DESARROLLO DE U TEST DE ELISA SA DWICH PARA

Profesor Patrocinante
Dr. Alex Romero Z.
Instituto de Patología Animal
Facultad de Ciencias Veterinarias
Profesor Co-Patrocinante
Dr. Ricardo Enríquez S.
Instituto de Patología Animal
Facultad de Ciencias Veterinarias
DESARROLLO DE U TEST DE ELISA SADWICH PARA
DETECTAR CEPAS DE Flavobacterium psychrophilum
Tesis de Grado presentada como parte
de los requisitos para optar al grado de
Licenciado en Bioquímica y Título
Profesional de Bioquímico
PAULA ADREA SATAA SEPÚLVEDA
VALDIVIA – CHILE
2008
AGRADECIMIENTOS
Me faltan palabras para agradecerle Dr. Alex Romero, por recibirme en su
laboratorio, sus enseñanzas, apoyo y confianza. Muchas gracias.
A Vania, Sra. Mónica y Don Esteban por la paciencia y la gran disponibilidad que
han tenido conmigo.
A mis compañeros de laboratorio Claudio R, Claudio A y René, por su buena
onda y simpatía sobre todo en los momentos más difíciles. No cambien!!
A mis pececitos Hans y Constanza, por su gran amor y paciencia. Ustedes son la
luz de mi vida y la fuerza que me permite salir adelante cada día. Los amo.
A mi mamá y papá por darme la oportunidad de estudiar y confiar en mí. Gracias
por su apoyo y por estar siempre conmigo. Los quiero.
A mis hermanos Leo y Pedro por todo el cariño, alegría y compañía. Los quiero.
Esta tesis fue realizada gracias a apoyo del proyecto FONDECYT 1080571.
“Cuando me equivoco me ayudan,
cuando dudo me aconsejan y
siempre que los llamo están a mi lado”
A mis padres.
i
ÍNDICE DE CONTENIDOS
Página
1. RESUMEN
1
SUMMARY
2
2. INTRODUCCIÓN
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1
MATERIALES
3
19
19
3.1.1 Reactivos
19
3.1.2 Instrumentos
21
3.1.3 Cepas bacterianas
22
3.1.3.1 Cepas de Flavobacterium psychrophilum
22
3.1.3.2 Cepa de Escherichia coli
24
3.1.4 Oligonucleótidos
24
3.1.5 Animales de experimentación
24
3.1.6 Anticuerpos
25
3.1.6.1 Anticuerpo anti-proteínas de membrana de
F. psychrophilum
25
3.1.6.2 Anticuerpo anti- F. psychrophilum completa
25
3.1.6.3 Anticuerpo anti- M13
25
3.1.6.4 Anticuerpo anti- F. psychrophilum
25
3.1.6.5 Anticuerpos recombinantes 68-97-125
25
ii
3.2
MÉTODOS
3.2.1 Cultivo de bacterias
26
26
3.2.1.1 Cultivo de F. psychrophilum
26
3.2.1.2 Cultivo de E. coli
26
3.2.2 Extracción de ADN genómico
27
3.2.3 Cuantificación de ADN
28
3.2.4 Reacción de PCR para la identificación de F. psychrophilum
28
3.2.5 Extracción de proteínas de membrana
29
3.2.6 Preparado de células lisadas de F. psychrophilum
29
3.2.7 Cuantificación de proteínas
30
3.2.8 Producción de anticuerpos policlonales anti-F. psychrophilum
30
3.2.9 Electroforesis en geles de poliacrilamida
31
3.2.10 Western blot
32
3.2.11 Ensayos de Dot blot
33
3.2.12 Inmunohistoquímica
34
3.2.13 Inmunofluorescencia
35
3.2.14 Evaluación de fagos
35
3.2.15 Amplificación y concentración de fagos
35
3.2.16 ELISA sandwich
36
3.2.17 Análisis estadístico
37
4. RESULTADOS
4.1
4.2
38
Caracterización de las cepas de F. psychrophilum
38
4.1.1 Identificación de F. psychrophilum mediante PCR
38
Producción de anticuerpos policlonales anti-F. psychrophilum
41
iii
4.2.1 Extracción de proteínas de membrana de F. psychrophilum
41
4.2.2 Titulación de los anticuerpos policlonales anti-F. psychrophilum
producidos en conejo
43
4.2.3 Determinación del límite de detección de antígenos
utilizando anticuerpos policlonales contra F. psychrophilum
4.3
43
Caracterización de los anticuerpos policlonales
anti-proteínas de membrana de F. psychrophilum
46
4.3.1 Análisis de los patrones de proteínas inmunoreactivas
de F. psychrophilum
46
4.3.2 Análisis de la reacción cruzada de los anticuerpos
policlonales contra F. psychrophilum en órganos
de Salmo salar y bacterias patógenas de peces
48
4.3.3 Inmunodetección de proteínas totales de distintos
aislados de F. psychrophilum
51
4.3.4 Identificación de F. psychrophilum en peces infectados
naturalmente con este patógeno
55
4.3.5 Inmunodetección en extendidos de cultivo del patógeno
y lesiones de truchas arcoiris (O. mykiss) infectados
naturalmente con F. psychrophilum
4.4
57
4.3.5.1 Inmunohistoquímica (IHQ)
57
4.3.5.2 Inmunofluorescencia (IFAT)
58
Evaluación de los anticuerpos recombinantes
62
iv
4.4.1 Inmunodetección de F. psychrophilum utilizando
los anticuerpos recombinantes mediate Dot-blot
62
4.4.2 Inmunodetección de aislados de F. psychrophilum
utilizando anticuerpos recombinantes mediante Dot-blot
4.4.3 Titulación anticuerpos recombinantes
4.5
64
64
Desarrollo de una prueba de ELISA sandwich para detectar
F. psychrophilum
65
4.5.1 Análisis de la sensibilidad de la prueba de ELISA sandwich
65
4.5.2 Análisis de la especificidad de la prueba de ELISA sándwich
70
4.5.3 Inmunodetección de aislados de F. psychrophilum por el
método de ELISA sandwich
73
5. DISCUSIÓN
75
6. BIBLIOGRAFÍA
85
v
INDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1.
Características morfológicas de Flavobacterium psychrophilum
Figura 2.
Electroforesis en gel de agarosa al 1% del producto de PCR
específico del gen 16S rRNA de Flavobacterium psychrophilum
Figura 3.
45
Análisis de Western blot de los patrones de proteínas
Inmunoreactivas
Figura 7.
44
Análisis de la sensibilidad de los anticuerpos contra Flavobacterium
psychrophilum mediante Dot blot
Figura 6.
42
Titulación de los anticuerpos policlonales contra
Flavobacterium psychrophilum mediante Dot blot
Figura 5.
40
Electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% de proteínas
totales y de membrana de Flavobacterium psychrophilum
Figura 4.
