5to Congreso internacional de Cardiología por Internet

SEPARACIÓN DE POBLACIONES CELULARES POR
CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE
OBJETIVOS:
• Separar y aislar células mononucleares de sangre total y determinar su viabilidad .
FUNDAMENTO TEORICO:
CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE DENSIDAD
La centrifugación de equilibrio en gradiente separa las partículas con base en sus densidades
diferentes, la muestra puede ser cargada directamente sobre un gradiente de densidad
preformado y la centrifugación llevada a cabo. Mientras en la centrifugación zonal la densidad
del gradiente no debe exceder a la de las partículas a separar, en la centrifugación de equilibrio
en gradiente la condición fundamental es que la densidad máxima del gradiente final debe
siempre exceder a la densidad de las partículas. La centrifugación de equilibrio en gradiente
permite que las especies sedimentantes se muevan por el gradiente hasta que alcanzan un punto
donde su densidad y la del gradiente son idénticas, por lo cual también se le llama
centrifugación isopícnica. En este punto no se producirá una sedimentación posterior debido a
que flotan sobre un "colchón" de material que posee una densidad superior que la suya propia.
Esta técnica se emplea para separar partículas similares en tamaño pero distintas en
densidad. Puesto que la mayoría de las proteínas poseen casi la misma densidad, este método no
se suele utilizar para su separación. Sin embargo, en situaciones donde intervienen diferentes
densidades, la centrifugación isopícnica es el método adecuado. Esto es cierto para moléculas,
tales como ácidos nucleicos, así como diferentes organelos celulares.
Se emplean diferentes sustancias para conseguir los gradientes de densidad, como son sacarosa,
percol, cloruro de cesio, etc. Los gradientes pueden ser autogenerados como es el caso de los
basados en cloruro de cesio en que se forman en el propio proceso de centrifugación, o
preformados como es el caso de la sacarosa o del percol. En este último caso la preparación se
realiza antes de la centrifugación mediante un formador de gradientes, dispositivo que consiste
en dos cubetas conectadas por la base y con agitación en las que se colocan las soluciones con
los dos extremos de concentración. A medida que se va sacando de una de ellas la otra
reemplaza el líquido extraído y modifica linealmente la concentración.
Una alternativa es la centrifugación en gradiente discontinuo, en la que se crea un gradiente por
etapas en el interior de un tubo al apilar sucesivamente volúmenes homogéneos de soluciones
de diferente densidad. En las interfases de las diferentes capas se acumularán las partículas que
flotan (son menos densas) en la capa inferior pero que se hunden (son más densas) en la capa
superior.
Diseño especifico de un gradiente de densidad
Un buen resultado en el aislamiento de unas moléculas en particular mediante la
centrifugación en gradiente de densidad requiere una consideración cuidadosa de los parámetros
del gradiente de densidad. Estos parámetros incluyen
• El material que se emplea para establecer el gradiente. Es un solvente
distribuido con diferentes concentraciones en una columna en donde la
parte apical es la positiva por contener el solvente con mayor densidad.
• El fluido del gradiente de densidad consiste de un adecuado soluto de
bajo peso molecular en un solvente en el cual las partículas de las
muestras pueden ser suspendidas.
• La fuerza iónica
• La viscosidad
• Las características osmóticas
• La pendiente del gradiente
• El pH
• La presencia de agentes estabilizantes tales como mercaptanos; EDTA,
substratos enzimáticos y Magnesio.
La solución de una muestra contiene partículas para ser separadas en capas o zonas en una
columna de gradiente de densidad elaborado. Las moléculas y organelos son separados de
acuerdo a su masa y forma. Dentro de los materiales que se utilizan están la sacarosa, la cual
permite formar disoluciones con una densidad de hasta 1.28 g/cm3, el glicerol que puede
emplearse a densidades inferiores a 1.15 g/cm3, el ficoll, la metrizamida con capacidad para
generar densidades de hasta 1.45 g/cm3, el cloruro de cesio con un rango de densidades hasta de
1.7 g/cm3, el sulfato de cesio, y el percoll entre otros.
Es importante tener presente que el material que se use sea inerte o al menos no tóxico para el
material biológico, las propiedades fisicoquímicas deben conocerse antes de usarse para
determinar la concentraciones precisas del gradiente además debe facilitar la separación de la
muestra del material sin pérdida de la muestra o su actividad.
Elaboración
• Preparar la solución stock del gradiente.
