉTODOS Existe un piRNA codificado por el cromosoma W que se da únicamente en hembras Con el fin de estudiar el patrón de splicing alterna=vo del transcrito del gen Bmdsx en B. mori, Kiuchi et al. (2014) llevaron a cabo un análisis de los RNAs formados a par=r de este gen en embriones hembra y macho. Para ello realizaron un Northern blot usando como sonda secuencias correspondientes a exones del gen Bmdsx. El pre-­‐mRNA se procesa de formas diferentes dando lugar Resumen Genética Molecular FEMALE SILKWORMS HAVE THE SEX FACTOR 1 Irene Millán Crespo Diciembre 2014 a diferentes mRNAs en hembras y machos (Figura 1a). Los resultados de este experimento sugieren que las variantes de splicing que se dan en las hembras (marcadas con una F en la figura) también se dan en machos, mientras que existen unas variantes de splicing que tan solo se dan en los machos (marcadas con una M). Esto sugiere que la señal feminizadora se encuentra en el cromosoma W, ya que es el único cromosoma que se da en las hembras y no en los machos. Mediante una secuenciación completa de los transcritos presentes en embriones de dis=nto sexo, Kiuchi et al. (2014) observaron que el cón=go comp73859_c0 se expresaba de forma diferente en hembras y en machos. Con el fin de ver si la expresión diferencial es debida a la presencia o no de esta región en uno de los sexos, se amplificó el cón=go comp73859_c0 por PCR usando muestras de DNA de ambos sexos. Finalmente se observó que éste se da únicamente en hembras (Figura 1b). Asimismo, no se encontró ninguna iden=dad relevante entre la secuencia del cón=go y aquellas correspondientes al genoma del gusano de seda6, lo que sugiere que ésta se encuentra en el cromosoma W. Posteriormente se observó que el cromosoma W =ene mul=ples copias de esta secuencia repe=das en tándem. Los transcritos correspondientes al cón=go comp73859_c0 se transcribieron reversamente a DNA y este se cuan=ficó posteriormente por RT-­‐qPCR. Tal y como se muestra en el gráfico de la figura 1 c, la expresión en hembras alcanza el pico 18 horas después de la ovoposición y después disminuye mientras que en machos no se expresa nunca. Kiuchi et al. (2014) mapearon dis=ntos piRNAs sobre la secuencia correspondiente al cón=go, realizaron Northern blot usando una sonda que hibrida con el transcrito anterior y observaron que la secuencia correspondiente al cón=go codifica para una proteína sino para un piRNA de 29 nucleó=dos (Figura 1d). Resumen Genética Molecular FEMALE SILKWORMS HAVE THE SEX FACTOR 2 Irene Millán Crespo Diciembre 2014 Fem piRNA es necesario para que se formen las isoformas femeninas de Bmdsx Kiuchi et al. (2014) diseñaron un inhibidor del piRNA anterior basado en RNA de secuencia complementaria al piRNA de interés (Figura 2a). Con el fin de estudiar la función del piRNA en el splicing alterna=vo de Bmdsx se inyectó el inhibidor en embriones de dis=nto sexo y se estudiaron los transcritos formados mediante la realización de un northern blot (usando una sonda que hibrida con un exón de Bmdsx). Los resultados indican que el inhibidor el piRNA hace que se altere el splicing en hembras dando lugar a la formación de isoformas masculinas en vez de femeninos, mientras que el patrón de splicing en los machos no se ve afectado por el inhibidor (Figura 2b-­‐c). Esto sugiere que el piRNA es necesario para que lleve a cabo el splicing del pre-­‐mRNA gen Bmdsx que da lugar a los isoformas femeninas, mo=vo por el cual se denominó con el nombre de Feminizer al precursor de este piRNA. Siwi debe ser expresado para que se formen las isoformas femeninas de Bmdsx Adicionalmente, Kiuchi et al. (2014) quisieron estudiar la implicación de dos genes implicados en la biogénesis del gusano de seda en la determinación del sexo: Siwi y BmAgo3. Para ello, se analizaron los transcritos de Bmdsx producidos en embiones en los que la expresión de Siwi o BmAgo3 había sido inhibida mediante el uso de siRNAs. Los resultados indican que el splicing se ve alterado si se inhibe la expresión de Siwi en hembras (se forman isoformas masculinas de los transcritos del gen Bmdsx) mientras que en machos el splicing no se ve afectado. Asimismo, el patrón de splicing no se ve afectado en machos ni en hembras cuando se inhibe el gen BmAgo3. Los resultados sugieren que la expresión de Siwi es esencial para pasa que se lleve a cabo el splicing del pre-­‐mRNA del gen Bmdsx que da lugar a los isoformas femeninas. Resumen Genética Molecular FEMALE SILKWORMS HAVE THE SEX FACTOR 3 Irene Millán Crespo Diciembre 2014 Fem piRNA actúa cortando el exón 9 del mRNA del gen Masculinizer Kiuchi et al. (2014) iden=ficaron una secuencia del genoma que =ene una alta complementariedad con Fem piRNA. Esta