39
47
Análisis de Western blot de la reacción cruzada de los
anticuerpos contra Flavobacterium psychrophilum con
proteínas de órganos de Salmo salar
Figura 8.
49
Análisis de Western blot de la reacción cruzada de los
anticuerpos contra Flavobacterium psychrophilum con
proteínas de bacterias patógenas de peces
Figura 9.
Electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% de proteínas
totales de aislados de Flavobacterium psychrophilum
Figura 10.
50
Análisis de Western blot de la reacción de los anticuerpos
policlonales contra proteínas totales de distintos aislados
53
vi
de Flavobacterium psychrophilum
Figura 11.
Caracterización de Flavobacterium psychrophilum de lesiones
de peces infectados naturalmente
Figura 12.
54
56
Inmunodetección en extendidos de bacterias en cultivo e improntas
de lesiones de peces infectados naturalmente con Flavobacterium
psychrophilum mediante IHQ
Figura 13.
59
Inmunodetección en extendidos de bacterias en cultivo e improntas
de lesiones de peces infectados naturalmente con
Flavobacterium psychrophilum mediante IHQ
Figura 14.
60
Inmunodetección en extendidos de bacterias en cultivo y lesiones
de peces infectados naturalmente con Flavobacterium
psychrophilum mediante IFAT
Figura 15.
Análisis de Dot blot de los anticuerpos recombinantes contra
Flavobacterium psychrophilum
Figura 16.
61
63
Análisis de Dot blot de proteínas totales de aislados de
Flavobacterium psychrophilum utilizando anticuerpos recombinantes 66
Figura 17.
Titulación de los anticuerpos recombinantes en presencia de
PM-1306 mediante ELISA sandwich
Figura 18.
67
Titulación de los anticuerpos recombinantes en presencia de
PM- 4605 mediante ELISA sandwich
68
Figura 19.
Análisis de la sensibilidad de la prueba de ELISA sandwich
69
Figura 20.
Análisis de la especificidad de la prueba de ELISA sandwich
contra las proteínas totales de órganos de Salmo salar
Figura 21.
Análisis de la especificidad de la prueba de ELISA sandwich
71
vii
contra las proteínas totales de bacterias patógenas de
peces
Figura 22.
72
ELISA sandwich para la detección de las proteínas totales
de los distintos aislados de Flavobacterium psychrophilum
74
viii
ÍNDICE DE TABLAS
Página
Tabla 1.
Registro de enfermedades de salmónidos de importancia
económica en Chile
Tabla 2.
Tabla 3.
4
Putativos precursores de proteasas de secreción de
Flavobacterium psychrophilum
8
Origen de los aislados de Flavobacterium psychrophilum
23
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
BSA
: Albúmina sérica de bovino
DAB
: Diaminobencidina.
ELISA
: Enzimo inmuno ensayo
FP
: Flavobacterium psychrophilum
IHQ
: Inmunohistoquímica.
IFAT
: Inmunofluorescencia indirecta
kDa
: Kilo Dalton
LB
: Luria-Bertani
PBS
: Tampón fosfato salino
PCR
: Reacción en cadena de la polimerasa
PEG
: Polietilenglicol
PMSF
: Fosfometilsulfonilfosfato
SDS
: Dodecil sulfato de sodio.
TEMED
: N, N, N´, N´ - tetrametilendiamina
Tris
: Tris-(hidroximetil)-aminometano
Triton X-100 : Octal fenoxi polietoxietanol
Tween 20
: Polioxietilen (20) sorbitan monolaurato
TYES
: Triptona, extracto de levadura y sales
TBS
: Tampón tris salino
TMB
: 3,3’,5,5’ tetrametil bencidina
1
1. RESUMEN
Flavobacterium psychrophilum es el agente etiológico de la “Enfermedad Bacteriana
de Agua Fría” y el “Síndrome del Alevín de la Trucha Arco iris” que causa serias
mortalidades de especies salmonídeas y no salmonídeas e importantes pérdidas
económicas para la industria salmonera. Por lo tanto, es importante contar con técnicas
diagnósticas que permitan la identificación temprana de esta bacteria. El objetivo del
presente trabajo fue desarrollar una prueba de ELISA capaz de detectar este patógeno
de peces.
Se generaron anticuerpos policlonales inoculando conejos con proteínas de
membrana y totales de la cepa 1306 y 4605. Estos anticuerpos presentaron una alta
especificidad no presentando reacción cruzada con bacterias patógenas ni con órganos
de importancia para el diagnóstico. Más aún
estos fueron capaces de detectar 9
aislados de F. psychrophilum en estudio. Por otra parte, los anticuerpos recombinantes
reconocieron las proteínas de membrana y totales de la mayoría de las cepas (1306,
4605 y los 9 aislados).
Ambos anticuerpos, policlonales y recombinantes demostraron en el desarrollo de la
prueba de ELISA sándwich, ser capaces de detectar de manera eficaz proteínas de F.
psychrophilum.
2
SUMMARY
Flavobacterium psychrophilum is the ethiological agent of Bacterial Cold-Water
Disease” and “Rainbow Trout Fry Syndrome” that causes serious mortalities of species
salmonid and non salmonid and substantial economic losses in salmonid aquaculture.
Therefore, it is important to have diagnostic technics that allow the early identification of
this bacteria. The aim of this study was to develop of ELISA test able to detect this
pathogen of fish.
Policlonal antibodies were generated inoculating rabbits with membrane proteins and
total proteins of the strains 1306 and 4605. These antibodies presented a high
specificity, not presenting cross reaction with other pathogenic bacterias neither with fish
tissue of importance in the diagnosis. Even more these were capable to detect the nine
isolated of F. psychrophilum studied here. On the other hand, the recombinant
antibodies recognized total and membrane proteins and total of the strains (1306, 4605
and the nine isolated).
Both policlonal, and recombinant antibodies demonstrated in the development of this
ELISA sandwich test, to be able to detect in an effective way proteins of F.
psychrophilum.
3
2. INTRODUCCION
Hoy en día y considerando el aumento creciente que ha ido adquiriendo la
salmonicultura en Chile, es importante poseer las herramientas necesarias para
diagnosticar y prevenir a tiempo la aparición y diseminación de enfermedades que son
la causa de altas mortalidades e impacto económico para la industria salmonera.
Las condiciones intensivas en la producción de los centros de
cultivo,
los
cambios en el medio ambiente marino y la baja rigurosidad en las medidas de
prevención y control de enfermedades,
permiten que enfermedades originadas por
agentes infecciosos, principalmente bacterias y virus, tengan una mayor relevancia, ya
que pueden ser transmitidas de un pez a otro.
