1 RESUMEN - Tesis Electrónicas UACh

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UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
Facultad de Ciencias
Escuela de Química y Farmacia
Determinación de hipoglicemiantes orales en muestras de
orina por cromatografía en capa fina de alta resolución
(HPTLC)
Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al Título de
Químico Farmacéutico
Profesor Patrocinante : Sr. Eduardo Torres S. - Químico Farmacéutico - Jefe
Laboratorio de Toxicología , Departamento de Laboratorios, Servicio Médico
Legal , Ministerio de Justicia.
Karina Jeannette Soto Ampuero
Valdivia Chile 2003
Profesor Co-Patrocinante
Sra. Carin Akesson N. - Químico Farmacéutico - Instituto de Farmacia - Facultad de Ciencias.
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1. RESUMEN
Se implementó un método para la determinación cualitativa de los hipoglicemiantes orales
sulfonilureas y biguanidas: tolbutamida, clorpropamida, glibenclamida, glipizida y metformina en
orina, mediante la técnica de cromatografía en capa fina de alta resolución (HPTLC). La
extracción se efectuó con solventes orgánicos a pH 4 y 9. La longitud de onda utilizada para la
localización de los “spots” fue 254 nm y para la obtención de los espectros se utilizó una lámpara
de deuterio, en el rango de 200 – 400 nm.
La detección de los analitos se efectuó mediante la comparación con estándares de concentración
conocida. La extracción de las sulfonilureas se realizó a pH 4 con éter y la de metformina a pH 9,
con cloroformo: alcohol isopropílico (85:15). Se determinó además el límite de detección de cada
uno de estos fármacos.
Se realizó un experimento en sangre y vísceras a pH 9, extrayendo directamente con acetonitrilo
para la determinación de metformina en una persona intoxicada.
A futuro se debe implementar un método de determinación cuantitativa que incluya muestras de
orina y sangre, lo cual constituiría una valiosa herramienta para análisis químico – toxicológico,
de estos fármacos hipoglicemiantes orales.
SUMMARY
A method was implemented for the qualitative determination of the oral antidiabetic
sulfonylureas and biguanides:
tolbutamide, chlorpropamide, glibenclamide, glipizide and
metformin in urine, by means of high resolution thin layer chromatography (HPTLC). Direct
extraction was carried out with organic solvents at pH 4 and 9. The wave longitude used for the
localization of the spots was 254 nm and for obtaining the spectra a deuterium lamp was used, in
the 200 – 40nm range.
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Detection of these substances was carried out by means of comparison with standards of known
concentration. The extraction of the sulfonylureas was carried out at pH 4 with ether and of
metformin at pH 9, with chloroform: isopropylic alcohol (85:15). The limit of detection of each
one of these drugs, were also determined.
An experiment was carried in blood and viscera at pH 9, extracting directly with acetonitrile for
the determination of metformina in an intoxicated person.
In the future, a method of quantitative determination should be implemented including urine
samples and blood, which would constitute a valuable tool for the chemical toxicologycal
analysis, of these antidiabetic drugs.
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2. INTRODUCCION
El Servicio Médico Legal es una institución perteneciente al Ministerio de Justicia.
El objetivo de la medicina legal es el conjunto de principios científicos necesarios para dilucidar
los problemas biológicos humanos en relación con el derecho.
Uno de sus departamentos es Laboratorios, el cual incluye la unidad de análisis toxicológico
forense.
La unidad de Toxicología efectúa los exámenes químicos toxicológicos en fluidos biológicos,
pelo, vísceras y otros, a solicitud de tribunales y/o patólogos, con el propósito de establecer la
causa de muerte o las circunstancias que concurrieron en ella.
El presente trabajo consistió en la implementación de un método de detección de
hipoglicemiantes orales por HPTLC. Los fármacos a estudiar fueron tolbutamida, clorpropamida,
glibenclamida, glipizida y metformina, que corresponden a los subgrupos de las sulfonilureas y
biguanidas. Se utilizaron muestras de orina de pacientes diabéticos que consumen estos fármacos
y muestras de orina, libre de drogas, para realizar fortificaciones. La implementación de este
método, constituiría un valioso aporte para el desarrollo diario de los análisis realizados en el
Laboratorio de Toxicología particularmente, ante la interrogante si una persona fallecida ha
consumido alguno de estos fármacos, pudiendo este hecho haber contribuido en la causa de
muerte. Tanto las sulfonilureas como las biguanidas, se excretan principalmente por la orina,
siendo esta una muestra ideal para el análisis químico inicial. A pesar que las sulfonilureas se
excretan principalmente como metabolitos, las diferencias estructurales entre estos y las
moléculas originales son de características tales, que de todas maneras permitirán una
determinación inequívoca.
Los hipoglicemiantes orales, son utilizados en el tratamiento de la diabetes mellitus tipo II, por lo
cual existe una posibilidad que las muestras recolectadas para el análisis químico- toxicológico,
pertenezcan a una persona que esté afectado por esta enfermedad. La diabetes mellitus es una
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enfermedad de alta prevalencia en Chile, por lo que estos fármacos, además, podrían ser
consumidos por personas no diabéticas en forma accidental o voluntaria, lo que no es muy
común, pero posible, presentándose intoxicaciones graves.
La técnica utilizada para el análisis químico de estos fármacos fue cromatografía en capa fina de
alta resolución (HPTLC).
2.1. Hipoglicemiantes Orales
Los principales grupos de fármacos hipoglicemiantes orales, sulfonilureas y biguanidas, son
usados en la terapia de la diabetes mellitus tipo II no insulino dependiente (NIDDM). (Marchetti
et al, 1991). La diabetes mellitus es un conjunto de síndromes caracterizado por la presencia de
hiperglucemia crónica a
la que en general se asocian, en grado variable, un conjunto de
complicaciones vasculares y sistémicas (Freijanes y Florez,1997).
Los antecedentes históricos de los hipoglicemiantes están constituidos por el descubrimiento del
efecto metabólico de la guanidina por Watanabe, en 1918, y la introducción de la sintalina por
Frank, en 1926. Ambas fueron abandonadas poco después de su introducción en la terapéutica,
debido a sus notables efectos tóxicos (Figuerola, 1997)
2.1.1. Clasificación de los hipoglicemiantes orales.
Según la actividad y estructura se clasifican en:
a) sulfonilureas
b) biguanidas
c) tiazolidinedionas
d) inhibidores de α- glucosidasas(Freijanez y Florez, 1997)
2.1.2. Características de los fármacos hipoglicemiantes orales.
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2.1.2.1. Sulfonilureas.
Las sulfonilureas son derivados de las sulfamidas, en los cuales la estructura sulfonilurea
constituye el grupo esencial de la actividad hipoglucemiante. Diversas sustituciones en el anillo
bencénico y en el grupo urea han originado compuestos cuya potencia y propiedades
farmacocinéticas difieren notablemente (Freijanes y Florez, 1997)(ver anexo figura Nº 1, 2,3,4,5).
2.1.2.1.1. Mecanismo de acción de sulfonilureas
Se han propuesto al menos tres mecanismos de acción para las sulfonilureas:

