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Rev Cubana Oncol 1999;15(3):186-92
Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología
INFLUENCIA DE CITOCINAS EN RESPUESTA CITOTÓXICA NATURAL
DE PACIENTES CON CÁNCER DE MAMA
Dra. María del Carmen Arango Prado, 1 Lic. Leticia Llánes Fernández,2 Dr. Luis Moreno de Miguel3 y Dra. María
Elena Fáxas García4
RES U MEN
Se estudió la respuesta citotóxica natural en un grupo de 10 pacientes con cáncer
de mama (5 pacientes de estadios IIa, 2 de estadios IIb y 3 de estadio IIIa). Para
esto, las células mononucleares periféricas fueron estimuladas con citocinas
(IFN γ e IL-2) a 37 °C en atmósfera 5 % CO2 durante 72 horas, donde se
evaluó la actividad citotóxica natural mediante marcaje isotópico con Cr 51. Se
utilizó paralelamente un grupo de 12 controles en las que se obtuvo un incremento significativo de la actividad citotóxica de células activadas con citosinas. Los
resultados en la mayoría de las pacientes de estadios IIa sugieren que el compromiso de la actividad citotóxica celular puede restablecerse con el IFN-γ y la
IL-2; sin embargo, en casi todas las pacientes de estadios avanzados se obtuvo
una pobre respuesta citotóxica, la cual no se restablece al ser estimuladas con
las citosinas empleadas; esto puede ser consecuencia de la existencia de factores supresores que comprometen la citotoxicidad y, por tanto, pueden afectar la
respuesta inmune antitumoral, sobre todo en estadios avanzados.
Descriptores DeCS: NEOPLASMAS DE LA MAMA; CITOCINAS;
LINFOCITOS T CITOTOXICOS; CITOTOXICIDAD INMUNOLOGICA;
CELULAS KILLER NATURALES.
Existen evidencias que fundamentan la
importancia de los mecanismos inmunes en
la respuesta antitumoral humana. Estos
mecanismos están representados fundamentalmente por los linfocitos T citotóxicos
(CTL) específicos, con fenotipo generalmente CD8+ y por una población linfoide que
1
2
3
4
Especialista de I Grado en Inmunología Clínica.
Licenciada en Bioquímica. Investigadora Agregada.
Especialista de II Grado en Oncología. Profesor Titular.
Especialista de II Grado en Inmunología Clínica. Investigadora Titular.
186
media su acción citotóxica de modo inespecífico denominada células asesinas naturales- Natural Killer- (NK). Estas células
representan el 5 % de los linfocitos, se distinguen morfológicamente por ser linfocitos
granulares grandes (LGL) y tienen la propiedad de destruir células infectadas por
virus, células alogénicas y células tumorales.1 Las NK son capaces de mediar su
acción, sin activación previa ni restricción
aparente del sistema mayor de
histocompatibilidad (MHC), de forma diferente a como lo hacen los linfocitos T y
B; por esta razón el nombre de asesina natural. 2
Los mecanismos efectores de tipo
citotóxicos empleados por esta células son
de 2 tipos fundamentales: el mecanismo
mediado por exocitosis de gránulos3 y el
mecanismo de apoptosis basado en interacciones Fas/Fas-Li.4 Su diferenciación
y función está controlada por una compleja
red de citocinas, algunas pueden potenciar
mecanismos citotóxicos, tal es el caso de
la interleucina (IL) 2, el interferón gamma
(IFN γ) y la IL-125. El cultivo de células
mononucleares periféricas (CMP) con estas linfocinas (IL-2 fundamentalmente) puede
generar una población de células con elevada capacidad citotóxica denominada células citotóxicas activadas con linfocinaslymphokine activated killer-(LAK).6
En pacientes con cáncer de mama se
ha descrito una inmunodeficiencia celular
progresiva caracterizada por las alteraciones en las subpoblaciones de linfocitos T y
en la expresión de marcadores de superficie, 7 el compromiso de la actividad
citotóxica de células NK y de las células
LAK,8 la depresión de la actividad lítica
de linfocitos citotóxicos ,9 la depresión de
hipersensibilidad tipo IV,10 la depresión de
la respuesta proliferativa de linfocitos T,11
y la disminución en la síntesis de IL-2.12
Estos defectos son más evidentes en estadios avanzados de la enfermedad y están
asociados a una variedad de efectos
inmunosupresores entre los que se encuentran : citocinas supresoras como IL-10,
IL-4, 13 el factor de crecimiento transformante ß (TGF ß) y el factor de crecimiento de endo-telio vascular (VEGF),14 así como
prosta-glandinas producidas por monocitos,
P15 E-like peptide y otros factores supresores del suero. 15
Por todo lo anteriormente discutido, se
estudió el comportamiento de la actividad
citotóxica natural en un grupo de pacientes
con cáncer de mama de estadios (IIa, IIb y
III); así como la influencia de citocinas
(IL-2 e IFN-γ) en la potenciación de la actividad citotóxica natural de éstas.
