BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA INSTITUTO DE FISIOLOGÍA PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UN ANTICUERPO POLICLONAL DIRIGIDO CONTRA UNA PORCIÓN PEPTIDICA DEL AMINO TERMINAL DE LA ENZIMA CONVERTIDORA DE PROHORMONAS: PC1 TESIS PROFESIONAL QUE PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRO EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS PRESENTA: Lic. Nut. Gabriel Moreno Elizondo ASESOR: Dr. Osvaldo Vindrola Asti Puebla, Pue. Enero, 2006 ÍNDICE i. ii. iii. iv. AGRADECIMIENTOS……………………………………………………3 ÍNDICE……………………………………………………………………..5 ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS……………………………………….6 ABREVIATURAS………………………………………………………….7 I. RESUMEN…………………………………………………………………………..8 II. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………10 III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA…………………………………………26 IV. HIPÓTESIS………………………………………………………………………26 V. OBJETIVOS 5.1 Objetivo general……………………………………………………………27 5.2 Objetivos particulares………………………………………………………27 VI. MATERIAL Y MÉTODOS 6.1 Obtención del péptido……………………………………………………..28 6.2 Preparación del conjugado…………………………………………………29 6.3 Especies animales…………………………………………………………..31 6.4 Líneas Celulares……………………………………………………………32 6.5 Preparación de extractos celulares…………………………………………34 6.6 Determinación de la concentración de proteínas………………………….35 6.7 Electroforesis en gel de poliacrilamida…………………………………….35 6.8 Electrotransferencia………………………………………………………..37 6.9 Cromatografía liquida de alta presión (HPLC)…………………………….38 VII. RESULTADOS…………………………………………………………………….40 VIII. DISCUSIÓN DE RESULTADOS………………………………………………..56 VIII. CONCLUSIONES……………………………………………………………..61 IX. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………..62 Introducción Antecedente: A mediados de los años sesentas, dos grandes grupos de endocrinólogos: uno en Estados Unidos encabezado por el Dr. Steiner, buscaba la enzima que sintetizaba insulina a partir de pro-insulina; y el otro grupo en Canadá, dirigido por el Dr. Michel Chrétien, buscaba la enzima que sintetizaba la hormona adrenocorticotrófica (ACTH) proveniente también de un precursor de mayor peso molecular. La pro-insulina, había sido descubierta en los años sesenta (Steiner y col., 1967) pero pasaron casi 30 años de trabajo y no se pudo encontrar con los métodos bioquímicos clásicos la o las endoproteasas involucradas en la síntesis de insulina. Estas enzimas deberían estar en la vía de transporte intracelular mediada por vesículas y que involucra desde el retículo endoplasmatico, pasando por el aparato de golgi y culminando en los gránulos secretorios; como mas adelante se describe para las diferentes vías de secreción (Sossin y Fisher, 1989). El motivo fundamental fue que no se podían obtener preparados de tejidos pancreáticos que no tuvieran contaminación con lisosomas. Lo mismo ocurría con la muestra de hipófisis (Mains y col., 1990; Taylor y col., 2003).