Liberación de insulina a partir de las células ß del páncreas,

Reducción de las concentraciones séricas de glucagon

Efecto extrapancreático para potenciar la acción de la insulina en sus tejidos blancos
(Karam,1999).
A corto plazo, las sulfonilureas provocan la liberación de insulina de las células ß del páncreas
porque aumentan su sensibilidad a glucosa (Freijanes y Florez, 2000). Las sulfonilureas se fijan a
un receptor específico que se relaciona con un conducto de potasio en la membrana de la célula
. La fijación de una sulfonilureas inhibe el flujo de iones potasio a través del conducto,
depolarizándose la membrana. La depolarización, a su vez, abre un conducto de calcio y se inicia
el flujo de entrada de calcio y la liberación de la insulina preformada (Karam, 1999).
En la actualidad se ha establecido que la administración crónica de sulfonilureas a diabéticos
insulino no dependientes reduce las concentraciones séricas de glucagon. Esto podría contribuir
al efecto hipoglicemico de estos fármacos. Existen datos de que se presenta un aumento en la
fijación de insulina a los receptores tisulares durante la administración de sulfonilureas
a
pacientes con diabetes tipo II (Karam, 1999).
2.1.2.1.2. Reacciones adversas.
La reacción adversa mas frecuente producida por sobredosis aguda con sulfonilureas en pacientes
diabéticos y no diabéticos es una severa hipoglucemia con riesgo asociado de muerte, serios
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daños neurológicos, insuficiencia respiratoria, acidosis, coma y edema cerebral. Esta
hipoglucemia se presenta con mayor frecuencia con las sulfonilureas de acción prolongada
(glibenclamida y clorpropamida) y puede persistir por varios días. Se requiere la hospitalización,
administración continua de glucosa y monitorizacion por 2 o 3 días (Beert y Berkow, 1999;
Freijanes y Florez, 1997; Campbell, 2000, París y Ríos, 2000).
Otros síntomas asociados a sobredosis con sulfonilureas son: vértigo, debilidad, parestesia,
cefalea, letárgia, síntomas neuropsiquiátricos, nauseas, vómitos, dolor epigástrico, hepatitis,
hiponatremia, posiblemente por excesiva actividad de la hormona antidiurética (ADH), fiebre,
ictericia colestasica, reacciones de hipersensibilidad localizadas o generalizadas en la piel (rush
cutáneo, prurito, dermatitis exfoliativa, eritema multiforme y fotosensibilidad) y discrascias
sanguíneas (leucopenia, trombocitopenia, anemia aplástica, agranulocitosis) (París y Ríos, 2000;
Freijanes y Florez, 1997).
2.1.2.1.3. Interacciones
Las sulfonilureas presentan interacciones con algunos fármacos y sustancias que potencian la
acción hipoglucemiante como por ejemplo: ingesta aguda de alcohol, alopurinol, betabloqueadores, cloramfenicol, dicumarínicos, fenilbutazona y derivados, fibratos, guanetidina,
halofetano, IMAO, metformina, pirazolonas y derivados, probenecid, salicilatos en altas dosis,
sulfamidas y sulfapirazona. También existen interacciones que disminuyen la acción
hipoglucemiante:
ingesta crónica de alcohol, acetazolamida, ácido nicotínico, corticoides,
diazóxido, diuréticos, adrenalina, estrógenos, fenitoína, glucagon, indometacina, isoniacida,
rifampicina y tiroxina (Figuerola, 1997; Vert, 1985).
2.1.2.1.4. Metabolismo y excreción de sulfonilureas
Las sulfonilureas se absorben muy bien por vía oral y se fijan fuertemente a proteínas plasmaticas
entre un 60 a 99 %. Además tienen un volumen de distribución pequeño (Freijanes y Florez,
1997).
Todas las sulfonilureas son metabolizadas en el hígado y excretadas principalmente por la orina.
Las sulfonilureas de segunda generación son 100 veces más potentes que los de primera
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generación y son muy similares entre sí en cuanto eficacia clínica (Beert y Berkow, 1999; Magni
et al , 2000).
La tolbutamida tiene una vida media entre 4 y 7 horas, se une a proteínas plasmaticas entre 80 –
99 %, el volumen de distribución es entre 0,10 y 0,15 L/Kg. La tolbutamida se excreta en un 100
% en la orina y entre un 75 y 80 %, como metabolitos. Los metabolitos son carboxitolbutamida
(54 %) e hidroxitolbutamida (26 %) ambos inactivos (Moffat, 1986). ( ver anexo, figura Nº 6 y 7)
La duración del efecto de tolbutamida es entre 6 y 12 horas (Rang y Dale, 1995).
La clorpropamida tiene una vida media de 32 horas, se une a proteínas plasmaticas entre un 60 –
90 %, el volumen de distribución es entre 0,1 y 0,3 L/Kg. La clorpropamida se excreta en la orina
en aproximadamente 99 % y solamente un 10 % del fármaco se excreta sin cambios y el resto
como
metabolitos.
Los
metabolitos
son
2–hidroxi–clorpropamida
(55
%),
p–
clorobenzensulfonilurea (20 %), 3–hidroxiclorpropamida (2 - 3%), p–clorobenzensulfonamida (2
%) (Moffat, 1986; Vert, 1985). (ver anexo, figura Nº 8, 9, 10, 11)
La duración del efecto de clorpropamida es entre 24 y 72 horas (Rang y Dale, 1995).
La glibenclamida tiene una vida media de 5 y 10 horas, se une a proteínas plasmaticas en 99 %, el
volumen de distribución es entre 0,14 y 0,16 L/kg. Los metabolitos son 4-transhidroxiglibenclamida, 3-cis-hidroxiglibenclamida, ambos débilmente activos. La glibenclamida
se excreta en la orina como metabolitos en un 50 % y en la bilis también un 50% (Moffat, 1986,
Dale, 1999). ( ver anexo, figura Nº 12 y 13)
La duración del efecto de glibenclamida es hasta 24 horas (Rang y Dale, 1995).
La glipizida tiene una vida media de 3 y 7 horas, se une a proteínas plasmaticas entre 97 – 99 %,
el volumen de distribución es entre 0,14 – 0,16 L/Kg. La glipizida se excreta en la orina entre un
63 y 93 % y aproximadamente un 10 % vía fecal, solamente entre un 3 y 9 % se elimina sin
cambios en la orina y el resto como metabolitos. Los metabolitos son 4-transhidroxiciclohexilderivados, 3- cis-hidroxiciclohexilderivados ambos constituyen el 80 % y N(2acetilamino-etil-fenil-sulfonil)-N-ciclohexilurea solamente entre 1 y 2 %, todos inactivos
(Moffat, 1986, Vert, 1985). (ver anexo, figura Nº 14, 15, 16).
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La duración del efecto de glipizida es hasta 24 horas (Rang y Dale, 1995).
Las sulfonilureas atraviesan la barrera placentaria y pasan a la leche materna (Freijanes y Florez,
1997).
2.1.2.2. Biguanidas
Son derivados biguanidínicos de los que el único aceptado actualmente es la metformina
(Freijanes y Florez, 1997). La metformina
se ha utilizado como tratamiento principal en
pacientes con DM tipo II durante más de 30 años en la mayor parte del mundo (Beert y Berkow,
1999) (ver anexo, figura Nº 17).
2.1.2.2.1. Mecanismo de acción
La metformina es un fármaco antihiperglucemico (Beert y Berkow, 1999), pero no
hipoglucemiante, puesto que no afecta la secreción pancreática de insulina (Campbell, 2000). No
provoca la liberación de insulina. Su acción reductora de la glucosa sanguínea no depende de la
presencia de las células  pancreáticas funcionales. A nivel subcelular las biguanidas se fijan a la
membrana mitocondrial donde podrían afectar los sistemas de transporte (Karam, 1999). Entre
los efectos metabólicos que produce destacan los siguientes:

Estimulación directa de la glucólisis en los tejidos periféricos, con mayor eliminación de
glucosa de la sangre.