En Chile, el primer incidente documentado de enfermedades que afectaron a
truchas y salmones lo realizó Wood en el año 1970, al registrar la presencia de una
peligrosa enfermedad característica sólo de salmones, la Enfermedad Bacteriana del
Riñón (BKD), la que se diseminó desde Río Blanco (V Región) a las pisciculturas de
Polcura y Lautaro y a otras zonas donde se liberaron peces sobrevivientes,
constituyendo éste, el primer registro de introducción y diseminación de una
enfermedad exótica (Snyder, 1971).
A continuación, de acuerdo al orden de aparición se muestran en la tabla 1 las
enfermedades más importantes registradas hasta el año 2000 y que han tenido un serio
efecto económico para la industria de cultivo de salmones:
4
Tabla 1. Registro de enfermedades de salmónidos de importancia económica en
Chile
Año de
Enfermedades
aparición
1970
1984
1989
1992
1993
1995
1995
2000
Enfermedad Bacteriana del Riñón (BKD).
Provocada por la bacteria Renibacterium salmoninarum.
Necrosis Pancreática Infecciosa (IPN).
Autor y año de
la publicación
Wood, 1970
Mc Allister and
Reyes, 1984
Septicemia rickettsial de salmones (SRS).
Bravo
Provocada por la bacteria Piscirickettsia salmonis.
Campos, 1989.
Enfermedad Entérica de la Boca Roja (ERMD)
Toledo
Provocada por la bacteria Yersinia ruckeri.
al.,1992.
Síndrome del Alevín de la Trucha Arcoiris.
Bustos
Provocada por la bacteria Flexibacter psychrophilus.
1995
Microsporidiosis
Causada por el microsporidio Nucleospora salmonis.
Furunculosis atípica.
Causada por Aeromonas salmonicida atípica.
and
et
et
al.,
Bravo, 1996
Bravo, 2000
Mixosporidiosis
Chacko et al.,
Provocada por Kudoa thyrsites.
2001
Fuente: FIP Nº 09/2001; “Técnicas de diagnóstico de enfermedades de salmónidos,
mitilídos, pectinídos y ostreídos”.
5
Las enfermedades bacterianas son responsables de grandes mortalidades,
especialmente las producidas por bacterias Gram negativas, las cuales pueden actuar
como patógenos primarios o ser invasores oportunistas y/o secundarios, causando
procesos patológicos en peces susceptibles (Monrás et al., 2003).
Una de las bacterias más comunes presentes en salmones corresponden al
género Flavobacterium. Este género posee un importante grupo de patógenos de peces
de agua dulce, ampliamente diseminado en cultivos de salmónidos a través del mundo
(Bernardet and Kerouault, 1989). Estas bacterias dan origen a diversas patologías en
salmones, desde necrosis ulcerativa de la piel hasta infección sistémica afectando los
principales órganos (Holt et al.,1993). Estos organismos presentan un amplio rango de
virulencia y han sido denominados patógenos oportunistas de peces (Shotts and Teska,
1989). La habilidad de estos organismos para causar enfermedad aguda y crónica, y su
natural presencia en el medio ambiente acuático, los caracteriza como el grupo de
bacterias patógenas mas devastadores para los peces (Shotts and Starliper, 1999).
Dentro de éstas, la especie de mayor importancia en salmónidos es Flavobacterium
psychrophilum.
Esta eubacteria Gram negativa afecta a todas las especies de peces salmónidos
(Borg, 1960), siendo particularmente susceptibles salmón coho (Oncorhynchus kisutch),
y trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss). Sin embargo, infecciones por F. psychrophilum
han sido descritas en algunas especies de peces no salmónidos tal como anguila
(Anguilla anguilla), carpa común (Cyprinus carpio) (Lehmann et al., 1991), y ayu
(Plecoglossus altivelis) (Iida and Mizokami,1996).
F. psychrophilum fue inicialmente aislado de riñón y lesiones externas de la
enfermedad del salmón Coho juvenil, O. kisutch (Walbaum), en el estado de
6
Washington, USA y fue originalmente asignado como Cytophaga psychrophila (Borg,
1960). La patología de la enfermedad causada por este organismo ha sido descrita por
Davis (1946), en trucha arcoiris juveniles O. mykiss
(Walbaum), en la cual una
característica lesión epidémica ocurrió sobre o cercana al pedúnculo, por lo cual se le
denomino “Enfermedad del Pedúnculo”. Por otra parte, en infecciones de salmón coho
se refirió a “Enfermedad Bacteriana de Agua Fría” y “Enfermedad a Baja Temperatura”,
ya que la epizootología fue más prevalente en invierno y primavera cuando la
temperatura del agua estuvo bajo los 10ºC (Borg, 1960; Holt, 1988). Asimismo,
Rangdale (1995) la denominó como “Síndrome del alevín de la trucha arcoiris”
(Rainbow Trout Fry Síndrome, RTFS), diagnosticándose en truchas arcoiris en
incubadoras y balsas jaulas en los lagos de Chile desde el año 1993 (Rangdale, 1995).
F. psychrophilum es un bacilo filamentoso, curvo y de bordes redondeados
Gram negativo, flexible, débilmente refráctil y aerobio estricto (Holt, 1988; Rangdale,
1995; Matedoja et al., 2001). Tiene un diámetro de 5µm, una longitud entre 1,25 y
6,25µm (Pacha, 1968; Bernardet and Grimont, 1989), y además presentan movimiento
deslizante (Bernardet and Kerouault, 1989; Schmidke and Carson, 1995). Para su
aislamiento, los medios de cultivos que se utilizan son: agar MAO, agar Cytophaga,
agar Shieh y TYES, siendo la temperatura óptima de cultivo de 15ºC por 48-96 horas
(Holt et al.,1993). En estos medios de cultivo desarrolla colonias de pigmentación
amarilla convexas, circulares y solevantadas, con un diámetro de 1-5 mm. Además no
está capacitado para metabolizar carbohidratos (Pacha, 1968; Bernardet and Kerouault,
1989).
Los factores más importantes que determinan la severidad de la enfermedad son
la temperatura del agua y la virulencia de las cepas de F. psychrohpilum. Sin embargo,
7
los factores que determinan la virulencia de este patógeno, aún no están
completamente dilucidados.
Holt et al. (1989) demostraron que la temperatura del agua es de suma
importancia en la expresión de la patogenicidad de ésta bacteria. En truchas arcoiris (O.
mykiss), salmones coho (O. kisutch), y chinook (Oncorhynchus tshawytscha), infectados
experimentalmente con F. psychrophilum, se observaron que las más altas
mortalidades ocurrieron a bajas temperaturas del agua (3-15ºC). La mortalidad bajó al
incrementarse la temperatura por sobre los 15ºC, no observándose mortalidades por
sobre los 23ºC. Estos autores, sugieren que el efecto que tiene la temperatura sobre la
mortalidad, se debe en parte, a su efecto sobre el crecimiento de la bacteria dentro de
los tejidos del huésped. La temperatura además podría tener un efecto sobre la
producción de exoproteasas y otros posibles determinantes de virulencia, tal como el
factor leucocitolítico ya descrito para otros patógenos bacterianos (Fuller et al., 1977).
