PRÁCTICA 1 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES MADRE

PRÁCTICA 1
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES MADRE, REGULADORES DE CRECIMIENTO Y
MEDIOS DE CULTIVO
Objetivos
Conocer las instalaciones y el equipo del Laboratorio de Biotecnología de Plantas, así como su correcto
funcionamiento.
Aprender sobre la preparación de soluciones madre, reguladores de crecimiento y medios de cultivo.
Procedimiento
Preparación de soluciones madre
Macroelementos (según el medio de cultivo Murashige y Skoog 1962)
1. Para preparar una solución 10X (que será 10 veces más concentrada) multiplique por 10 la cantidad
indicada para cada uno de los macroelementos (Ver Cuadro 1).
NH4NO3 : 1650 mg*10: 16500 mg
2. Pese cada uno de los macroelementos por separado.
3. En un balón aforado de 1000 ml, agregue 500 ml de agua destilada y adicione uno a uno las cantidades
pesadas de los macroelementos. NOTA: Espere a que se disuelva cada macroelemento antes de adicionar
el siguiente.
4. Agite y afore a 1000 ml con agua destilada.
5. Transfiera la solución de macroelementos a una botella para su almacenamiento.
6. Rotule la botella con el nombre de la solución (Macroelementos 10X), fecha y nombre de la persona que
lo preparó.
7. Para recordar la cantidad de solución madre de macroelementos que se debe de adicionar por litro de
medio de cultivo: 1000 ml/10X: 100 ml de la solución madre por litro de medio de cultivo.
Microelementos (según el medio de cultivo Murashige y Skoog 1962)
1. Para preparar una solución 200X (que será 200 veces más concentrada) multiplique por 200 la cantidad
indicada para cada uno de los microelementos (Ver Cuadro 1).
H3BO3: 6.2 mg*200: 1240 mg
2. Pese cada uno de los microelementos por separado.
3. En un balón aforado de 1000 ml, agregue 500 ml de agua destilada y adicione uno a uno las cantidades
pesadas de los microelementos. NOTA: Espere a que se disuelva cada microelemento antes de adicionar
el siguiente.
4. Agite y afore a 1000 ml con agua destilada.
5. Transfiera la solución de microelementos a una botella para su almacenamiento.
6. Rotule la botella con el nombre de la solución (Microelementos 200X), fecha y nombre de la persona que
lo preparó.
7. Para recordar la cantidad de solución madre de microelementos que se debe de adicionar por litro de
medio de cultivo: 1000 ml/200X: 5 ml de la solución madre por litro de medio de cultivo.
Vitaminas (según el medio de cultivo Murashige y Skoog 1962)
1. Cada vitamina se prepara por separado.
2. Pese 50 mg de ácido nicotínico, piridoxina y tiamina por separado.
3. En un balón aforado de 100 ml, agregue 50 ml de agua destilada y adicione la cantidad pesada de la
vitamina.
8. Transfiera la solución de cada vitamina a una botella para su almacenamiento.
4. Rotule la botella con el nombre de la solución, concentración, fecha y nombre de la persona que lo
preparó.
5. NOTA: El mio-inositol se pesa y se agrega a la hora de preparar el medio de cultivo.
Hierro
1. Tome un beaker de 1000 ml y agregue 700 ml de agua destilada. Introduzca una pastilla magnética y
coloque el recipiente sobre un calentador.
2. Cuando el agua está hirviendo agregue la cantidad pesada de hierro (Ver Cuadro 1).
3. Coloque el beaker en un lugar oscuro y cuando este frío transfiera la solución a un balón aforado y
agregue agua hasta la marca de aforo.
4. Transfiera la solución de hierro a una botella ambar para su almacenamiento.
5. Rotule la botella con la nombre de la solución, concentración, fecha y nombre de la persona que lo
preparó.
Reguladores de crecimiento
1. Cada reguladores de crecimiento se prepara por separado.
2. Pese 50 mg de cada uno de los reguladores de crecimiento por separado (Ver Cuadro 3).
3. En un balón aforado de 50 ml, agregue 25 ml de agua destilada y adicione la cantidad pesada de los
reguladores de crecimiento.
4. Transfiera la solución de cada reguladores de crecimiento a una botella para su almacenamiento.
5. Rotule la botella con el nombre de la solución, concentración, fecha y nombre de la persona que lo
preparó.
Preparación de medios de cultivo
1. Tome un beaker de 1000 ml y agregue 250 ml de agua destilada. Introduzca una pastilla magnética y
coloque el recipiente sobre un agitador magnético.
2. Agregar 30 g de sacarosa y las alícuotas de las soluciones madre de macroelementos, microelementos,
vitaminas, hierro y reguladores de crecimiento (Ver Cuadro 2).
3. Agregue agua destilada al beaker sin llegar a la marca de los 1000 ml.
4. Mida el pH del medio de cultivo utilizando un pHmetro.
5. Afore el medio de cultivo a 1000 ml.
6. Pese y agregue el gelificante.
7. Antes de dispensar el medio de cultivo en frascos Gerber debe de calentarlo en el microondas por 6-7
minutos.