Reducciones de las concentraciones séricas de glucagon.

Aumento en la fijación de insulina a sus receptores.

Reducción de la gluconeogénesis hepática e inhibición de la absorción de glucosa,
aminoácidos y otros compuestos a nivel intestinal (Karam,1999).
La metformina estimula también la pérdida de peso y reduce los niveles séricos de lípidos y rara
vez causa acidosis láctica grave que es un efecto adverso asociado con las biguanidas más
antiguas (Beert y Berkow, 1999).
2.1.2.2.2. Reacciones adversas de biguanidas
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Los efectos adversos más importantes de la metformina son los gastrointestinales: anorexia,
nausea; aliento metálico en la boca, molestias abdominales y diarrea (Campbell, 2000).
La reacción más grave, aunque rara, es la acidosis láctica que se ha asociado a pacientes que
toman dosis terapéuticas en forma crónica o sobredosis aguda, puede llegar a ser letal, pero solo
aparece con dosis tóxicas o dosis normales en pacientes que han tenido problemas de salud
significativos como con insuficiencia renal crónica, insuficiencia hepatica, falla cardiaca
congestiva, infarto agudo al miocardio, alcoholismo, sepsis o mujeres embarazadas (Freijanes y
Florez, 1997; París y Ríos, 2000).
2.1.2.2.3. Interacciones
Cimetidina reduce el clearence renal de metformina en aproximadamente un 27%. Si se
administra conjuntamente se recomienda monitorear cuidadosamente su toxicidad. También
existe un potencial de interacción con furosemida y nifedipino. Aumentan la concentración
máxima de metformina y su área bajo la curva. Goma guar disminuye los niveles séricos de
metformina en aproximadamente un 40 %. El ácido nicotínico, fenitoína; corticosteroides,
diuréticos tiazídicos y simpaticomiméticos pueden interferir potencialmente con la actividad
antihiperglicémica de metformina, inhibiendo su acción (González, 1997).
2.1.2.2.4. Metabolismo y excreción de biguanidas
La metformina se absorbe mayormente a través del intestino delgado, es estable, no se fija a las
proteínas plasmaticas y se excreta sin biotransformación en la orina en aproximadamente un 90
%de una dosis oral. Tiene una vida media de eliminación de entre 1,3 y 4,5 horas y un volumen
de distribución de 3,7 L/Kg (Goodman y Gilman, 1996).
2.2. Análisis Químico Toxicológico de Hipoglicemiantes por HPTLC
La cromatografía agrupa a un conjunto importante y diverso de metodologías, que permiten
separar componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas, lo que en muchas
ocasiones resulta imposible por otros medios (Skoog et al,2001).
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En todas las separaciones cromatográficas, la muestra a analizar se desplaza a través de una fase
móvil, que puede ser un gas, un líquido o un fluído supercrítico. Esta fase móvil se hace pasar a
través de una fase estacionaria con la que es inmiscible y que se fija a una columna o a una
superficie sólida. Las dos fases se eligen de tal forma que los componentes de la muestra se
distribuyan de modo distinto entre la fase móvil y la estacionaria. Aquellos componentes que son
fuertemente retenidos por la fase estacionaria, se mueven lentamente con el flujo de la fase
móvil; por el contrario, los componentes que se unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven
con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se
separan en bandas y zonas discretas (Skoog, et al. 2001).
2.2.1. Clasificación de los métodos cromatográficos.
Según contacto de fase móvil y estacionaria
a) Cromatografia en columna.
b) Cromatografia en plano.
Según tipo de fase móvil y estacionaria.
a) Cromatografía de líquidos.
b) Cromatografía de gases.
c) Cromatografía de fluidos supercrítico (Skoog, et al.2001).
2.2.1.1. Cromatografía en capa fina.
En la cromatografía en plano o en capa fina (TLC), la fase estacionaria es una capa de partículas
de unos milímetros de espesor fijados sobre un soporte sólido de aluminio, plástico o vidrio
(Rubinson y Rubinson, 2001).
La fase móvil se mueve a través de la fase estacionaria por capilaridad, a veces ayudada por
gravedad o por aplicación de un potencial eléctrico. En la actualidad, la cromatografía en plano
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se centra en la técnica de la capa fina, es más rápida, tiene mayor resolución y más sensible que
su alternativa en papel (Skoog et al; 2001).
La principal ventaja de la cromatografía en capa fina, es que la muestra y el patrón se analizan
simultáneamente, mientras que en la cromatografía en columna, las muestras se deben analizar en
forma individual y secuencialmente (Rubinson y Rubinson2001).
El campo de aplicación de la cromatografía en capa fina es en la industria farmacéutica para los
controles de pureza, en los laboratorios clínicos y forenses, considerado uno de los métodos más
frecuentemente usado en muchos estudios bioquímicos y biológicos (Skoog et al; 2001)
La aplicación de la muestra es tal vez el aspecto más critico en la TLC, especialmente cuando se
trata de medidas cuantitativas (Skoog et al; 2001).
En los análisis cualitativos, el spot en una placa de TLC se caracteriza por la distancia que recorre
en relación a la recorrida por la fase móvil. El parámetro usado para caracterizar esta relación es
lo que se llama factor de retención o índice de retención abreviado como R f. Este valor depende
de las condiciones experimentales, como por ejemplo, la composición de la fase móvil, el tipo de
fase estacionaria, la temperatura, grado de saturación de la cámara y el tipo de compuestos
separados (Rubinson y Rubinson; 2001).
El uso de estándares es uno de los métodos que a menudo proporciona una identificación
experimental de los componentes de la muestra. Consiste en aplicar en la placa el extracto de la
muestra desconocida y estándares (Skoog et al; 2001).
El desarrollo cromatográfico es el transporte del analito por la fase móvil a través de la fase
estacionaria. El eluyente asciende por la placa gracias al efecto de capilaridad ejercido entre las
finas partículas. A medida que el eluyente se desplaza, pasa por el punto de aplicación de la
muestra, la disuelve y la arrastra por la placa distribuyéndose entre el disolvente que se desplaza
y la fase estacionaria. Después que el disolvente ha pasado a través de la mitad o las dos terceras
partes de la longitud de la placa, se retira esta del recipiente y se seca (Skoog et al; 2001).
En cromatografía en capa fina de alto rendimiento (HPTLC) se debe usar partículas con una
distribución de tamaño más homogénea que en una placa convencional de TLC, se mejora el
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relleno. También se reduce el diámetro medio de las partículas desde los 20 μm usados
tradicionalmente en placas de TLC, hasta 5 μm utilizados en placa de HPTLC. Con el fin de no
dañar la superficie de la placa de HPTLC cuando se aplican las muestras, existen en el mercado
aplicadores mecánicos de muestras o microjeringuillas. En general el HPTLC requiere mayor
equipamiento y más experiencia que la TLC convencional, todos las etapas del análisis por
HPTLC se realizan por aparatos mecánicos y detectores instrumentales: aplicación de la muestra,
desarrollo y detección (Rubinson y Rubinson, 2001).
2.3. Instrumento
Se describe la presente metodología para la determinación de los niveles en orina de sulfonilureas
y biguanidas, su aplicación clínica y forense, mediante una simple y eficiente extracción de la
droga y el uso de la cromatografía en capa fina instrumental (HPTLC)
Después de sembrar los extractos obtenidos y estándares, se eluye, seca e introduce dentro del
densitómetro que tiene una iluminación UV del compartimento de escáner a 254 nm. Las etapas
a seguir se programan a través del CATS ® y son las siguientes
1.- Scan de todos los tracks: Mediante este se detectan todos los peaks de absorción en un track
y que corresponden a los “spots” vistos al ultravioleta (254 nm). Este scan se realiza en todos los
tracks, que generalmente son seis.
2.- Integración: mediante la integración se separa las zonas del cromatograma que contienen el
analito a estudiar.
3.- Espectros del scan: mediante esta función se obtienen in situ los espectrogramas (absorbancia
entre 190 – 400 nm) de cada uno de los peaks de absorción del track.
4.- Librería de espectros: mediante esta función, todos los espectros resultantes del paso anterior
se guardan y después son comparados con de librerías del programa CATS® de CAMAG®.
El programa CATS® de CAMAG® contiene seis librerías originales del proveedor (RP1, RP2,
RP3, KRIM1, KRIM2, KRIM·3) y una librería denominada DEFAULT que guarda espectros
ingresados al sistema (Manual del equipo).
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2.4. Objetivo General
Implementar un método de análisis cualitativo para la detección de fármacos hipoglicemiantes
orales en orina mediante cromatografía en capa fina de alta resolución, en la investigación con
fines clínicos y forenses
2.5. Objetivos Específicos