La virulencia de los diferentes aislados de F. psychrophilum puede variar
enormemente (Holt et al., 1993; Madsen and Dalsgaard, 2000; Nematollahi et al., 2003).
Varios factores de virulencia incluyendo proteasas, exotoxinas, endotoxinas y adesinas
contribuyen a la patogenicidad de F. psychrophilum (Dalsgaard, 1993; Bertolini et al.,
1994; Secades et al., 2001, 2003).
Dalsgaard (1993) demostró que F. psychrophilum es activamente proteolítico y
que esta naturaleza proteolítica juega un importante rol en la patogenicidad de las
cepas. Duchaud et al. (2007) secuenciaron el genoma completo de F. psychrophilum.
Estos autores indicaron que el genoma de este patógeno de peces, codifica para 13
proteasas putativas de secreción probablemente implicadas en la virulencia y/o en la
destrucción de los tejidos del hospedero (Tabla 2).
8
Tabla 2. Putativos precursores de proteasas de secreción de Flavobacterium
psychrophilum (Duchaud et al. 2007)
Locus
Gen
FP0081
FP0082
Familia
Producto
M50
Probable precursor de la familia M50 de una
metaloproteasa de zinc asociada a membrana
M1
Probable precursor de la familia M1 de una
metaloproteasa
Probable precursor de la familia M13 de una
metaloproteasa Pep0
FP0086
Pep0
M13
FP0231
Fpp1
No asignado
FP0232
Fpp2
M43
precursor de una metaloproteasa psicrofilica Fpp1
precursor de una metaloproteasa psicrofilica Fpp2
FP0280
M36
Probable precursor de la familia fungalisina M36 de
una metaloproteasa
FP0281
M36
Probable precursor de la familia fungalisina M36 de
una metaloproteasa
FP1024
M43
Probable precursor de la familia citofagalisina de
una metaloproteasa
FP1619
M43
Probable precursor de la familia citofagalisina de
una metaloproteasa
FP1763
S8
Probable precursor de la familia subtilisina S8 de
una serina endopeptidasa
FP1777+
FP1776
M43
Precursor de una colagenasa truncada
FP2364
M48
Probable precursor de la familia M48 de una
metaloproteasa de zinc asociada a membrana
S8
Probable precursor de la familia subtilisina S8 de
una serina endopeptidasa
FP2396
9
Dos
proteasas
extracelulares
fueron
caracterizadas
bioquímica
e
inmunológicamente: la metaloproteasa Fpp1 (FP0231; Secades et al., 2001) y Fpp2
(FP0232; Secades et al., 2003). En el año 2001 Secades caracterizó una
metaloproteasa psicrofílica de 55kDa (Fpp1), que depende de las concentraciones de
ión calcio para su actividad y estabilidad térmica. Adicionalmente, estroncio y bario
también pueden activar esta proteína. Sobre la base de sus características bioquímicas,
Fpp1 fue incluida en el grupo de las metaloproteasas que tienen un pH óptimo de 6,5
para su actividad. Además esta enzima demostró ser más activa entre los 25ºC y los
40ºC. Sin embargo, su actividad disminuyó rápidamente a los 45ºC. Esta proteasa
hidroliza gelatina, laminina fibronectina, fibrinógeno, colágeno tipo IV, y, en menor grado
colágeno tipo I y II. Fpp1 también degrada actina y miosina, elementos básicos del
sistema muscular de los peces.
Secades (2003), caracterizó otra metaloproteasa,
Fpp2, la cual tiene una masa molecular estimada de 62kDa con el ión calcio unido a la
molécula, el cual juega un rol importante en la termoestabilidad de la enzima. Su
actividad proteolítica es óptima a pH 6,0-7,0 y 24ºC, siendo inactiva a temperaturas por
sobre los 42ºC. En condiciones óptimas la enzima es capaz de hidrolizar la matriz
extracelular y proteínas musculares.
Adicionalmente a estas dos metaloproteasas, Bertolini et al. (1994) encontraron
que
F. psychrophilum
produjo 2 proteasas bacterianas (114 y 152kDa), las que
degradaban caseína y gelatina, y otras ocho proteasas (32 a 86kDa), que degradaban
gelatina no así caseína. Aunque se encontraron algunas relaciones entre la
composición de las proteasas y la virulencia de los aislados, la correlación no fue
absoluta.
10
Otros importantes factores de virulencia son las toxinas citolíticas tal como las
hemolisinas bacterianas. Lorenzen (1994), sugirió que la anemia desarrollada por
alevines de truchas arcoiris infectados con F. psychrophilum se debió en cierto grado a
la capacidad que tiene esta bacteria de lisar y aglutinar parcialmente los eritrocitos de
truchas arcoiris. Esto fue demostrado más tarde por Lorenzen et al. (1997).Por otra
parte, se ha demostrado que en otros patógenos de peces, como Vibrio anguillarum, la
toxina VAH5 es capaz de lisar los eritrocitos de trucha arcoiris (Rodkhum et al., 2005).
En F. psychrophilum el gen FP0063 codifica una proteína con un 53% de homología a
VAH5, la cual podría cumplir un rol similar en la patogenicidad y cooperar con la
secreción de proteasas para la destrucción del tejido (Duchaud et al., 2007).
Por otra parte, la familia de toxinas formadoras de poros, citolisinas activadas por
tiol (thiol-activated cytolysin, TACYs), han sido implicadas en la patogenicidad de varias
bacterias Gram positivas. Estas TACYs son capaces de gatillar varias vías de
señalización en una varidad de tipos celulares del hospedero, como se muestra para
listeriolisina O (LLO), y neumolisina. En F. psychrophilum, el gen FP0097 codifica una
proteína que presenta dominios similares a los descritos en TACYs, lo cual sugiere que
la proteína FP0097 puede funcionar como una modulina bacteriana, ya que inducen la
liberación de citocinas, que a su vez dañan los tejidos (Duchaud et al., 2007).
Varias
moléculas
de
la
superficie
de
F.
psychrophilum,
incluyendo
lipopolisacáridos (LPS), han sido implicadas en su patogénesis e identificados como
potencial vacuna y/o como macromoléculas candidatos para el diagnóstico (MacLean et
al., 2001).
Estudios previos han sugerido que el componente O de los LPS de F.
psychrophilum es altamente inmunogénico y que puede estar relacionado con la
11
respuesta inmune protectiva en trucha arcoiris (Crump et al., 2001; Rahman et al., 2002;
LaFrentz et al., 2004).