• Realizar las diferentes diluciones para establecer una escala de densidad y
concentración consecutiva del gradiente.
• Determinación de la concentración y volúmen de la muestra.
• Disposición del gradiente a partir del que tiene mayor a menor densidad de forma
sincrónica.
• Disposición de la muestra.
Consideraciones para elaborar un gradiente de densidad:
• Poseer un amplio rango de densidad.
• No afectar la actividad biológica de la muestra.
• No hipo o hiperosmótica.
• Fácil remoción a partir del producto purificado.
• No sea sensible al rango de luz UV y visible.
• Económico y accesible.
• Esterilizable.
• No corrosivo, tóxico e inflamable.
El gradiente más usado es el de sacarosa ya que es un medio resistente porque es poco viscoso y
polar. Básicamente, el índice de migración en un medio resistente depende del movimiento de la
partícula en el medio y la fuerza debido a la fuerza centrípeta o de gravedad.
Tipos de gradientes
Gradientes lineales
Son aquellos en los que la densidad aumenta linealmente con el incremento en la distancia
desde el centro de rotación, pueden ser continuos o discontinuos, estos últimos se usan para
incrementar la capacidad de un gradiente bien definido o para efectuar una separación mayor de
dos especies.
Aunque estos tipos pueden emplearse aportando grandes ventajas, deben usarse con cuidado y
discriminación. Los gradientes discontinuos se forman colocando con cuidado en capas las
disoluciones de densidades distintas en los tubos de centrifuga.
El método más ampliamente usado para producir gradientes discontinuos es comenzar con la
solución más densa y colocarlos en capas de menor densidad sucesivamente, existe la
posibilidad de carga por arriba usando una pipeta, una jeringa o una pipeta Pasteur, teniendo
siempre precaución en la forma como se coloca y evitando la formación de aire que cause
turbulencia sobre los gradientes formados. (figura 1)
Gradientes no lineales
No siempre es deseable usar un gradiente lineal, en algunos casos para la resolución
particular de algunas especies sedimentantes puede ser deseable un perfil convexo, cóncavo,
complejo o en forma de S (figura 5); los gradientes convexos son particularmente útiles para la
resolución de una muestra que contenga alta concentración de partículas de un amplio rango de
densidades o viceversa puede utilizarse uno cóncavo. Para generar este tipo de gradientes es
posible utilizar cámaras continuas (figura 6) o mezcladores de gradientes los cuales permiten la
formación de hasta seis gradientes de una sola vez.
Recolección de los gradientes
Una vez se han separado una serie de especies moleculares u organelos en un
gradiente de densidad, es importante recuperar los componentes separados. El modo de
recolección depende del tipo de tubo usado para el gradiente, la distribución de las
partículas en el gradiente y el objetivo del fraccionamiento.
SEPARACIÓN Y AISLAMIENTO DE CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGRE
PERIFÉRICA, CONTAJE EN CÁMARA DE NEUBAUER Y AJUSTE DE
CONCENTRACIONES.
Las respuestas inmunitarias adaptativas están mediadas por linfocitos, de tal manera que la
comprensión de la inmunobiología debe fundamentarse en el conocimiento de la conducta de
los linfocitos. Para ello es preciso aislar las células, así como identificar y separar las
subpoblaciones de linfocitos funcionalmente distintas.
El primer paso en los estudios sobre linfocitos consiste en su aislamiento a fin de estudiar su
comportamiento in vitro. Los linfocitos humanos pueden aislarse de la sangre periférica con
relativa facilidad mediante centrifugación en distintos gradientes de densidad sobre un cojín con
una mezcla de Ficoll, un polímero de carbohidrato y metrizamida, un compuesto denso que
contiene yodo. Este procedimiento rinde en la interfase dos halos con células diferentes: las
células polinucleares que flotan sobre el gradiente de Ficoll de 1.119 y las mononucleares
(monocitos y linfocitos) que lo hacen sobre el gradiente de Ficoll de 1.078.
MATERIALES
-Tubos de plástico de centrífuga de 15 ml.
-Pipetas Pasteur de distintos tamaños.
-Centrífuga
-Pipetas automáticas de distintos tamaños.
-Cámara de Neubauer.
-Cubreobjetos.
-Microscópio óptico.
-Ficoll-Histopaquededensidad 1.078.
-Ficoll-Histopaque de densidad 1.119.
-Tampón fosfato PBS.