Aislar y determinar cualitativamente tolbutamida, clorpropamida, glibenclamida, glipizida y
metformina en muestras de orina.

Establecer las condiciones para una adecuada recuperación del analito, resolución y distancia
de migración, en cuanto a solventes o mezclas de ellos en la extracción y elución de
sulfonilureas y metformina en forma conjunta y aislada.

Establecer las condiciones de pH adecuadas para la extracción de cada uno de estos fármacos
hipoglicemiantes.

Establecer las posibles interferencias que puedan ocurrir en las muestras de orina, las cuales
podrían eventualmente dificultar la identificación de estos medicamentos, como por ejemplo:
putrefacción, en caso de muestra antigua, otros fármacos utilizados, tratamiento de la
intoxicación.

Crear una librería de espectros de los hipoglicemiantes considerados, como referencia para la
identificación de los analitos por correlación.

Determinar en forma práctica cual es el límite de detección de cada uno de los
hipoglicemiantes en las condiciones cromatográficas estudiadas.
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3. MATERIALES Y METODOS
3.1. Reactivos y Soluciones

Cloroformo. (p.a)

Alcohol isopropílico. (p.a)

HCl 5 %.

Tampón CO3-2:HCO3-(3:2 de Na2CO3 : NaHCO3).

Eter.(p.a)

Diclorometano.(p.a)

Etanol(p.a).

Agua destilada.

Acido acético glacial. (p.a)

Sulfato de sodio anhidro. (p.a)

Acetato de etilo. (p.a)

Acetonitrilo. (p.a)
3.2. Materiales

Pipetas

Vasos de precipitado

Tubos centrifuga

Micropipetas, Hirschmann Laborgerate®

Frascos de extracto ámbar.

Cromatoplacas, Merck® (ver anexo, figura Nº 18)
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
Microjeringuillas, CAMAG® (ver anexo, figura Nº 19)
3.3. Equipos e Instrumento

Vortex, Thermolyne ®

Centrifuga, Centra CL2®

Baño termoregulado, Orthmann®

Balanza, Perkin - Elmer®

Equipo de HPTLC, CAMAG TLC Scanner II® (ver anexo, figura Nº 20)

Equipo aplicador de muestras, LINOMAT IV®. (ver anexo, figura Nº 21)

Computador, Acer®

Sonicador, Branson 1210®

Freezer, Lab- line®

Estufa, Memmert®

Cámaras de elución, CAMAG®, (ver anexo, figura Nº 22).

Impresora; Epson®
3.4. Métodos
Para la determinación de hipoglicemiantes orales en orina, se utilizó cromatografía en capa fina
de alta resolución, previa preparación de la muestra, ajuste de pH, extracción de la muestra con
solventes individuales o mezclas, evaporación, desarrollo cromatográfico, etc.
3.4.1. Obtención de biblioteca
El primer paso a realizar fue la obtención de estándares para crear una librería propia de espectros
dentro de la librería del computador que contiene el programa CATS® de CAMAG®, para lo
cual se prepararon estándares de todos los hipoglicemiantes a determinar, en las siguientes
concentraciones: tolbutamida 10 mg %, clorpropamida 24 mg %, glibenclamida 1 mg %,
glipizida 10 mg % y metformina 36 mg %.
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Estos estándares fueron preparados en metanol, corridos en éter: diclorometano, (50: 50 ), acetato
de etilo y también en etanol: agua : ácido acético (80: 20 : 6) y visualizados a 254 nm para
localizar los spots. Finalmente se obtuvieron los espectros característicos entre 190 y 400 nm.
3.4.2. Muestras de orina
Las muestras de orina a analizar
se obtuvieron de personas diabéticas que consumen
clorpropamida, glibenclamida, glipizida y metformina. Las muestras libres de droga utilizadas
para la fortificación con hipoglicemiantes, se recolectaron de personas que no consumían ningún
tipo de medicamentos. La fortificación se realizó tomando un volumen de 6 ml, agregando un
volumen de un estándar en una cantidad determinada, entre 100 – 400 μl y luego se realizó la
extracción como se indica en cada método.
3.4.3. Extracción, siembra y desarrollo de los cromatogramas.
Para determinar los hipoglicemiantes tolbutamida, clorpropamida, glibenclamida, glipizida y
metformina en muestras de orina y en experimentos adicionales en sangre y vísceras, se debió
utilizar un método basado en algunos textos, para la determinación cualitativa (Robertson.,et al
1979; Shenfield., et al 1990, Schlicht., et al 1978) el que consistió en lo siguiente:
3.4.3.1. Metodología de extracción a pH 4 con éter

En un vaso de precipitado se colocan 6 ml de orina con hipoglicemiantes.

Examinar el pH con papel indicador universal.

Acidificar a pH 4 con HCl 5 % (gotitas).

Traspasar a tres tubos de centrífuga en partes iguales.

Agregar éter hasta completar 6 ml.

Agitar en vortex por cinco minutos.

Centrifugar a 2500 r.p.m. por 3 minutos.

Extraer la fase etérea de los tres tubos con pipeta.
18

Filtrar por sulfato de sodio anhidro a una cápsula de porcelana.