Crump et al. (2001) mediante análisis de Western blot de células tratadas con
proteinasa K, encontraron que F. psychrophilum exhibe LPS
que comprenden
oligosacáridos de baja masa molecular y polímeros que contienen el antígeno-O de alta
masa molecular. Estos autores identificaron un antígeno de 16kDa aproximadamente,
que correspondería a un LPS de baja masa molecular el cual es probablemente el
componente predominante de la envoltura celular gruesa de esta bacteria, ya que fue
encontrado en abundancia en el medio de cultivo. Adicionalmente Crump et al. (2001)
identificaron LPS con cadenas de polisacáridos O de alta masa molecular, con una
masa molecular de aproximadamente 70 a 200Kda. Análisis de la composición del LPS
de
F. psychrophilum reveló una cadena O compuesta por una repetición de
trisacáridos, conteniendo un inusual azúcar (N-acilado bacillosamina), que podría ser
único para esta bacteria y por tanto, ser utilizado como molécula blanco para fines de
diagnóstico.
Además de las toxinas bacterianas, exoenzimas y macromoléculas asociadas a
membrana externa, componentes asociados con la adhesión también deben ser
consideradas como importantes factores de virulencia. Un primer requisito para el éxito
de la colonización del tejido del hospedero, es la capacidad de adherirse. Componentes
de la superficie bacteriana como fimbrias, pili, cápsula y capa superficial han
demostrado estar asociadas con la adhesión a la superficie, así como la iniciación y
progresión de varias enfermedades infecciosas. En este contexto, se ha demostrado
que F. psychrophilum posee una delgada capa (Dalsgaard, 1993; Rangdale, 1995). En
consecuencia, la superficie celular bacteriana debe ser considerada como una suave
12
capa polielectrolita que permite el flujo de fluidos a través de una capa de cargas fijas.
La presencia de esta capa suave disminuye la barrera de energía a causa de la
repulsión electrostática en la interacción de los organismos con las células diana y, por
consiguiente, deben desempeñar un papel importante en la adhesión inespecífica
(Morisaki et al., 1999).
Kondo et al. (2002) reportaron que F. psychrophilum tiene fuertes propiedades
adhesivas a la superficie de los peces, branquias y ovas. Duchaud et al. (2007)
identificaron en el genoma de F. psychrophilum 27 genes probablemente involucrados
en la adhesión bacteriana. Quince de ellos están organizados en tandem y codifican
proteínas con repeticiones ricas en leucina similares a BspA y LrrA de la bacteria
periodontopatogénica Bacteroides forsythus y Treponema denticola, respectivamente.
Estas proteínas inmunogénicas de la superficie celular se fijan fuertemente a los
componentes de la matriz extracelular y
juegan un rol
en la unión al tejido oral
humano. Estos autores plantean que probablemente otras proteínas implicadas en la
adhesión son las siguientes: (i) FP2413, que contiene cinco dominios fibronectina tipo III
que participan en la unión a la superficie celular y un dominio CUB que se encuentran
en las proteínas extracelulares de espermadesina y en familias peptidasas eucariotas, y
(ii) FP1830, FP0016 y FP0595, las cuales contienen dominios fibronectina tipo III.
Las proteínas de la superficie celular de F. psychrophilum son importantes
blancos
del
sistema
inmunológico
del
hospedero.
Mediante
SDS-PAGE
e
inmunodetección se identificaron antígenos reconocidos por el hospedero como
OmpH/P18 (FP2098; Massias et al., 2004; Dumetz et al., 2006), OmpA/P60 (FP0156;
Merle et al., 2003; Dumetz et al., 2007), y la proteína antigénica específica para esta
bacteria (FspA), (FP2019; Crump et al., 2005). Todos ellos están probablemente
13
implicados en las interacciones bacteria-hospedero, ya que se incluyen en un conjunto
de proteínas de F. psychrophilum antigénicas reconocidas principalmente por
antisueros de peces convalescientes que fueron naturalmente infectados con este
patógeno. Duchaud et al. (2007) identificaron 35 proteínas que contienen un péptido
señal y una región conservada C-terminal de 70 aminoácidos. Numerosas búsquedas
en las bases de datos identificaron 170 proteínas que contienen esta región conservada
C-terminal exclusivamente en los miembros del phylum Bacteroidetes. Por lo tanto, los
miembros de este phylum contienen el motivo
C-terminal [YPNPX21-23 (N / D)
X2GX18-27GXY] que probablemente direcciona a las proteínas a ser expuestas en la
superficie bacteriana. Y algunas de éstas podrían ser de importancia para la virulencia.
La identificación de F. psychrophilum y el diagnóstico de la enfermedad que este
patógeno causa son tradicionalmente basados en los signos clínicos, seguido por el
aislamiento en el clásico cultivo en agar y análisis taxonómicos (Bernardet et al., 1996;
Daskalov et al., 1999). Estos métodos consumen tiempo y no diferencian las distintas
cepas. Por lo tanto, métodos más sensibles y específicos de identificación son
necesarios para posibilitar el diagnóstico exacto y temprano de la enfermedad.
Existen métodos para detectar este patógeno los cuales incluyen técnicas
moleculares tales como, polimorfismo del largo de los
fragmentos de restricción
(RFLP), (Nilson et al., 2000), Hibridación in situ (Liu et al., 2001), y la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), (Toyama et al., 1994; Izumi and Wakabayashi, 1997;
Cepeda and Santos, 2000), las cuales son consideradas particularmente ventajosas
para la diferenciación en análisis epizootiológicos, además de ser capaces de detectar
bajas cantidades del patógeno.
Las técnicas inmunológicas incluyen, inmunofluorescencia la cual ha provisto
14
una efectiva detección del patógeno en improntas de bazo de peces enfermos. Sin
embargo, la absorción del antisuero de F. psychrophilum con células de F. columnare
puede ser necesaria para evitar reacciones cruzadas con este patógeno estrechamente
relacionado (Lorensen and Karas, 1992; Amita et al., 2000). También se encuentran
dentro de estas técnicas, el ensayo peroxidasa (Rangdale and Way, 1995; Aikawa,
1998), y el ensayo inmunosorbente acoplado a enzima
(ELISA), que tiene una
sensibilidad de 1x104 células por ml (Mata and Santos, 2001).
La prueba de ELISA es una aplicación básica usada para analizar antígenos
solubles (Hornbeck, 1991). Este técnica permite el procesamiento simultáneo de
muchas muestras. Asimismo es capaz de detectar y cuantificar sustancias tales como
péptidos, hormonas, proteínas y anticuerpos. El elemento crucial de la detección es la
interacción antígeno-anticuerpo, en donde se utilizan anticuerpos que pueden ser
policlonales o monoclonales. Ambos anticuerpos se obtienen a partir de
la
inmunización de animales de laboratorio con un antígeno específico. La diferencia entre
estos radica en que los anticuerpos policlonales se originan a partir de la síntesis de
numerosos clones de linfocitos B, y cada uno con diferente especificidad y sensibilidad
a epítopes del antígeno. En cambio, los anticuerpos monoclonales son generados a
través de la fusión de las células productoras de anticuerpos, linfocitos B y células de
mieloma para formar un hibridoma. Estos últimos a diferencia de los anticuerpos
policlonales, tienen la desventaja del tiempo y alto costo para producirlos y mantenerlos
(Lipman et al., 2005).
