EVALUACIÓN DE VIABILIDAD EN CÓRNEAS PORCINAS CONSERVADAS EN UN MEDIO BIOCOMPATIBLE. RESULTADOS PRELIMINARES. Reutemann, Sofía1,a; Lavaroni, Onelia 2,a Vera, Estela; 3,a; Zukas, Pedro4,b. 1 Pasante alumno. 2Profesora asociada. 3Auxiliar.4 Bioquímico. a Universidad Nacional del Litoral (UNL). Facultad de Ciencias Veterinarias (FCV). Departamento de Clínicas. Cátedra de Inmunología II. b Organización no gubernamental DONAR shreutemann@yahoo.com.ar Proyecto: Evaluación de la viabilidad de córneas porcinas conservadas en un medio biocompatible desarrollado para su empleo en queratoplastía humana (CAID 2006) INTRODUCCIÓN El transplante corneal o queratoplastía es una técnica quirúrgica mediante la cuál el tejido corneal anormal de un individuo (receptor) es sustituido por el tejido corneal normal de otro individuo (donante). Los medios de conservación corneal preservan las células endoteliales desde la ablación corneal hasta el trasplante. El número de células endoteliales que conservan su viabilidad en la córnea destinada a trasplante no debe ser menor a un 50%, éste porcentaje está influido directamente por el tipo de medio de conservación utilizado1. Actualmente en nuestro país se utilizan medios importados (Optisol® TM-GS, Bauch & Lomb, Cat. Nº 50006-OPT, Likorol® D-X) sujetos a trámites de importación extensos, determinando que no se disponga en forma inmediata de los mismos lo que implica un inadecuado funcionamiento de los bancos de ojos y la pérdida de innumerables córneas potencialmente trasplantables y a un costo superior. OBJETIVOS General - Elaboración de un medio para la conservación de córneas a mediano plazo (3-7 días) y evaluación de la eficacia del mismo en córneas porcinas para su posterior aplicación en córneas humanas. Específicos - Formulación y desarrollo de un medio que permita una óptima conservación corneal desde la ablación hasta la queratoplastía sin alterar las características morfológicas y fisiológicas de sus células. - Evaluación de la eficacia de conservación “In Vitro” del medio desarrollado por medio de la determinación del porcentaje de viabilidad y recuento de células endoteliales en ensayos con córneas porcinas conservadas durante 72, 96 y 105 horas. MATERIALES Y MÉTODOS Se procedió a la formulación de dos medios de conservación corneal (MCR1 Y MCR2) compuestos por: solución de aminoácidos, dextrosa, condroitín sulfato, regulador de pH, y gentamicina. Los medios presentan diferencias de porcentajes en la composición básica de dextrosa y condroitín sulfato. Fueron preparados y fraccionados en alícuotas de 5 ml en recipientes de vidrio con tapa a rosca estériles, de ese modo se conservaron a 4 ºC hasta su utilización. La metodología de trabajo consistió en: 1) enucleación post mortem inmediata de globos oculares de cerdos de frigoríficos. 2) ablación de córneas a las 2 hs post enucleación y colocación del botón corneoescleral en medios de conservación MCR1 y MCR2. 3) almacenamiento a 4 ºC durante 72, 96 y 105 hs. 4) estabilización a temperatura ambiente (24ºC) de las córneas conservadas. 5) evaluación de las características del endotelio corneal mediante tinción con azul tripán al 1% en solución salina al 5% (proporción 1:4) y 6) valoración de la integridad del tejido post tratamiento con alcohol 96º. Se observaron por M.O a 4x, 10x y 40x. En todos los casos se tomaron como parámetros de muerte celular: retracción celular, aumento del espacio intercelular y cambios de forma con aumento del redondeamiento. RESULTADOS Fueron evaluados 94 botones corneoesclerales porcinos conservados en MCR1 y MCR2 a las 72 – 96 y 105 hs, obteniéndose los siguientes resultados: Córneas ablacionadas 6 hs post mortem: monocapa de células cuboides con núcleos grandes formando un mosaico hexagonal. Citoplasma uniforme en forma y tamaño. Recuento y viabilidad endotelial alta. Pleomorfismo endotelial no abundante. Ausencia de edema, vasos y leucomas. Ausencia de signos de colonización bacteriana. Ausencia de pliegues en Descemet (Figuras 1 y 2). Córneas ablacionadas y conservadas por 72 hs: las células endoteliales presentaron (observación a 40x en M.O) núcleos alargados, límites celulares definidos, indicio de una membrana plasmática intacta, denotando de esta manera buena viabilidad endotelial (Figura 3 y 4). Córneas ablacionadas y conservadas por 96 hs: indicios de deterioro endotelial. Las células endoteliales presentaron (observación a 200x en M.O) núcleos picnóticos, vacuolización citoplasmática, mala definición de los bordes celulares y aumento de los espacios intercelulares (Figura 5 y 6). Córneas ablacionadas y conservadas por 105 hs: indicios de deterioro endotelial mas marcados. Las células endoteliales presentaron (observación a 200x en M.O): Núcleos picnóticos, Vacuolización citoplasmática, Mala definición de los bordes celulares y Aumento de los espacios intercelulares (Figura 7 y 8). Tiempo de conservación 72 hs 96 hs 105 hs Nº de muestras 48 34 12 % de viabilidad promedio MCR1 MCR2 62,70 (±11,97) 66,04 (±10,93) 70,0 (±13,41) 70,9 (±12,21) 73,33 (±17,51) 75,0 (±7,74) CONCLUSIONES Las córneas conservadas en MCR1 y MCR2 durante 72, 96 y 105 hs no presentaron alteraciones significativas en sus características morfológicas y la viabilidad endotelial presento valores ≥ 62 %. La formulación de los medios MCR1 y MCR2 no mostraron diferencias significativas, dando un buen porcentaje de viabilidad, dado que el 60-80% de células endoteliales viables es capaz de restituir de manera completa la monocapa de células endoteliales post cirugía. Los resultados obtenidos aportan bases para el desarrollo de pruebas “in vivo” en porcinos con el objetivo final de posteriores ensayos en córneas humanas. AGRDECIMIENTOS Al Frigorífico Rafaela Alimentos S.A por permitirnos realizar los muestreo en sus instalaciones. Al Dr. Eduardo Picco y Méd. Vet. Antonio Baravalle por su colaboración. Finalmente al equipo de trabajo del Laboratorio de Biología celular y Molecular de la FCV (UNL) por su desinteresada colaboración y apoyo en distintas etapas de este trabajo.