INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS

INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS ALTERANTES MEDIANTE
LA PRODUCCIÓN DE ZIMOCINAS
Briones, A. *; Ortiz Navarro, M.J.; Arevalo Villena, M.
Tecnología de los Alimentos. Facultad de Ciencias y Tecnología Química.
Universidad de Castilla La Mancha. Avda. Camilo José Cela, 10, 13071, Ciudad Real.
Teléfono: 926295300 ext 96332*ana.briones@uclm.es
Palabras clave:
Control biológico, producción de toxinas, levaduras.
RESUMEN
Las levaduras están ampliamente distribuidas en la naturaleza y se pueden encontrar
formando parte de la biota normal de un alimento o como agentes contaminantes; además,
son un grupo de microorganismos de gran interés industrial. Es conocido que algunas cepas
sintetizan toxinas que inhiben el crecimiento y/o ralentizan el metabolismo de ciertos
microorganismos. Esta propiedad puede ser usada para el control biológico y constituiría
una herramienta alternativa al uso de fungicidas minimizando por otra parte los tratamientos
de conservación.
En este trabajo se busca la utilidad de esta característica con un enfoque beneficioso para la
industria de alimentos. Por ello se evalúa la producción de zimocinas en levaduras no
Saccharomyces aisladas de ecosistemas naturales, que sean capaces de inhibir el desarrollo
de aquellas otras que se asocian a alteraciones en alimentos y bebidas; estas últimas
provienen de la Colección Española de Cultivos Tipo.
El efecto de esta proteína se estudió sobre 7 cepas de levaduras Saccharomyces y 75 no
Saccharomyces, así como sobre 7 bacterias de los géneros Oenococus y Lactobacillus.
Kluyveromyces thermotolerans fue la más eficaz para controlar el crecimiento de cepas
alterantes. Otras, como Hanseniaspora osmophila y de Debaryomyces hansenii, aunque en
menor medida, también fueron capaces de inhibir el desarrollo de algunas cepas.
Con respecto a la inhibición de bacterias alterantes, únicamente Debaryomyces hansenii
resultó ser killer frente a Lactobacillus casei.
INTRODUCCIÓN
Muchos procesos biológicos y biotecnológicos están dominados por agrupaciones complejas
de microorganismos, como levaduras y bacterias, aunque su dinámica poblacional depende
de factores ambientales y biológicos; los primeros incluyen a la composición del medio y a
los parámetros físicos que influyen sobre el medio, los segundos describen las interacciones
entre los grupos microbianos de ese ecosistema.
Es conocido que en cualquier fermentación se establece una competencia entre los individuos
presentes, que conlleva a una dominancia de ciertas especies o cepas microbianas sobre
otras. La capacidad de ciertas cepas de competir con otras esta basado en su mejor
adaptación a las condiciones de proceso, así como de
de su habilidad de secretar
compuestos antimicrobianos.
Es conocido que algunas cepas sintetizan toxinas que inhiben el crecimiento y/o ralentizan el
metabolismo de ciertos microorganismos. Esta propiedad puede ser usada para el control
biológico y constituiría una herramienta alternativa al uso de fungicidas minimizando por
otra parte los tratamientos de conservación. En Saccharomyces cerevisiae los genes que
codifican la toxina se localizan en plásmidos o cromosomas y están asociados a partículas
víricas intracelulares VLP formadas por dos cadenas de ARN de doble hélice, L y M; esta
última codifica la toxina y un factor inmune de auto resistencia a la toxina
El espectro de sensibilidad varía de unas cepas a otras; así las toxinas secretadas por cepas
de Saccharomyces cerevisiae son activas frente a otras cepas de la misma especie o incluso
a otros géneros como Torulopsis (Young y Yagiu , 1978 ) y Zygosaccharomyces (Palpacelli
et al ., 1991 ).