Actualmente se están utilizando nuevas tecnologías, como la de ADN
recombinante, para la producción de anticuerpos en menor tiempo y costo, sin perder la
capacidad de multiplicarse indefinidamente como tampoco la afinidad ni especificidad
15
frente a un antígeno específico. Una de las estrategias que tiene una gran aplicabilidad
es la metodología de “Phage display”.
El “Phage display” es el término universal que se utiliza para describir una
novedosa, poderosa y versátil técnica de bioselección in vitro en la cual un péptido o
proteína es fusionada genéticamente a una de las proteínas de superficie de un
bacteriófago o fago filamentoso (Smith,1985). Esta fusión resulta en el despliegue del
péptido o proteína en el exterior del fago mientras que el ADN que codifica para la
fusión reside dentro del mismo fago. Esta fusión da cuenta de la relativa sencillez de la
manipulación in vitro e in vivo de los fagos, permiten una rápida generación de
moléculas ligando desplegados en los fagos con altas afinidades de unión, a muy bajo
costo y en poco tiempo (Smith, 1985; Smith and Petrenko, 1997). Estas importantes
características ubican a esta tecnología por sobre otras técnicas para el desarrollo de
biomoléculas utilizadas en diagnóstico.
En los últimos años la tecnología de obtención de fragmentos de anticuerpos
expuestos en la superficie de fagos filamentosos se ha expandido rápidamente, y es
muy utilizada como alternativa para obtener estas moléculas en lugar de los anticuerpos
monoclonales. Esta tecnología, como se menciono anteriormente, explota la capacidad
de los fagos filamentosos de presentar en su superficie proteínas o fragmentos de las
mismas, fusionadas a proteínas de la cápside de la particula viral. La fusión no afecta la
integridad o propiedades biológicas del fago (por ejemplo, infectividad), y se produce un
acoplamiento entre los fagos portadores de la proteína de fusión y el gen codificante
para dicha proteína (Vispo, 2004).
Los fagos filamentosos principalmente estudiados son el fl, fd y M13, los cuales
comparten 98% de homología en su genoma. El fago M13 es el más comúnmente
16
utilizado en los procesos de “Phage display”. El ADN del fago se encuentra
empaquetado en un cilindro flexible de proteínas. Estas proteínas han sido
denominadas: proteína pVIII (proteína principal de la cápside del fago), las proteínas
pVII y pXI (con 5 copias en cada uno de los extremos del fago), y las proteínas pIII y
pVI (con 4 o 5 copias cada una expresadas en el otro extremo del fago). Estos fagos
necesitan de bacterias que expresen pili sexual, ya que la interacción de esta estructura
con la proteína menor de cubierta del fago permite el ingreso de este virus a la célula
bacteriana comenzando así la síntesis de los anticuerpos recombinantes (Lubrowski et
al., 1999; Nilsson et al., 2000). Posterior a los pasos de infección, replicación,
amplificación y purificación, las partículas de fagos son sometidas a un proceso de
bioselección o “biopannig” donde se prueba la afinidad de unión y reconocimiento de
los fagos hacia moléculas blanco.
El uso de anticuerpos recombinantes trae consigo varias ventajas como ser
generados económicamente, ya que grandes cantidades de ScFv son producidos en
sistemas bacterianos (Kipriyanov et al., 1997), como Escherichia coli (Fuchs et al.,
1991; Nilsson et al., 2000), son simples de aislar y no requieren procedimientos
complejos de plegamiento (Hashimoto et al., 1999; Sanchez et al., 1999), y por último,
la generación de ScFvs sirve para minimizar problemas asociados con la pérdida de
especificidad al antígeno debido al incorrecto plegamiento (Jager and Pluckthun, 1997),
ya que el reducido tamaño de un ScFv disminuye drásticamente el número de
conformaciones de potenciales anticuerpos.
En nuestro laboratorio contamos con anticuerpos recombinantes analizados
mediante ELISA e IFAT por Buttcovich (2005). Buttcovich, identificó 3 anticuerpos
recombinantes específicos para F. psychrophilum 68, 97 y 125. La utilización de estos
17
anticuerpos recombinantes con las técnicas inmunológicas mencionadas
mostraron
reproducibilidad, especificidad y menores costos que el empleo de técnicas
moleculares.
Aunque se han descrito en estudios tempranos el desarrollo de pruebas de
ELISA sandwich utilizando anticuerpos policlonales (Rangdale and Way, 1995;
Lorenzen and Olesen, 1997; Aikawa, 1998; Mata and Santos, 2001), a la fecha no se ha
desarrollado un test de ELISA sandwich utilizando anticuerpos recombinantes y
policlonales para detectar eficazmente al patógeno de peces F. psychrophilum con el
fin de lograr mayor objetividad, sensibilidad y especificidad.
18
HIPÓTESIS
Es posible detectar aislados chilenos de Flavobacterium
psychrophilum utilizando
anticuerpos policlonales y recombinantes por medio de un test de ELISA sandwich.
OBJETIVO GENERAL
Desarrollar un test de ELISA capaz de detectar aislados chilenos de Flavobacterium
psychrophilum.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Producir anticuerpos policlonales en conejos contra las proteínas de membrana y la
bacteria completa de F. psychrophilum.
- Caracterizar los anticuerpos policlonales producidos mediante Western blot,
Inmunohistoquímica e Inmunofluorescencia.
- Evaluar los anticuerpos recombinantes mediante Dot blot y ELISA.
- Desarrollar un test de ELISA sandwich que permita la identificación de
chilenos de F. psychrophilum en salmónidos.
aislados
19
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 MATERIALES
3.1.1 Reactivos
-Aceite de inmersión: Merck
-Ácido acético: Equilab
-Ácido clorhídrico: Merck
-Ácido sulfurico: Merck
-Acrilamida-Bisacrilamida: Winkler
-Agar Agar: Merck
-Agarosa: Winkler
-Albúmina de suero bovino: Sigma
-Anticuerpo anti IgG conejo: SAPU
-Anticuerpo anti IgG ratón: SAPU
-Anticuerpo anti IgG conejo, acoplado al fluoróforo Alexa Fluor 488: Molecular probes.
-Anticuerpo anti IgG conejo conjugado a peroxidasa: Dako.
-Azul de bromofenol: Sigma.
-Azul de Coomasie R-250: Bio-rad
-Bálsamo de Canadá: Winkler
-β-Mercaptoetanol: Merck
-Bromuro de etidio: Winkler
-Cloruro de sodio: Merck
-Cloruro de potasio: J.T. Baker
-Cloruro de calcio: Merck
20
-Coadjudante de Freund completo: Sigma
-Coadjudante de Freund incompleto: Sigma
-Di-sodio dihidrógeno fosfato dihidrato: Merck
-DAB: Sigma
-Etanol: Merck
-Extracto de levadura: BD (Becton, Dickinson and company)
-Fluorescent mounting medium: Dako.