8. Esterilizar el medio de cultivo en una autoclave a 121 °C por 21 minutos.
9. Si el medio de cultivo contiene sustancias lábiles al calor (que se puedan degradar) después de autoclavado
en la cámara de flujo laminar permita que el medio se enfrie. Una vez frío agregue la sustancia
previamente esterilizada mediante filtración (Milipore 0.22 µM).
Unidades para la preparación de medios de cultivo
Concentración molar
Conversión de mili molar a mgl-1
1 M: el peso molecular en gl-1
1 mM: el peso molecular en mgl-1 ó 10-3 M
1 µM: el peso molecular en µgl-1 ó 10-6 M ó o 10-3
mM
2,4-D: peso molecular 221.0
1 M 2,4-D: 221.0 gl-1
1 mM 2,4-D: 221.0 mgl-1 = 0.221 gl-1
1 µM 2,4-D: 221.0 µgl-1 = 0.221 mgl-1
Conversión de mgl-1 a mili molar
No. mg CaCl2 2H2O/peso molecular CaCl2 2H2O
= 440 mg/147.019 = 2. 99 mM
Conversión de micro molar a mgl-1
(µM * peso molecular)/106=mgl-1
Cuadro 1. Preparación de las soluciones madre para el medio de cultivo Murashige y Skoog (1962) (MS).
Componente
Macroelementos
(10X)
NH4NO3
KNO3
CaCl2 2H2O
MgSO4 7 H2O
KH2PO4
Microelementos
(200X)
H3BO3
MnSO4. 4H2O
ZnSO4. 7H2O
KI
Na2MoO4. 2 H2O
CoCl2. 6H2O
CuSO4.5H2O
Hierro (100X)
EDTANaFeO4
Vitaminas (200X)
Ácido nicotínico
Piridoxina
Tiamina
Myo-inositol
Otros
Glicina
Sacarosa
Agar
Concentración en el medio
MS (mgl-1)
Concentración en la solución
madre (mgl-1)
Pesar (g)
para 1 litro
1650
1900
440
370
170
16500
19000
4400
3700
1700
16.5
19.0
4.4
3.7
1.7
6.2
22.3
8.6
0.83
0.25
0.025
0.025
1240
4460
1720
166
50
5
5
1.24
4.46
1.72
0.166
0.05
0.005
0.005
43
4300
4.3
0.5
0.5
0.5
100
100
100
100
20000
0.1
0.1
0.1
20
2
30000
8000
400
Añadir fresco
Añadir fresco
*
30
8
* Pesar 50 mg y disolver en 100 ml de agua destilada.
Cuadro 2. Cantidad de los componentes del medio de cultivo Murashige y Skoog (1962) necesarias para
preparar 1 L de medio de cultivo.
Componente Concentración Cantidad a utilizar para 1 L de medio de cultivo
Macroelementos
10X
100 ml
Microelementos
100X
10 ml
Fe-EDTA
100X
10 ml
-1
Tiamina
0.5 mgml
0.2 ml
Ácido nicotínico
0.5 mgml-1
1 ml
-1
Piridoxina
0.5 mgml
1 ml
-1
Glicina
0.5 mgml
4 ml
Inositol
100 mg
Sacarosa
30 g
Agar
8g
pH
-
5.6
Cuadro 3. Características de los principales reguladores de crecimiento utilizados en cultivo de tejidos.
Regulador de crecimiento
Ácido 2,4-diclorofenoxiacético
Ácido 3-indolacético
Ácido 3-indolbutírico
Ácido naftalenacético
Adenina
Sulfato de adenina
6- Bencilaminopurina
2-isopenteniladenina
Kinetina
Zeatina
Ácido giberélico
Ácido abscísico
Abreviación
2,4-D
AIA
AIB
ANA
A
AS
BAP
2-Ip
Kin
Z
AG
ABA
Peso molecular
221.0
175.2
203.2
186.2
189.1
404.4
225.2
203.3
215.2
219.2
346.4
264.3
Solubilidad
Etanol 95%
1 N NaOH – Etanol 95%
1 N NaOH – Etanol 95%
1 N NaOH – Etanol 95%
H2O
H2O
1 N NaOH
1 N NaOH
1 N NaOH
1 N NaOH - 1 N HCl
Etanol
1 N NaOH
Si necesita cambiar un compuesto con un número de hidratación por otro, como por ejemplo MnSO4. 4H2O
(PM1: 223.09) por MnSO4. H2O (PM2: 169.01)
M2: (M1*PM2)/PM1
En donde:
M1: es la masa requerida del compuesto químico original
M2: es la masa requerida del compuesto químico sustituto
PM1: es el peso molecular del compuesto químico original
PM2: es el peso molecular del compuesto químico sustituto
HOJA CONTROL PREPARACIÓN MEDIOS DE CULTIVO
Preparado por: ____________________________ Fecha: _______________
Cultivo: __________________________________ Etapa: _______________
Concentración
Cantidad a utilizar
por 1L
Macroelementos MS
10X
100 ml
Microelementos MS
100X
10 ml
Tiamina
0.5 mgml-1
0.2 ml
Ácido nicotínico
0.5 mgml-1
1 ml
Piridoxina
0.5 mgml-1
1 ml
100X
10 ml
Na-Fe EDTA
Sacarosa
30 g
Reguladores de crecimiento
Otros
Glicina
Gelificante
pH
0.5 mgml-1
4 ml
( ____ ) L