Evaporar la fase etérea en baño termoregulado a 60º C. Evitando resequedad de la muestra.

Una vez evaporado reconstituir con éter y vaciar en frasco ámbar.

Evaporar a sequedad a 60 º C.

Reconstituir con 200 μl de metanol.

Sembrar el extracto mediante aplicador LINOMAT® IV, en volúmenes exactos (1 – 40 μl).

Desarrollar en éter – diclorometano (50: 50) como solvente de elución

Secar la placa en estufa a 60 º C.

Observar con luz ultravioleta la existencia de spots.

Leer la cromatoplaca en CAMAG® II con luz UV del compartimento de escáner, de longitud
de onda de 254 nm para localizar los peaks, posteriormente se obtienen los espectros
característicos bajo lámpara de deuterio (190 – 400 nm).

Comparar los espectrogramas con los estándares de las librerías propias del equipo y la
creada en iguales condiciones.
3.4.3.2. Metodología de extracción a pH 9

En un vaso de precipitado se colocan 6 ml de orina con hipoglicemiantes.

Examinar el pH con papel indicador universal.

Alcalinizar a pH 9 con CO3 – 2 : HCO3 -

Traspasar a tres tubos de centrifuga en partes iguales.

Agregar cloroformo : alcohol isopropílico (85: 15) hasta completar 6 ml.

Agitar en vortex por cinco minutos

Centrifugar a 2500 r.p.m. por 3 minutos

Extraer la fase orgánica de los tres tubos, con pipeta.

Filtrar por sulfato de sodio anhidro a una cápsula de porcelana.
19

Evaporar la fase orgánica en baño termoregulado a 60º C. Evitando resequedad de la muestra.

Una vez evaporado reconstituir con cloroformo: alcohol isopropílico (85: 15) y vaciar en
frasco ámbar.

Evaporar a sequedad a 60 º C

Reconstituir con 200 μl de metanol.

Sembrar el extracto mediante aplicador LINOMAT® IV, en volúmenes exactos (1 – 40 μl).

Desarrollar la placa en etanol : agua : ácido acético (80: 20: 6) que es el solvente de elución.

Secar la placa en estufa a 60 ºC.

Observar en luz ultravioleta la presencia de spots (254 nm)

Leer la cromatoplaca en CAMAG® II con luz UV del compartimento de escáner de longitud
de onda de 254 nm para localizar los spots, posteriormente se obtienen los espectros
característicos, bajo lámpara de deuterio (190 – 400 nm).

Comparar los espectrogramas obtenidos con los de las librerías originales del instrumento y
la creada, en iguales condiciones
3.4.3.3. Metodología de extracción a pH 4 con acetato de etilo.

En un vaso de precipitado se colocan 6 ml de orina con hipoglicemiantes.

Examinar el pH con papel indicador universal.

Acidificar a pH 4 con HCl 5 % (gotitas)

Traspasar a tres tubos de centrifuga en partes iguales.

Agregar acetato de etilo hasta completar 6 ml

Agitar en vortex por cinco minutos

Centrifugar a 2500 r.p.m. por 3 minutos

Extraer la fase orgánica de los tres tubos, con pipeta.

Filtrar por sulfato de sodio anhidro a una cápsula de porcelana.
20

Evaporar la fase orgánica en baño termoregulado a 60º C. Evitando resequedad de la muestra.

Una vez evaporado reconstituir con acetato de etilo y vaciar en frasco ámbar

Evaporar a sequedad a 60 º C

Una vez evaporado reconstituir la muestra con 200 μl de metanol

Sembrar el extracto mediante aplicador LINOMAT IV, en volúmenes exactos (1-40μl).

Desarrollar la placa en acetato de etilo que es el solvente de elución

Secar la placa en estufa a 60 º c

Observar en luz ultravioleta la presencia de spots (254 nm)

Leer la cromatoplaca en CAMAG® II con luz UV del compartimento de escáner de longitud
de onda de 254 nm para localizar los spots, posteriormente se obtienen los espectros
característicos, bajo lámpara de deuterio (190 – 400 nm).

Se debe comparar los espectros obtenidos con los de las librerías originales del instrumento y
la creada, en iguales condiciones.
3.4.3.4. Experimento en vísceras y sangre para la extracción de metformina.

Tomar volumen de muestra de sangre o vísceras de 10 ml y poner en vaso de precipitado.

Ajustar a pH 9 con tampón HCO3- : CO3 -2

Traspasar a tres tubos de centrifuga en partes iguales y agregar acetonitrilo hasta completar 9
ml.

Agitar en vortex por cinco minutos hasta homogeneidad

Centrifugar por tres minutos a 2500 r.p.m.

Extraer la fase orgánica de los tres tubos con pipeta.

Filtrar por sulfato de sodio anhidro a una cápsula de porcelana.

Evaporar la fase orgánica en baño termoregulado a 60 ºC. Evitar resequedad de la muestra.

Reconstituir el extracto con 200 microlitros de metanol.
21

Sembrar el extracto en cromatoplaca calidad (HPTLC) por LINOMAT IV en volúmenes
exactos (1-40μl)

Desarrollar la cromatoplaca en cámara Etanol: agua : ácido acético (80:20:6)