-Glicerol: Merck
-Glicina: Winkler
-Glucosa: Merck
-Hematoxilina: Sigma
-Isopropanol: Merck
-Leche descremada: Calo
-Marcador de peso molecular rango amplio, preteñido: Winkler
-Metanol: Equilab
--PMSF: Sigma
-Perhidrol: Merck
-Persulfato de amonio: Gibco BRL
-Potasio dihidrógeno fosfato: Merck
-SDS: J.T. Baker
-Sulfato de magnesio: Merck
-Tampón Carbonato-Bicarbonato: Sigma
-Temed: Gibco BRL
-TMB-ELISA: Pierce
21
-Triptona: BD (Becton, Dickinson and company)
-Tris base: Winkler
-Triton x-100: Promega
-Tween-20: Sigma
-Xilol: Arquimed
3.1.2 Instrumentos
Agitador Gyro-Rocker Stuart Scientific
Balanza, MP-300 G Chyo
Cabina de flujo laminar Captair Cruma
Cámara de Bioseguridad clase II tipo A Factomet
Centrífuga refrigerada Heraeus Biofuge fresco.
Centrífuga Rotina 35R Hettich
Espectrofotómetro Spectronic Génesis 8
Filtros de 0,2 µm, Orange Scientific
Fuente de poder, Power PAC 1000, Biorad.
Incubador con agitación ZHWY-100B Zticheng
Lector de microplaca ELx800 Bio-Tek
Microscopio CH30RF200 Olympus optical
pHmetro Extech
Refrigerador incubador FOC 225E Velp Scientifica
Sistema de electroforesis Mini Protean II, BioRad
Sistema Mini protean II, BioRad.
Sistemas de transferencia Transblot Semy dry transfer cell, BioRad
22
Sonicador Microson Ultrasonic Cell Disruptor XL
Termocilador Gene amp PCR system 2400 Perkin Elmer
Vortex V-1 Boeco Germany
3.1.3 Cepas bacterianas
3.1.3.1 Cepas de Flavobacterium psychrophilum
Para la producción de anticuerpos policlonales en conejos, se utilizaron 2 cepas
de F. psychrophilum. Ambas cepas fueron confirmadas como F. psychrophilum por
serología y PCR. La cepa de campo se denominó 4605 y la cepa de referencia ATCC
49411, se denominó 1306. Ambas cepas fueron aisladas de riñón de alevín de trucha
arcoiris (Oncorhynchus mykiss) y proporcionadas por el Laboratorio de Biotecnología y
Patología Acuática del Instituto de Patología Animal.
Para las pruebas de inmunodetección, se utilizaron 9 aislados de F.
psychrophilum mantenidas en el Laboratorio de Biotecnología y Patología Acuática del
Instituto de Patología Animal. Estos aislados fueron confirmados por PCR por Figueroa
(2008). Estas cepas fueron obtenidas de pisciculturas ubicadas en distintas áreas del
sur de Chile. El órgano y hospedero desde donde se aislaron las muestras bacterianas,
se presentan en la tabla 3.
23
Tabla 3. Origen de los aislados de Flavobacterium psychrophilum
NÚMERO
UBICACIÓN
HOSPEDERO
PROCEDENCIA
14
Piel
Trucha
Estuario
15
Riñón
Trucha
Vertiente
16
Bazo
Trucha
Estuario
25
Riñón
Salmón del atlántico
Sin información
27
Riñón
Salmón del atlántico
Sin información
31
Riñón
Trucha
Estuario
40
Branquia
Salmón del atlántico
Piscicultura
41
Bazo
Trucha
Estuario
46
Riñón
Trucha
Vertiente
24
3.1.3.2 Cepa de Escherichia coli
Para la amplificación de los anticuerpos recombinantes 68, 97 y 125 se utilizó la
cepa de E. coli ER2537, comercialmente disponible en New England Biolabs, la cual es
una robusta cepa F+ con una rápida tasa de crecimiento y es especialmente adecuada
para la propagación del bacteriófago M13.
3.1.4 Oligonucleótidos
Se utilizaron partidores específicos para la reacción de amplificación del gen
ARN ribosomal 16S
de F. psychrophilum designados como PSY1 y PSY2, ambos
desarrollados por Toyama et al. (1994), los que amplifican un fragmento de 1.100bp
aproximadamente.
PSY1: 5’- CGATCCTACTTGCGTAG-3’ Forward
PSY2: 5’- GTTGGCATCAACACACT-3’ Reverse
3.1.5 Animales de experimentación
Para la producción de anticuerpos policlonales, se utilizaron 3 conejos adultos del
mismo sexo, los cuales fueron inyectados con proteínas de membrana extraídas de la
cepa 13-06 y 46-05 y con la bacteria completa de la cepa 1306. Los conejos fueron
mantenidos en un cuarto aislado del contacto con otros patógenos. Esto se llevó a cabo
por un período de 3 meses.
25
3.1.6 Anticuerpos
3.1.6.1 Anticuerpo anti-proteínas de membrana de F. psychrophilum
Este fue producido en el Laboratorio de Biotecnología y Patología Acuática de
acuerdo a procedimientos que se detallan en métodos.
3.1.6.2 Anticuerpo anti-F. psychrophilum completa
Este fue producido en el mismo Laboratorio de acuerdo a procedimientos que se
detallan en métodos.
3.1.6.3 Anticuerpo anti- M13
Este es un anticuerpo monoclonal anti-M13 pIII (isotipo IgG2a de ratón),
adquirido comercialmente de New England Biolab
3.1.6.4 Anticuerpo anti-F. psychrophilum
Este es un anticuerpo policlonal anti-F. psychrophilum hecho en conejo, donado
por el Dr. Hugo Folch del Instituto de Inmunología, Facultad de Medicina de la
Universidad Austral de Chile.
3.1.6.5 Anticuerpos recombinantes 68 - 97 - 125
Son
anticuerpos
recombinantes
caracterizados por Buttcovich (2005).
específicos
contra
F.
psychrophilum,
26
3.2 MÉTODOS
3.2.1 Cultivo de bacterias
3.2.1.1 Cultivo de F. psychrophilum
Las cepas de F. psychrophilum fueron mantenidas a – 80 ºC. Para su cultivo, se
descongelaron y resuspendieron en caldo TYES (triptona 0,4%, extracto de levadura
0,04%, MgSO4 0,05% y CaCl2 0,05%; pH 7,2), suplementado con ramnosa 0,5%. Estas
se incubaron durante 72 horas a 18ºC. Para la obtención de colonias aisladas estas
fueron sembradas en agar TYES (caldo TYES y agar 1,5%), suplementado con leche
0,25% y ramnosa 0,5% durante el mismo tiempo y temperatura. Se verificó su pureza
mediante tinción de Gram.