secuencia pertenece al exón 9 de un gen perteneciente al cromosoma Z que no se había caracterizado al que se llamó Masculinizer (Figura 3a). Previamente se ha sugerido que los complejos PIWI-­‐piRNA actúan cortando secuencias diana complementarias entre las posiciones 10 y 11 del piRNA7,8. Kiuchi et al. (2014) sugieren que el mRNA producido por Masc es la diana de Fem piRNA (el si=o de corte se muestra en la figura 3a). Fem piRNA inhibe la expresión de Masc en hembras mediante el corte de Masc mRNA Al analizar la expresión de Masc en embriones de dis=nto sexo, Kiuchi et al. (2014) observaron que en las hembras la expresión de Masc disminuye gradualmente a medida que crece el embrión mientras que en los machos se produce un pico de expresión tras 18 horas desde la ovoposición (Figura 4a). Estos resultados indican que el corte del mRNA de Masc producido por Fem piRNA resulta en una disminución gradual del mRNA de Masc en hembras. Masc es responsable de la masculinización y de la compensación de dosis del cromosoma Z Asimismo, Kiuchi et al. (2014) observaron que al inhibir la expresión de Masculinizer mediante la inyección de Masc siRNA en embriones, se reduce la expresión del gen en machos a niveles propios de las hembras control (Figura 4b). En machos, la inhibición de Masc resulta en la producción de variantes femeninas de splicing de Bmdsx y en la posterior muerte de los embriones (Figura 4c y 4d). Sin embargo, los embriones hembra sobreviven pese a la inhibición de Masc. La muerte por inhibición de Masc en los machos es similar a la acción del patógeno Wolbachia, que mata a los embriones macho infectados9. Por tanto, la muerte podría deberse al igual que la enfermedad a un problema asociado a la compensación de la dosis génica del cromosoma Z. Masc actúa reprimiendo genes de los cromosomas Z en estado embrionario. Por lo tanto, Masc se encarga tanto de la masculinización como de la compensación de la dosis génica durante el desarrollo embrionario (Figura 4f). Resumen Genética Molecular FEMALE SILKWORMS HAVE THE SEX FACTOR 4 Irene Millán Crespo Diciembre 2014 CONCLUSIONES Y OPINIÓN • El cromosoma W presente en las hembras de la especie B. mori con=ene varias repe=ciones en tándem del cón=go comp73859_c0 que se transcribe dando lugar a Fem piRNA. • El gen Masculinizer se encuentra en el cromosoma Z y =ene dos funciones principales: o Se transcribe dando lugar a una proteína que interviene en el splicing del pre-­‐mRNA del gen Bmdsx, de manera que se procesa dando lugar a un mRNA que resulta en el desarrollo de un macho. o Inac=va genes del cromosoma Z, compensando así la dosis genéca durante el desarrollo embrionario. • En las hembras, Fem piRNA interacciona y corta Masc mRNA por el exón 9, manteniendo bajos los niveles de la proteína Masc durante el desarrollo embrionario. De esta forma, Fem piRNA asegura que el procesameinto del pre-­‐mRNA de Bmdsx se produzca de manera que se formen los mRNAs que dan lugar al desarrollo de una hembra. • El gen Siwi debe ser expresado para que se formen las isoformas femeninas de Bmdsx. • El gen BmAgo3 no es necesario para que se formen las isoformas femeninas de Bmdsx. Este estudio desvela cómo el cromosoma W determina el desarrollo de la hembra en B. mori. Se trata de la primera vez que se iden=fica un factor determinante del sexo en Lepidoptera así como la primera prueba del papel del los pi-­‐RNAs como mediadores de este proceso. Por ese mo=vo, en mi opinión la importancia de este estudio no solo reside el descubrimiento de la determinación sexual Resumen Genética Molecular FEMALE SILKWORMS HAVE THE SEX FACTOR 5 Irene Millán Crespo Diciembre 2014 de una especie. Tanto el gen Masc como los pi-­‐RNAs podrían jugar un papel muy importante en la especificación sexual de muchas otras especies de Lepidoptera, incluso en aquellas en las que las hembras son monosómicas (Z0) y los machos son ZZ. BIBLIOGRAFIA 1. Cho, S., Huang, Z. Y. & Zang, J. (2007) Sex-­‐specific splicing of the honeybee doublesex gene reveals 300 million years of evolu=on at the boiom of the insect sex-­‐determina=on pathway. GeneAcs, 177(3):1733-­‐1741 2. Suzuki, M. G. et al. (2005) Role of the male BmDSX protein in the sexual differen=a=on of Bombyx mori. EvoluAon and Development, 7(1):58-­‐68 3. Marec, F. (2014) Female silkworms have the sex factor. Nature 509:570-­‐571 4. Kawaoka, S. et al. (2011) The silkworm W chromosome is a source of female-­‐enriched piRNAs. RNA, 17(12):2144-­‐2151 5. Kiuchi, T. et al (2014) A single female-­‐specific piRNA is the primary determiner of sex in the silkworm. Nature, 509(1):633-­‐636. 6. The Interna=onal Silkworm Genome Consor=um. 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