Leer cromatoplaca en CAMAG II con luz UV del compartimento de escáner de longitud de
onda de 254 nm para localizar los peaks, posteriormente se obtienen los espectros
característicos, con lampara de deuterio (190 – 400 nm).
3.4.4. Metodología para la determinación del límite de detección en placa.
Se realizó sembrando en placas con todos los estándares de hipoglicemiantes por separado, para
visualizar cual era la mínima cantidad de cada uno de ellos que se detecta y del cual se pudo
obtener un espectro resolutivo, que pueda ser utilizado para el análisis químico toxicológico
habitual. (Ver anexo, tabla1,2,3,4,5). Esto se realizó en éter: diclorometano (50: 50) para las
sulfonilureas en estudio y en etanol: agua: ácido acético (80: 20: 6) para metformina. La
determinación se realizó en triplicado para tolbutamida, clorpropamida y glipizida y en
cuadruplicado para la glibenclamida y metformina.
3.4.5. Justificación de los métodos de extracción utilizados.
La razón de escoger esta metodología para determinar hipoglicemiantes es que asegura un buen
resultado en cuanto a recuperación del analito, además los solventes incluidos son de uso común
dentro de otros métodos utilizados en el Laboratorio. También debemos precisar que es un
método económico porque la extracción se realiza en tubos y no en columnas que tienen un alto
costo. Este método también ahorra tiempo puesto que la extracción es directa. Para la elección del
pH se basó en los utilizados comúnmente en los análisis químico – toxicológico y también en las
características estructurales de las moléculas que determinan las características ácido – base de
los fármacos hipoglicemiantes en estudio.
Si es un ácido, a extraer con solvente no polar, ajustar el pH (acidificar), que asegure el 100 % de
las moléculas al estado no ionizado.
Si es una base, a extraer con solvente no polar, ajustar el pH (alcalinizar), que asegure el 100 %
de las moléculas al estado no ionizado.
22
4. RESULTADOS Y DISCUSION
4.1. Librería de Espectros
Se ingresó en la librería DEFAULT del programa CATS® de CAMAG®, los espectros
correspondientes a los fármacos en estudio (Ver anexo, figura Nº,23, 24, 25, 26, 27). Los
estándares utilizados se prepararon en metanol en las siguientes concentraciones: tolbutamida 10
mg %, clorpropamida 24 mg %, glibenclamida 1 mg %, glipizida 10 mg % y metformina 36 mg
%. Para la preparación de estos estándares se tomaron en cuenta las concentraciones terapéuticas
y tóxicas.
4.2. Condiciones de Extracción y de Elución
En la elección de solventes óptimos de elución, se logró determinar que para tolbutamida,
clorpropamida, glibenclamida y glipizida es la mezcla, éter: diclorometano (50: 50).
Se descartó el acetato de etilo por que eluye los analitos muy cerca del frente del solvente. En
cambio, en la mezcla éter: diclorometano (50: 50) tienen una afinidad media, lo que es ideal en la
cromatografía en capa fina.
Para metformina, etanol: agua: ácido acético (80:20:6), fue óptimo como solvente de elución, ya
que deposita el analito en la zona
media de la placa. Este solvente debía ser preparado
diariamente para minimizar los errores en la determinación. También se debe precisar que con
este solvente, se ocupa más tiempo en el desarrollo de la placa que con éter: diclorometano
(50:50).
Se pudo establecer el pH óptimo para la extracción de cada uno de estos fármacos, mediante
pruebas sucesivas de muestras de orina fortificadas con los fármacos en estudio. Se extrajo las
sulfonilureas a pH 4, pero tiene un inconveniente analítico ya que se coextraen muchas impurezas
y esto es un tema que aún no se ha podido solucionar en toxicología forense. Para tratar este
problema se intentó de implementar un método de purificación con carbón activado, resultando
completamente desfavorable.
23
Se determinaron los solventes de extracción apropiados para cada uno de los fármacos: éter para
las sulfonilureas y cloroformo: alcohol isopropílico (85:15)para metformina.
4.3. Identificación
4.3.1. Tolbutamida.
Se determinó tolbutamida a pH 4 utilizando como solvente de extracción éter y como solvente de
elución éter: diclorometano (50: 50), en 6 ml de orina fortificadas con 100 μl de estándar al 10
mg %, volumen de sembrado del extracto de 20 μl (figura Nº 28). Se determinó solamente en
muestras fortificadas debido a que no se contó con muestras reales, dado que este fármaco tiene
un bajo consumo. En la figura 28, se observa en el lado izquierdo, el espectro de los extractos de
la muestra fortificada y en el lado derecho el espectro de la librería DEFAULT de CAMAG®.
4.3.2. Clorpropamida.
Se logró extraer clorpropamida a pH 4, utilizando como solvente de extracción éter, y como
solvente de elución éter: diclorometano (50: 50). Las muestras de clorpropamida utilizadas fueron
fortificadas y reales. Se da el ejemplo de la muestra O-20-4 en la cual se extraen 6 ml de orina de
persona diabética con tratamiento de clorpropamida, se siembran 10 μl de un volumen de 200 μl,
se lee a 254 nm para la visualización de los peaks y posteriormente se obtiene el espectro
característico de clorpropamida, el cual es comparado con la librería del programa,
correspondiendo a una correlación de 0,9998. (Ver anexo, figura 29 y 30). Esto también se
realizó en muestras fortificadas dando idénticos resultados. La clorpropamida se determinó en
todas las muestras tanto de pacientes como fortificadas.
4.3.3. Glibenclamida.
Se detectó glibenclamida en muestras de orina fortificadas y reales, a pH 4 utilizando como
solvente de extracción éter y como solvente de elución éter: diclorometano (50: 50). En la
muestra fortificada con 100 μl de estándar 1 mg %, se puede determinar claramente la presencia
del fármaco y se observa un espectro muy resolutivo, que correlaciona con el de librería y
estándar sembrado conjuntamente en el track 6 de la placa, identificando la glibenclamida. (ver
anexo, figura Nº 31). Con respecto a la determinación en muestra real, se da el ejemplo de la
24
muestras de orina obtenida de un paciente diabético que consume este fármacos, denominada O146-4 de cuyo extracto se sembró 20 μl y se obtuvo el espectro de glibenclamida que comparado
con el de librería da un índice de correlación de 0,9798, identificando el analito como tal. (ver
anexo, figura Nº 32 y 33).
La identificación en muestras que contenían glibenclamida se pudo efectuar mejor en muestras
fortificadas que en reales, por la baja concentración en la orina, lo cual está ligado a las bajas
dosis que consumen las personas en tratamiento con este fármaco. Además el fármaco se elimina
solo en un 50 % por la orina.
4.3.4. Glipizida.
Se determinó glipizida igualmente a pH 4, se utilizó éter para la extracción y éter: diclorometano
(50: 50 para el desarrollo cromatográfico. Las muestras con glipizida, fortificadas y reales, dieron
resultados positivos. Un ejemplo es la muestra O-4602-4 de una persona con posible consumo de
hipoglicemiantes, se extrajo 6 ml y se sembró 10 μl, obteniéndose el espectro característico de
glipizida, el cual posteriormente se comparó con el de librería del programa (ver anexo, figura Nº
34 y 35).
4.3.5. Metformina.
Se determinó metformina a pH 9, utilizando como solvente de extracción cloroformo: alcohol
