(PO) CLONACIÓN Y SECUENCIACIÓN DEL GEN aroA DE Flavobacterium psychrophilum Álvarez, B.; Secades, P.; Guijarro, J.A. Área de Microbiología, Departamento de Biología Funcional, Facultad de Medicina, Universidad de Oviedo, c/ Julián Clavería s/n, 33006 Oviedo Resumen Flavobacterium psychrophilum es el agente etiológico de la enfermedad denominada “cold water disease” (CWD) que afecta a salmones y truchas en las piscifactorías de todo el mundo. La patología causada por esta bacteria Gram negativa, aerobia estricta y psicrotrofa, es recurrente y causa un alto grado de mortalidad entre alevines de trucha y salmón con la consiguiente pérdida económica. Hasta el momento no se ha desarrollado ningún tratamiento eficaz, en consecuencia, cuando se presenta la enfermedad en una piscifactoría los daños económicos son ya inevitables. La enfermedad afecta a alevines con un sistema inmunológico inmaduro, es por ello que hasta ahora los intentos de vacunación con microorganismos muertos se han visto frustrados. La estrategia a seguir es infectar a los alevines con una cepa viva atenuada, que mediante su crecimiento lento en el pez, y sin ocasionar la enfermedad, permita el desarrollo progresivo de una respuesta inmune capaz de contrarrestar infecciones futuras Para el desarrollo de este sistema de profilaxis se interrumpirá el gen aroA de la cepa salvaje. Este gen codifica la enzima 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa, necesaria para la síntesis de aminoácidos aromáticos y cuya función es esencial para la supervivencia y crecimiento de la bacteria y por tanto, para poder causar la enfermedad. Justificación El proceso de obtención de la cepa atenuada tiene los siguientes pasos: 1º. Clonación y secuenciación del gen aroA de F. psychrophilum. 2º. Obtención por interrupción génica de una cepa mutante aroA de F. psychrophilum. 3º. Determinación de la virulencia de la cepa mutante aroA en relación con la cepa salvaje y su posible uso como vacuna. En la comunicación que se llevará al congreso se describe el primer paso en el desarrollo de la vacuna que es la clonación y secuenciación del gen aroA. Resultados y discusión Para lograr la clonación del gen aroA de F. psychrophilum se utilizó la cepa mutante auxotrofa para dicho gen Escherichia coli AB2829. La clonación se realizó mediante la complementación de la mutación de la cepa de E. coli con un fragmento de DNA de F. psychrophilum. El posterior análisis de este fragmento reveló la presencia de una pauta abierta de lectura cuya secuencia deducida de aminoácidos presentaba un grado de homología significativo con las secuencias de aminoácidos de la proteína codificada por los genes aroA de diversos microorganismos. Se pudo observar que la secuencia de F. psychrophilum tenía un mayor grado de similitud con las secuencias de Haemophilus influenzae y de Pasteurella multocida (35 % de homología en ambos casos). El análisis de los dominios conservados de esta proteína se realizó utilizando los programas informáticos Pileup (programas GCG de análisi de secuencias) y Boxshade de la página de internet http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html.