De entre las no Saccharomyces se ha detectado la producción de toxinas en especies
1
de Candida; Debaryomyces, Hanseniaspora, Kluyveromyces, Metschnikowia, Pichia,
Torulopsis, Ustilago, Williopsis y Schwanniomyces (Zagorc et al., 2001, Sangorrín et al ,
2005, Hernández et al., 2008, Santos et al , 2009; de Ingeniis et al , 2009 ) con un amplio
espectro de actividad. Algunas están codificadas por partículas víricas de doble cadena de
ARN, otras por genes localizados en plásmidos o en cromosomas.
En este trabajo se busca la utilidad de la producción de toxinas con un enfoque beneficioso
para la industria de alimentos. Por ello se evalúa la producción de zimocinas en levaduras no
Saccharomyces aisladas de ecosistemas naturales, que sean capaces de inhibir el desarrollo
de aquellas otras que se asocian a alteraciones en alimentos y bebidas; estas últimas
provienen de la Colección Española de Cultivos Tipo.
MATERIAL Y MÉTODOS
Levaduras y bacterias alterantes
Por una parte se disponía de 30 cepas pertenecientes a 10 especies de levaduras
procedentes de la Colección Española de Cultivos Tipo (Tabla 1), cuya sensibilidad a la
toxina se quería evaluar.
Tabla1. Levaduras procedentes de la CECT
LEVADURAS CONTAMINANTES CODIGOS
Yarrowia lipolytica
1357
1468
10448
Candida norvegica
10310 10615
11880
Kluyveromyces lactis
1931
10390
1122
Dekkera bruxellensis
1451
12005
5162
Pichia membranaefaciens
11982 111995 1115
Debaryomyces hansenii
11379 10019
Pichia anomala
1112
1113
1110
Zygosaccharomyces rouxii
11136 1229
1230
Zygosaccharomyces bailii
11043 1924
1898
Saccharomycodes ludwigii
10450 11141
1235
11369
Por otra parte se disponía de 7 cepas vínicas de Saccharomyces comerciales producidas por
distintas casa comerciales y de otras siete bacterias lácticas de géneros Oenococus y
Lactobacillus.
Estas levaduras se eligieron porque están descritas como alterantes de alimentos y bebidas
como producción de turbidez y off-flavours, formación de flóculos. Producción de acidez.
Formación de velos, aparición de sedimentos o película.
Levaduras potencialmente productoras de toxinas
Se ensayaron
75 aislados no- Saccharomyces aislados de ecosistemas naturales y
pertenecientes a la colección del laboratorio de Biotecnología de Levaduras de la UCLM,
cuyas especies se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2. Levaduras no- Saccharomyces ensayadas para el estudio de producción de toxinas
ESPECIE
NÚMERO DE AISLADOS
Torulaspora delbrueckii
10
Rhodotorula mucilaginosa glutinis
2
Debaryomyces hansenii
3
Candida apícola
6
Saccharomyces mellis
1
Zygosaccharomyces fermentati
1
2
Brettanomyces/Dekkera bruxellensis
1
Metschnikowia pulcherrima
15
Hanseniaspora osmophila
4
Kluyveromyces thermotolerans
14
Debaryomyces polymorphus
1
Candida apícola
1
Pichia membranaefaciens
4
Brettanomyces clausenii
2
Hanseniaspora uvarum(5)
5
Candida stellata(3)
3
Pichia kluyveri(2)
2
Detección de la producción de toxinas
La producción de toxina en las levaduras no- Saccharomyces se estudió frente a todas
aquellas consideradas contaminantes, así como frente a las cepas comerciales de
Saccharomyces y a las bacterias lácticas.
La evaluación de la actividad killer se detectó por inhibición de crecimiento en placas de Agar
YEPD-MB (glucosa 2%, extracto de levadura 1%, peptona 2%, agar 2%, azul de metileno
0.003% , pH 4.5).
El medio se inoculó con un césped de 106 células/ml de cada levadura contaminante, de las
cepas comerciales y de las bacterias y a continuación se estriaron las levaduras noSaccharomyces a evaluar. Las placas se incubaron a 28º C durante 72 horas.
Si alrededor de la estría aparecía un halo de inhibición del crecimiento, se consideraba que la
cepa producía un toxina que afectaba al crecimiento del césped.