isopropílico (85: 15) y de elución: Etanol: agua: ácido acético (80: 20: 6). La determinación de
metformina se efectuó en muestras de pacientes tratados con este fármaco. Se adjunta el ejemplo
de la muestra de orina O-132-9, de la cual se extrajo 6ml y sembró 20 μl del extracto alcalino. El
resultado fue un espectro que se correlacionó con un índice de 0,9576 al compararse con el de la
librería del programa. (ver anexo, figura 36 y 37).
4.4. Limite de Detección
Con respecto al límite de detección se realizó en éter: diclorometano (50:50) para la sulfonilureas
y en Etanol: agua: ácido acético (80:20:6) para la metformina.
25
Se determinó el límite de detección de tolbutamida de concentración 10 mg %. Se sembró placas
por triplicado, en los siguientes volúmenes 1, 5, 10, 15, 20, 25 μl, se visualizan las alturas de los
spots y se determinó el límite de detección en aproximadamente 0,50 μg, correspondiente al
volumen de 5μl y se muestra el espectro dado con esta cantidad puesto que con la cantidad
sembrada de 0,1μg no se visualizó el espectro. (ver anexo, figura Nº 38, 39, 40, 41, tabla Nº1).
Se determinó el límite de detección de clorpropamida de concentración 24 mg %. Se sembró en
placas por triplicado, en los siguientes volúmenes 1, 3, 5, 10, 15, 20 μl, posteriormente se
visualizaron la alturas de los spots y se determinó el límite de detección en 0,24 μg,
correspondiente al volumen de 1μl. Se muestra el espectro correspondiente al límite de detección,
puesto que no se obtuvo resultados positivos al realizar el experimento con concentraciones
menores, los cuales se generaron realizando diluciones del estándar (ver anexo, figura Nº42, 43,
44, 45 , tabla Nº 2).
Se determinó el límite de detección de glibenclamida de concentración 3,78 mg %. Se sembró en
placas por cuadruplicado en los siguientes volúmenes 1, 3, 5, 7, 10, 12μl, se visualizaron las
alturas de los spots y se determinó el límite de detección en placa de 0.11 μg, correspondiente al
volumen de 3 μl. Se descartó la cantidad de 0,03 μg puesto que no se obtuvo espectro
característico para glibenclamida. Se muestra el espectro correspondiente al límite de detección
(ver anexo, figura Nº 46, 47, 48, 49, tabla Nº3)
Se determinó el límite de detección de glipizida de concentración 10 mg %. Se sembró en placas
por triplicado en los siguientes volúmenes 1, 3, 5, 7, 10,12μl. Se visualizan las alturas de los spots
y se determinó el límite de detección en aproximadamente 0,3 μg, correspondiente al volumen de
3 μl, se descarta la cantidad anterior de 0,1μg por que no se visualiza espectro característico de
glipizida (Ver anexo, figura Nº 50, 51, 52, 53, tabla Nº 4).
Se determinó el límite de detección en placa de metformina de concentración 36 mg %. Se
sembró en placas por cuadruplicado en los siguientes volúmenes 1, 3, 5, 7, 10,12μl, se
visualizaron las alturas de los spots y se determinó el límite de detección en aproximadamente
1,08 μg, correspondiente a un volumen de 3 μl. Se muestra el espectro correspondiente al límite
26
de detección, descartando el track anterior que corresponde a 0,36 μg, puesto que no se visualiza
el espectro. (Ver anexo, figura Nº 54, 55, 56, 57, tabla Nº 5).
El límite de detección que se determinó, solamente se refiere a la mínima cantidad que puede ser
detectada por el instrumento dando un espectro de calidad, sin deformaciones, esto también
servirá para guiar las etapas de los analistas, lo cual constituirá un verdadero ahorro de tiempo y
material, lo que es indispensable en la función publica que se desempeña. El criterio utilizado fue
la comparación entre los espectros obtenidos en el límite de detección y los espectros de la
librería DEFAULT y también visualizando la altura de los spots dentro del cromatograma. La
mayoría de los tracks descartados es por no visualizase un espectro.
4.5. Detección de Metformina en Sangre y Vísceras
Se logró detectar metformina en sangre y vísceras de una persona muerta por intoxicación con
este fármaco. Se extrajo una muestra de sangre a pH 9 con acetonitrilo, se sembró 20 μl del
extracto. Se desarrolló la cromatografía y se determinó la presencia de metformina en la muestra.
Se realizó igual procedimiento con una muestra de vísceras digeridas con sulfato de amonio y
también se detectó metformina. Con respecto a esta muestra se tenían antecedentes médicos del
consumo de fármacos hipoglicemiantes orales.( ver anexo, figura Nº 58, 59, 60, 61, 62, 63).
Con respecto a la experimentación en vísceras y sangre, el procedimiento de extracción utilizado
es de uso corriente para una serie de análisis químico toxicológicos, obteniéndose resultados
positivos en esta muestra en particular.
Con respecto al parámetro Rf, aunque todavía se puede utilizar en otro tipo de investigaciones, en
la práctica de la toxicología forense no es algo definitivo, puesto que las muestras que llegan día
a día al laboratorio no son tomadas recientemente, algunas tienen alto grado de sedimento,
(sangre, putrefacción) y otros fármacos, lo que en suma interfieren en el Rf. Por esto se realiza
una librería de espectros y no por el Rf, ya que para un mismo analito existen, en la práctica, en
algunos casos diferencias significativas y en otros, coinciden perfectamente.
Uno de los objetivos que no se cumplió es la determinación de interferencias de fármacos y otras
sustancias. Solamente podemos suponer la posible interferencia por la ausencia de espectros,
27
deformación de los mismos, spots sobre la placa, fluorescencia, interferencia en el Rf
característico, etc. Sin embargo, no se obtuvieron datos que comprueben esto claramente.
28
5. CONCLUSIONES Y PROYECCIONES
Se implementó un método de determinación cualitativa de tolbutamida, clorpropamida,
glibenclamida, glipizida y metformina, basado en la cromatografía en capa fina de alta
resolución, previa extracción a pH controlado, de muestras de orina y sangre, con solventes
orgánicos, individual o mezclas, lo cual constituye una valiosa herramienta de trabajo para el
análisis toxicológico de estos fármacos en el Instituto Médico Legal.
A futuro se debería desarrollar un método especifico que incluyera determinación cuantitativa
para todos los hipoglicemiantes, especialmente en muestras de sangre, lo que permitiría emitir
juicios mejor fundados con respecto a la participación de estos fármacos como causante de
intoxicaciones. Esto es un desafió que queda pendiente. Además se podrían implementar métodos
con otras técnicas para poder verificar con aún mayor certeza los resultados obtenidos.
También sería conveniente desarrollar un método de lavado de extractos ácidos puesto que
complican la determinación de los analitos presentes en las muestras.
Además se podría implementar un método de screening y así tener algún indicio de la presencia
de estos analitos en las muestras de orina o sangre y no solo basándose en los antecedentes
clínicos.
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29
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Vert, O. Savala, C. (1985), Actualización en Diabetes Mellitus, editorial Universitaria, Santiago,
pag. 97 – 105.
ANEXO
FIGURA 1. Formula general de sulfonilureas.
30
FIGURA 2. Sustituciones en R1 y R2 para tolbutamida.
FIGURA 3. Sustituciones en R1 y R2 para clorpropamida.
FIGURA 4. Sustituciones en R1 y R2 para glibenclamida.