MÉTODOS
Se seleccionaron 10 mujeres que ingresaron en el Servicio de Mastología del Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología
(INOR) para tratamiento quirúrgico, éstas
fueron clasificadas por estadios según criterios del pTNM. 16
Los criterios de inclusión fueron los
siguientes: pacientes entre los 30 y los 70 años,
con confirmación anatomopatológica de tumor, sin tratamiento oncoespecífico previo
y sin otra enfermedad crónica cardiorrespiratoria, séptica o endocrinometabólica de
importancia. En el grupo control se incluyeron 12 donantes voluntarias, aparentemente sanas, con edades entre los 30 y los 70 años,
sin patología benigna de la mama ni otra
enfermedad crónica o infecciones agudas
demostrables.
PROCEDIMIENTOS
Se realizó extracción de 20 mL de sangre de la vena cubital del lado contrario al
proceso tumoral en condiciones estériles y
utilizando heparina. Las CMP fueron obtenidas por centrifugación en gradiente de
densidad 1,077 g/mL (Histopaque 1077 Sigma-) según método de Böyum17 y ajustadas a 1 x 106 cel/mL. El volumen total de
la suspensión celular de cada caso indivi-
187
dual fue dividido en 3 partes y dispensado
en los pozos de placas de cultivo de 24 pozos, a razón de 1 mL/pozo. La primera parte de la suspensión dispensada en las placas
se completó con 1 mL/pozo de medio RPMI
con 10 % de suero fetal (células no estimuladas); a la segunda parte de la suspensión
se le añadió 1 mL/pozo del IFN- (CIGB,
Habana, Cuba) a una concentración previamente definida de 500 Uds/mL (máxima
actividad citotóxica), y a la tercera parte
se le adicionó 1 mL/pozo de IL-2
(CIB,CIGB, Habana, Cuba) a una concentración de 50 Uds/mL previamente definida. Esta placa se cultivó durante 72 horas,
a 37 C y atmósfera con 5 % de CO2 en
aire. Al cabo de este tiempo, las células
fueron recolectadas, lavadas, y analizadas su viabilidad, ajustándose finalmente a 4 x 10 6 cel/mL, para ser utilizadas en
el ensayo de citotoxicidad. Para definir las
concentraciones óptimas de citocinas, se cultivó, en las condiciones antes descritas, las
CMP de los controles, con diferentes dosis
de IFN-γ (125, 250, 500, 750 Uds/mL) y
con diferentes dosis de IL-2 (25, 50, 100,
150 Uds/mL).
El ensayo de citotoxicidad natural de
células mononucleares mediante marcaje
isotópico (actividad NK) se realizó según
técnica habitual,18 las células anteriores
(efectoras) fueron ajustadas a 4 x 106 células/mL de medio RPMI 1640 + 10 % suero
fetal. Se utilizó como célula blanco la línea eritroleucémica K562 a la que se le
anadió una solución de Cr 51 (cromato de
sodio, solución PB, Amersham, UK) a razón de 100 mci/2x106 células, finalmente
fueron ajustadas a una concentración de
104 células/pozo. Las células efectoras y
diana se enfrentaron 4 horas a 37 °C en 5 %
de CO2 en placas de 96 pozos en U; estableciéndose 4 relaciones efectoras-dianas 40:1;
20:1; 10:1 y 5:1 en un volumen final de
200 mL/pozo. Se colectaron los sobrena-
188
dantes y se midió la radiactividad en contador de radiaciones gamma durante 1 minuto.
Se estableció un índice de citotoxicidad
(IC) en % para cada relación CMP: diana,
según la fórmula:
IC = (LE - LO)/ (LT - LO) x 100
donde: LE: valor promedio de los
conteos correspondientes a las lisis experimentales, LO: valor promedio de los conteos
correspondientes a las silis espontáneas y
LT: valor promedio de los conteos correspondientes a las lisis totales obtenida por
destrucción celular con detergente tritón 5
%. Posteriormente se calcularon los valores de unidades líticas (UL) a partir de los
índices de citotoxicidad, éstas se definen
como la cantidad de células efectoras que
lisan un porcentaje de células dianas
predefinido por el investigador (30 %) por
cada 1 millón de células efectoras. Dada
su complejidad se realizó el cálculo mediante sistema automatizado creado al efecto, en el Laboratorio de Inmunología Clínica del INOR.