Par corroborar resultados, las cepas a evaluar se sembraron en césped sobre el que se
estriaron las levaduras y bacterias contaminantes, las cuáles no crecerían en caso de que la
de que la levadura a evaluar secretará la toxina.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
De los 75 aislados evaluados solo el 21% sintetizaban una toxina capaz de inhibir el
crecimiento de las levaduras alterantes (Tabla 1). Las especies que poseían un amplio
espectro de acción fueron cepas Kluyveromyces thermotolerans, y en menor medida
Hanseniaspora osmophila y Debaryomyces hansenii (Figura 1), esta última fue la única que
inhibió el crecimiento de la cepa de Lactobacillus.
Kluyveromyces thermotolerans fue la mas eficaz para controlar el crecimiento de cepas
alterantes de Yarrowia lipolytica (43%), Zygosaccharomyces bailii (36%), Debaryomyces
hansenii (29%), Pichia membranaefaciens (7%) Otras, como Hanseniaspora osmophila y
Debaryomyces hansenii, aunque en menor medida también fueron capaces de inhibir el
desarrollo de algunas cepas de Z. bailii, D. hansenii y Y.lipolitica
En la Figura 1 se observa que la producción de toxina es cepa dependiente, ya que
Kluyveromyces thermotolerans inhibía el desarrollo de Yarrowia lipolytica y Debaryomyces
hansenii y de algunos aisaldos de Zygosaccharomyces bailii. En cambio Debaryomyces
hansenii, Hanseniaspora osmophila, Debaryomyces polymorphus, Hanseniaspora uvarum y
Candida stellata solo impidieron el desarrollo de algunos aislados de la misma especie
3
Figura 1: Comportamiento cepa- dependiente de las levaduras no-Saccharomyces
El crecimiento de las comerciales de Saccharomyces solo se vió afectato por la presencia de
Kluyveromyces thermotolerans, que inhibió al 57% de las cepas (S 325m, PDN, F15Z, y FAP)
como se observa en la Figura 2
Figura 2: Grado d inhibición de las cepas comerciales de Saccharomyces
Por lo tanto, el presente trabajo muestra que de las 16 especies de levaduras estudiadas,
Kluyveromyces thermotolerans fue la mas eficaz para el control de levaduras y bacterias
alterantes, mostrando un comportamiento cepa dependiente en la producción de toxinas.
BIBLIOGRAFÍA
De Ingeniis J., Raffaelli N., Ciani M. and Mannazzu I. (2009) Pichia anomala DBVPG3003
secretes a ubiquitin-like protein that has antimicrobial activity. Appl. Environ. Microbiol.
75: 1129- 1134.
Hernández A., Martin A., Córdoba M.G., Benito M.J., Aranda E. and Pérez-Nevado F. (2008)
Determination of killer activity in yeasts isolated from the elaboration of seasoned green
table olives. Int. J. Food Microbiol., 121: 178-188.
4
Palpacelli V, Ciani M & Rosini G (1991) Activity of different 'killer' yeasts on strains of yeast
species undesirable in the food industry. FEMS Microbiol Lett 68:75-78.
Sangorrín, M., Marongiu, A., Lopes, C., y Caballero, A. (2005). Levaduras contaminantes de
bodegas. Utilización de cepas killer como potenciales agentes de control. Actas del X
Congreso Latino-Americano de Viticultura y Enología, XI Congreso Brasilero de Viticultura
y Enologia, II Seminario Franco- Brasilero de Viticultura y Enología. Bento Goncalves,
Brasil.
Santos A., San Mauro M., Bravo E. and Marquina D. (2009) PMKT2, a new killer toxin from
Pichia membranifaciens and its promising biotechnological properties for control of the
spoilage yeast Brettanomyces bruxellensis. Microbiology+, 155: 624-634.
Young T.W. and Yagiu M. (1978) A comparison of the killer character in different yeasts and
its classification. Antonie van Leeuwenhoek, 44: 59-77.
Zagorc T., Maráz A., Cadez N., Povhe Jemec K., Péter G., Resnik M., Nemanic J. and Raspor
P. (2001) Indigenous wine killer yeasts and their application as a starter sulture in wine
fermentation. Food Microbiol., 18: 441-451.
5