FIGURA 5. Sustituciones en R1 y R2 para glipizida.
31
FIGURA 6. Hidroxitolbutamida.
FIGURA 7. Carboxitolbutamida.
FIGURA 8. Para-clorobenzensulfonilurea.
FIGURA 9. Para-clorobenzensulfonamida.
32
FIGURA 10. 3-hidroxiclorpropamida.
FIGURA 11. 2- hidroxiclorpropamida.
FIGURA 12. 4-transhidroxiglibenclamida
33
FIGURA 13. 3-cishidroxiglibenclamida.
FIGURA 14. 3-cishidroxiglipizida.
34
FIGURA 15. 4-transhidroxiglipizida.
FIGURA 16. N (2-acetilamino-etil-fenil-sulfonil)-N-ciclohexilurea
35
FIGURA 17. Formula estructural y química de metformina
TABLA 1. Determinación del límite de detección de tolbutamida, volúmenes y cantidades
sembradas.
TRACK
1
2
3
4
5
6
VOLUMEN μl
1
5
10
15
20
25
μg
0.10
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
TABLA 2. Determinación del límite de detección de clorpropamida, con volúmenes y cantidades
sembradas.
36
TRACK
1
2
3
4
5
6
VOLUMEN μl
1
3
5
10
15
20
μg
0.24
0.72
1.20
2.40
3.60
4.80
TABLA 3. Determinación del límite de detección de glibenclamida, volúmenes y cantidades
sembradas.
TRACK
1
2
3
4
5
6
VOLUMEN μl
1
3
5
7
10
12
TABLA 4.
μg
0.03
0.11
0.18
0.26
0.37
0.45
Determinación del límite de detección de glipizida, volúmenes y cantidades
sembradas.
TRACK
1
2
3
4
5
6
VOLUMEN μl
1
3
5
7
10
12
μg
0.10
0.30
0.50
0.70
1.00
1.20
TABLA 5. Determinación del límite de detección de metformina, volúmenes y cantidades
sembradas.
TRACK VOLUMEN μl μg
1
1
0.36
2
3
1.08
3
5
1.80
4
7
2.52
37
5
10
3.60
6
12
4.32
FIGURA 18. Sembrado de cromatoplaca a través de LINOMAT IV.
FIGURA 19. Microjeringuilla utilizada para sembrado de muestras.
38
FIGURA 20. Densitómetro, CAMAG TLC SCANNER II.
FIGURA 21. Equipo aplicador de muestra LINOMAT IV.
39
FIGURA 22. Cámaras de elución para cromatoplacas.
40
FIGURA 23. Espectro correspondiente a 2 μg de tolbutamida estándar librería DEFAULT de
programa CATS de CAMAG.
FIGURA 24.
Espectro correspondiente a 2,4 μg de clorpropamida estándar en librería
DEFAULT de programa CATS de CAMAG.
41
FIGURA 25.
Espectro correspondiente a 0,25 μg de glibenclamida estándar en librería
DEFAULT de programa CATS de CAMAG.
42
FIGURA 26. Espectro correspondiente a 1,5 μg de glipizida estándar en librería DEFAULT de
programa CATS de CAMAG.
43
FIGURA 27. Espectro correspondiente a 3,6μg de metformina estándar en librería DEFAULT de
programa CATS de CAMAG.
44
FIGURA 28. Detección de tolbutamida en muestra de orina fortificada con 100 μl de estándar de
concentración 10 mg %, volumen de sembrado 20 μl. En el lado izquierdo se visualiza el espectro
de la muestra y en el lado derecho el espectro del estándar en librería DEFAULT correspondiente
a 2 μg. Coeficiente de correlación 0,9972.
45
FIGURA 29. Determinación de clorpropamida en muestra real de orina O-20-4, volumen de
sembrado del extracto 10 μl.
46
FIGURA 30.
Comparación entre espectro de muestra real O-20-4 y espectro estándar de
clorpropamida de librería DEFAULT, correspondiente a 2,4 μg . Coeficiente de correlación de
0,9998.
47
FIGURA 31. Determinación de glibenclamida en muestra fortificada con estándar de 1 mg %,
sembrando un volumen de extracto de 20μl. Al lado izquierdo se observa la muestra y en lado
derecho el espectro en librería DEFAULT correspondiente a 0,25 μg.
48
FIGURA 32. Espectro de muestra O-146-4, volumen de sembrado 20 μl. determinación de
glibenclamida.
49
FIGURA 33.
Comparación entre el espectro de muestra O-146-4 y espectro de librería
DEFAULT de programa CATS de CAMAG correspondiente a 0,25 μg de glibenclamida. Índice
de correlación 0,9798. El espectro superior corresponde al estándar y el inferior a la muestra.
50
FIGURA 34. Determinación de glipizida en muestra real de orina O-4602-4, volumen de
sembrado 10 μl.
51
FIGURA 35. Comparación entre muestra real de orina O-4602-4 con glipizida y estándar de
glipizida de librería correspondiente a 1,5 μg, volumen de extracto sembrado 10 μl. Coeficiente
de correlación 0,9742.
52
FIGURA 36. Determinación de metformina en muestra O-132-9 correspondiente a persona
tratada con este fármaco.
53
FIGURA 37. Comparación entre espectro muestra O-132-9 y espectro de metformina de 3,6 μg
en librería CATS. El espectro superior corresponde al estándar y el inferior a la muestra.
54
FIGURA 38. Cromatograma del límite de detección en placa de tolbutamida 10 mg %, cantidad
de 0,5 μg.
55
FIGURA 39. Espectro correspondiente a 0,5 μg de tolbutamida estándar.
56
FIGURA 40. Cromatograma del límite de detección de tolbutamida 10 mg %, cantidad 1,0 μg.
FIGURA 41. Cromatograma del límite de detección de tolbutamida estándar de 10 mg %,
cantidad 1,5 μg.
57
FIGURA 42. Cromatograma del límite de detección en placa clorpropamida patrón 24 mg
%,cantidad 0,24 μg.
58
FIGURA 43. Espectro correspondiente a 0,24 μg de clorpropamida estándar.
59
FIGURA 44.
Cromatograma de límite de detección de clorpropamida estándar 24 mg %,
cantidad 0,72 μg
60
FIGURA 45. Cromatograma del límite de detección de clorpropamida estándar 24 mg %,
cantidad 1,2 μg.
FIGURA 46. Cromatograma del límite de detección de glibenclamida estándar 3,78 mg %,
cantidad 0,03 μg
61
FIGURA 47. Cromatograma del límite de detección de glibenclamida 3,78 mg %, cantidad
0,11μg
62
FIGURA 48. Espectro característico correspondiente a 0,11 μg de glibenclamida estándar.
63
FIGURA 49. Cromatograma del límite de detección de glibenclamida 3,78 mg %, cantidad 0,18
μg.
64
FIGURA 50. Cromatograma del límite de detección de glipizida estándar de 10 mg %, cantidad
0,1 μg.
65
FIGURA 51. Cromatograma del límite de detección de glipizida estándar al 10 mg %, cantidad
0,3 μg.
66
FIGURA 52. Espectro correspondiente a 0.3 μg de glipizida estándar.
67
FIGURA 53. Cromatograma del límite de detección de glipizida estándar al 10 mg %, cantidad
0,5 μg
68
FIGURA 54. Cromatograma del límite de detección en placa de metformina de concentración 36
mg %, cantidad 0,36 μg.
69
FIGURA 55. Cromatograma del límite de detección en placa de metformina de concentración 36
mg %, cantidad 1,08 μg.
70
FIGURA 56. Espectro correspondiente a 1,08μg de metformina estándar.
71
FIGURA 57. Cromatograma del limite de detección de metformina 36 mg %, cantidad 1,80 μg.
72
FIGURA 58. Determinación de metformina en sangre de persona intoxicada, extracción con
acetonitrilo a pH 9 con tampón CO3 –2: HCO3 volumen de sembrado 20 μl. En el lado izquierdo
se visualiza el espectro de la muestra y en el derecho el espectro de la librería DEFAULT.
73
FIGURA 59. Comparación entre el espectro de la extracción de persona intoxicada y estándar de
metformina en biblioteca DEFAULT de programa CATS de CAMAG.
74
FIGURA 60.
Índice de correlación entre muestra de persona intoxicada v/s estándar de
metformina de 3,6 μg. El coeficiente de correlación es de 0,9983.
75
FIGURA 61. Cromatograma que visualiza la presencia de metformina en sangre de paciente
intoxicado, volumen 20 μl. El primer “spot” corresponde a la metformina.
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FIGURA 62. Comparación entre una muestra de vísceras de persona intoxicada y estándar de
metformina 3,6 μg. El espectro superior corresponde al estándar en librería DEFAULT y el
inferior a la muestra.
77
FIGURA 63. Índice de correlación entre muestra de vísceras y estándar de metformina 3,6 μg.
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