PROCEDIMIENTO
En un tubo cónico de centrífuga, de 15 mililitros, se depositan los dos gradientes de FicollHistopaque de densidades diferentes, una que se coloca primero de densidad 1.119 y otra que se
coloca lentamente sobre la anterior, de densidad 1.078.
Sobre estos dos colchones de Ficoll-Histopaque de 3 ml de volumen cada uno, se añaden muy
suavemente otros 5 ml de sangre diluida 1:1 en PBS, que ha sido obtenida estérilmente por
venopunción en tubos que contienen heparina litio como anticoagulante. La sangre diluida se
deja resbalar por las paredes del tubo para que se deposite sobre el gradiente de Ficoll de
densidad 1.078.
Los tubos se centrifugan a 2.500 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras la
centrifugación se observan dos halos opacos en la interfase: el superior correspondiente a las
células mononucleares y el inferior a las polinucleares. Ambos halos se recogen por separado y
se lavan las células tres veces con PBS.
Los botones celulares resultantes se resuspenden en 1 ml o más de PBS cada uno, según el
tamaño del botón, se cogen 50 microlitros de cada muestra, con pipeta de precisión tipo
Hamilton, y se extiende en cámaras de Neubauer separadas para su contaje en microscópio.
La cámara de Neubauer consiste en una placa gruesa de cristal en forma de porta, cuya porción
central está dividida en tres bandas perpendiculares al eje longitudinal de la cámara. De ellas,
las dos laterales se hallan sobreelevadas 0´1 mm con respecto a la central, y en esta última hay
grabado un retículo cuadrangular. La banda central puede estar, a su vez, subdividida en dos
semibandas idénticas y separadas por un surco paralelo al eje longitudinal de la banda. En cada
una de estas dos semibandas hay grabado un retículo idéntico.
DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CULTIVOS CELULARES
Procedimiento
IMPORTANTE : Todo tipo de manipulación que se realice con células eucarióticas en
cultivo ha de realizarse en condiciones estériles. En el aire se encuentran en suspensión
gran cantidad de bacterias, hongos microscópicos, levaduras, y diversos tipos de
microorganismos. Si no se evita que estos microorganismos caigan sobre nuestro medio
de cultivo durante las manipulaciones, dada su alta tasa de proliferación, acaban
adueñándose del cultivo en detrimento de las células eucarióticas, las cuales acaban
muriendo.
Deben tomarse para ello una serie de precauciones de forma sistemática y rutinaria :
1) Trabajar siempre en una campana de flujo laminar, la cual filtra el aire que luego
expulsa, de forma que dentro de la campana hay siempre una presión positiva y el aire
sin filtrar no puede entrar.
2) Utilizar todo el material previamente esterilizado (pipetas, puntas de
micropipeta, medios de cultivo, etc.)
3) Manipular con sumo cuidado dentro de la campana de flujo laminar. Es conveniente
lavarse las manos con jabón y después con una solución de alcohol al 70% antes de
manipular en la campana. Los "gestos" a la hora de manipular son también muy
importantes. Las partes del material que vayan a entrar en contacto directo con las
células o con el medio de cultivo no se pueden tocar con las manos o no pueden tocar
accidentalmente la superficie de la campana. Si eso ocurre, hay que cambiar de
material.
Procedimiento para células en suspensión:
- En un tubo pequeño de plástico poner 100 µl de la disolución de azul Trypan.
- Resuspender el cultivo de células con una pipeta. Realizar esta operación
cuidadosamente para que no se forme espuma.
- Tomar 100 µl de la suspensión celular con una micropipeta y mezclarlos con el
colorante.
- Colocar sobre el hemocitómetro un cubre e introducir entre ambos una pequeña
cantidad de la suspensión coloreada de células con una micropipeta.
- Contar las células que aparezcan sin color dentro de los cuadros en los cuatro
cuadrantes del hemocitómetro.
- El colorante azul Trypan sólo penetra en las células cuya membrana está
dañada, por lo que las células no teñidas son las células viables. Realizar dos
contajes: uno de las células teñidas (no viables) y otro de las no teñidas
(viables).
La concentración de células viables en el cultivo original se calcula del
siguiente modo:
n.º células viables x dilución x 104 / n.º cuadrantes = células / ml
El porcentaje de viabilidad se calcula dividiendo el número de células viables
(no teñidas de azul) por el número total de células (teñidas + no teñidas) y
multiplicando el resultado por 100.