RESULTADOS
Se definieron previamente en el grupo
control, las dosis óptimas para potenciar mecanismos citotóxicos, siendo de 500 Ud/mL
de IFN-γ y 50 Ud/mL de IL-2. Los resultados en este grupo demostraron que las medias de las UL de células estimuladas con
IFN γ y con IL-2 respectivamente, fueron
significativamente superiores (p < 0,0000)
que las medias de las UL de células no estimuladas (figura 1). Se definieron con estos resultados de los controles 3 niveles de
corte, dado por: media (X) de las UL-2 x
desviación estándar (DE). Siendo para células no estimuladas con citocinas = 5,92,
para células + IFN-γ = 9,90 y para células + IL-2 = 8,84. Por debajo de estos niveles
se consideran valores de UL disminuidas.
U .L
ya que en la mayoría de estas pacientes no
aumentaron de modo importante la actividad citotóxica después de la estimulación
con linfocinas.
12
10
8
6
14
4
2
0
cé lu l as n o
es t i m u l a da s
cé lu l as + I F N
g am m a
cé lu l as + I L 2
Fig. 1. Citotoxidad natural no inducida e inducida por citosinas en el
grupo control.
Las 10 pacientes estudiadas fueron clasificadas por estadios pTNM en: 5 pacientes de estadio IIa, 2 de estadio IIb y 3 de
estadio IIIa. Se evidenciaron algunas diferencias entre las respuestas citotóxicas inducidas por linfocinas de las pacientes de
estadios IIa (estadios menos avanzados) y
las pacientes de estadios IIb y IIIa (estadios
más avanzados) (tabla). Como se muestra
en la figura 2 se observó un aumento de la
actividad citotóxica inducida por linfocinas
en la mayoría de las pacientes de estadio
IIa (4 de un total de 5 pacientes). Sin embargo, los resultados que se obtuvieron en
las 5 pacientes de estadios más avanzados
(IIb y III) no fueron alentadores, (figura 3)
U .L
12
10
8
6
4
2
0
IF N
IL 2
no
es t i m
1
2
cél u l as n o es t i m
3
4
cél u l as + IF N ga m m a
5 P aci en t es
cél u l as + IL 2
Fig. 2. Citotoxidad natural en pacientes con cáncer de mama (estadio IIa).
U .L
12
10
IF N
IL 2
no
es tim
8
6
4
2
0
6
7
célu las n o es t im
8
9
célu las + I F N g am m a
10 P acien tes
célu las + I L 2
Fig. 3. Citotoxidad natural en pacientes con cáncer de mama (estadios IIb y IIIa).
Tabla. Resultados de la citotoxicidad no inducida e inducida por citocinas en pacientes
Pacientes
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Estadio
IIa
IIa
IIa
IIa
IIa
IIb
IIb
IIIa
IIIa
IIIa
Cél No Estim
3,83
0,19
7,50
8,62
7,56
0,38
6,48
0,09
2,20
2,40
Resultados en UL
Cél Estim IFN
Cél Estim IL-2
9,32
1,13
10,92
12,02
8,72
1,42
11,20
0,07
3,77
1,70
12,40
0,69
9,57
11,45
8,90
1,67
10,60
0,08
2,52
2,80
189
DISCUSIÓN
Los resultados obtenidos en el grupo
control se corresponden con múltiples investigaciones y están bien fundamentados
en la literatura. Como es conocido la actividad citotóxica inespecífica de las células
NK y de otras CMP, puede ser potenciada
por citocinas como el IFN-γ, IL-2, IL-12.
El término de células LAK surge precisamente como resultado de la estimulación
in vitro con linfocinas, obteniéndose una
población de células con incremento en la
actividad citotóxica.8
En las pacientes de estadios menos
avanzados puede inferirse que se mantiene
la capacidad de sus células efectoras de
responder ante la estimulación con citocinas. Incluso pudo evidenciarse en una paciente con UL disminuidas, un aumento importante de la actividad citotóxica cuando
se estimularon sus células con citocinas.
Estos resultados preliminares pueden sugerir, el uso de citocinas y posible terapia
LAK como forma de inmunoterapia adoptiva, con la finalidad de una potenciación de
mecanismos citotóxicos antitumorales en las
pacientes de estadios menos avanzados.
Por otra parte en estadios más avanzados se evidenció una disminución de la
actividad citotóxica natural y el no restablecimiento de dicha función con el uso de
IFN γ e IL-2. Esto puede explicarse parcialmente por factores inmunosupresores, dentro de los que las citocinas juegan un papel
central. Entre ellas sobresalen la IL-4, IL-6,
IL-10, TGF ß y VEGF. El TGF ß es una de
las más potentes citocinas inmunosupresoras, entre sus principales efectos está la
inhibición de la producción de la IL-12, la
inhibición de la diferenciación de los CTL,
reduciendo la respuesta T frente a tumores
y virus. El VEGF, es una citocina producida por la mayoría de los tumores y se conoce que es un potente inhibidor de la dife-
190
renciación de progenitores CD34 a células
dendríticas, lo que inhibe la respuesta
antitumoral. 14 La IL-4 producida por
linfocitos TH2 inhibe la formación de IL1ß
y TNF en células monocitos/ macrófagos,
por lo que se opone a los efectos del IFN γ,
y secundariamente a las acciones de la
IL-2 e IL-12 inhibiendo la respuesta
citotóxica celular.1 La IL-10 es producida
principalmente por monocitos/macrófagos,
linfocitos TH2 y también por las células
tumorales; ésta puede inhibir la síntesis de
citocinas de las células TH1 (entre las que
sobresalen el IFN -γ y la IL-2), por tanto
afecta la activación y diferenciación de las
poblaciones de linfocitos T y de células
NK.19 La inhibición del IFN -γ, causada
por la IL-10, ocasiona una disminución de
las citocinas IL1 ß, TNF e IL-12. Estos 3
mediadores potencian la actividad citotóxica
de monocitos/macrófagos y de células NK.
También la IL-10 puede actuar directamente sobre IL1ß, TNF e IL-12, causando una
inhibición de su síntesis en los monocitos/
/macrófagos.20 Otra citocina que juega un
importante papel en la resistencia a la
inmunoterapia con citocinas es la IL-6, ésta
puede interferir con la IL-2 por mecanismos poco precisos, activando localmente la
cascada de producción de factores inmunosupresores como la IL-10, y la prostaglandina E2.14
Está demostrado que la depresión de
la respuesta inmune celular en cáncer puede ser consecuencia de factores como
prostaglandinas (PGE2), histaminas, epinefrina; los que al interactuar con sus receptores originan una activación de la
adenilato ciclasa y el aumento de AMPc en
células inmunocompetentes (monocitos/
/macrófagos; células NK y células TH). El
incremento en el AMPc causa efectos supresores de la respuesta inmune por diversos mecanismos, entre los que se encuentran la inducción de la síntesis de IL-10, y
la activación de proteínas kinasas A, la que
inhibe la formación de IL-2 en células T,
como consecuencia de lo cual disminuye
IFN-γ y se inhibe la inmunidad celular.20
La citotoxicidad de las NK disminuye con
el aumento del AMPc debido a 2 causas
fundamentales: la disminución de la habilidad de las NK para unirse a células blanco
y la inhibición en la síntesis de citocinas
inductoras de NK (IFN-γ, IL-2, IL-12). Los
inductores de AMPc pueden potencialmente inhibir actividad citotóxica, tal es el caso
de prostaglandinas E2 (PGE2), la histamina
y la epinefrina. Actualmente se conoce de
la existencia de algunos de estos factores
supresores en el cáncer de mama, por tan-
to, se sugiere que el compromiso de la actividad citotóxica de las pacientes analizadas puede ser consecuencia de la acción de
uno o varios de estos factores.15 También se
conoce que la liberación de productos intermediarios del oxígeno por células tumorales puede inducir apoptosis en células
NK, y esto en ocasiones es más evidente en
estadios avanzados de la enfermedad.10
Todos los factores analizados en mayor
o menor grado pueden ser responsables del
compromiso de la respuesta citotóxica. No
obstante, estudios futuros serán necesarios
para profundizar en el conocimiento de estos aspectos y como utilizarlos con fines inmunoterapéuticos.
SUMMARY
The natural cytotoxic response of a group of 10 patients with breast cancer (5 patients with stage IIa cancer, 2 with
stage IIb cancer and 3 stage IIIa cancer) was analyzed. For this purpose, the peripheral mononuclear cells were
stimulated using cytokines (IFNγ and IL-2) at 37 °C in a 5 % CO2 environment for 72 hours where the natural
cytotoxic activity was evaluated through Cr51 isotopic labelling. At the same time, 12 controls were used for
which a significant increased cytotoxic activity of cytokine-activated cells was obtained. The results of the
majority of patients with stage IIa cancer suggested that the cellular cytotoxic activity could be re-established by
using IFNγ and IL-2; however, almost all the patients suffering from advanced stage cancer showed a poor
cytotoxic response which was not re-established when cells were stimulated by the aforementioned cytokines. This
may be caused by existing suppressor factors that compromise cytotoxicity and therefore, can affect the antitumor inmune response mainly in advanced stage cancers.
Subject headings: BREAST NEOPLASMS; CYTOKINES; T-LYMPHOCYTES, CYTOTOXIC; CYTOTOXICITY, IMMUNOLOGIC; KILLER CELLS, NATURAL.
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Recibido: 11 de marzo de 1999. Aprobado: 26 de mayo de 1999.
Dra. María del Carmen Arango Prado. Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología. Calle 29 esquina a E,
El Vedado, Ciudad de La Habana, Cuba.
192