3.2.1.2 Cultivo de E. coli
La cepa de E. coli ER2537 también fue mantenida a – 80 ºC. Para su cultivo, se
descongeló y resuspendió en caldo LB (triptona 1%, extracto de levadura 0,5% y NaCl
0,5%; pH 7,4), y se incubó a 37ºC con agitación constante a 200 rpm durante toda la
noche. Para la obtención de colonias aisladas, las bacterias fueron sembradas en agar
mínimo M9 (Na2HPO4 1,2%, KH2PO4 0,6%, NaCl 0,1% NH4Cl 0,2%, agar 3%, glucosa
20%, MgSO4 1M, CaCl2 1M y tiamina 10mg/ml; pH 7,4), bajo las mismas condiciones
anteriores. Se verificó su pureza mediante tinción de Gram.
27
3.2.2 Extracción de ADN genómico
El ADN fue extraído de cepas y muestras de tejidos, usando el Kit “DNeasy Blood
and Tissue Kit” (Qiagen). Para tal efecto, en el caso de tejido, este sé resuspendió en
tampón fosfato salino 1X (PBS 1X: NaH2PO4 50 mM y NaCl 150 mM; pH 7,4), y se
homogenizó por vortex. Luego se procedió a centrifugar por 10 minutos a 5000 x g a
4ºC. En el caso de la suspensión bacteriana, este último paso se realizó de inmediato y
se siguió con el mismo procedimiento en ambos casos, como se indica a continuación.
El sobrenadante fue descartado y el sedimento bacteriano sé resuspendió en 180 µl de
tampón ATL y posteriormente se añadió 20 µl de proteinasa K. La mezcla se agitó en
vortex y se incubó por 1 hora a 56ºC hasta la lisis total. Ocasionalmente se mezcló con
vortex durante la incubación para dispersar la muestra. Luego se mezcló por inversión
unas 10 veces. Se añadió 200µl de tampón AL a la muestra y se mezcló con vortex.
Luego se añadieron 200µl de etanol absoluto y se mezcló nuevamente con vortex. La
mezcla se transfirió a una columna de Mini spin Dneasy (aportadas por el kit), contenida
en un tubo colector de 2ml y se centrifugó a 6000 x g por 1 min. El filtrado fue
descartado. La columna de Mini spin fue puesta en un nuevo tubo colector de 2ml y el
ADN contenido en la matriz se lavó con 500µl de tampón AW1 y AW2 respectivamente.
En cada caso se centrifugó a 6000 x g por 1 min. Finalmente, la columna de mini spin
Dneasy se colocó en un tubo eppendorf de 1,5ml y se agregó 200µl de tampón AE
directamente a la membrana. Se incubó a temperatura ambiente por 1 min. y se
centrifugó a 6000 x g por 1 min. para eluir el ADN.
El ADN obtenido, se almacenó a
-20ºC hasta el momento de su utilización en las reacciones de PCR.
28
3.2.3 Cuantificación de ADN
Para determinar la concentración estimada de ADN, se midió la absorbancia a
una longitud de onda de 260nm por espectrofotometría. La pureza del ADN fue
determinada mediante la razón de los valores de absorbancia medidos a 260nm y
280nm (A260/A280). Una preparación pura de ADN tiene un valor de 1,8. La
concentración de las muestras se calculó usando la relación en donde 1 unidad de
absorbancia es igual a 50µg/ml para ADN de doble hebra (Sambrook et al., 1989).
3.2.4 Reacción de PCR para la identificación de F. psychrophilum
La identificación de F. psychrophilum se realizó siguiendo el protocolo de rutina
descrito en el Laboratorio de Biotecnología y Patología Acuática y según lo descrito por
Toyama et al. (1994).
La reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen final de 25µl utilizando:
12.3µl de agua ultra pura,
5 µl de GreenBuffer (Promega) PCR 5x, 3µl MgCl2
(Promega) 25 Mm, 1µl dNTPs 10Mm c/u, 0.5µl primer PSY1 50 pmoles/µl, 0.5µl primer
PSY2 50 pmoles/µl, 0.2µl GoTaq polimerasa (Promega) 5U/µl, y 2.5µl DNA templado
100ng aproximadamente. La reacción de amplificación consistió en una denaturación
inicial a 94ºC por 5 minutos; 30 ciclos, denaturación a 94º C por
2 minutos,
apareamiento a 45ºC por 1 minuto y medio, extensión a 72ºC por 2 minutos y extensión
final a 72º C por 5 minutos. Los fragmentos obtenidos fueron visualizados en un gel de
agarosa al 1%, con tinción de Bromuro de etidio y exposición a la luz UV 254 nm.
29
3.2.5 Extracción de proteínas de membrana
El aislamiento de proteínas de la superficie de F. psychrophilum se realizó según
lo descrito por Massias et al. (2004) con algunas modificaciones. Una vez que el cultivo
de bacterias alcanzó una A600: 0.6, 100ml
de cultivo fueron cosechado por
centrifugación a 6000 x g por 10min a 4ºC. Las células cosechadas fueron lavadas dos
veces con tampón fosfato salino (PBS1X), y posteriormente, el sedimento bacteriano
fue resuspendido en 10ml de Tris-HCl 0,0625 M, pH 6,8 en presencia de 0.4Mm de
PMSF y sonicados (Sonicador Microson Ultrasonic Cell Disruptor XL), en hielo (80watt),
por 2min. a intervalos de 20seg, con 40 seg. de enfriamiento entre los intervalos. El
sonicado crudo se examinó por microscopia para determinar si la lisis celular ocurrió
durante este tratamiento. Posteriormente el sonicado fue centrifugado por 6000 x g por
20min a 4ºC. El sobrenadante fue centrifugado a 16.000 x g por 35 min. a 4ºC. El
sedimento de esta centrifugación se resuspendió en 100µl de Tris-HCl 0,0625 M, pH
6,8. Esta fracción insoluble o de membrana fue almacenada a –20ºC hasta su
utilización.
3.2.6 Preparado de células lisadas de F. psychrophilum
El cultivo bacteriano, en la etapa de crecimiento exponencial, fue centrifugado a
6000 x g por 10min a 4ºC. Las células cosechadas fueron resuspendidas en Tris-HCl
0,0625 M, pH 6,8 en presencia de 0.4Mm de PMSF y sonicadas en hielo, como se
indicó anteriormente. Luego fueron centrifugadas a 3000 x g por 5min para remover las
células intactas. El lisado celular fue almacenado a –20ºC.
30
3.2.7 Cuantificación de proteínas
Basado en el método de Bradford (Bradford et al, 1976), se fabricó una curva de
calibración de 4 a 20 µg de proteínas por ml de reactivo, utilizando BSA en agua
destilada como estándar. La lectura se realizó después de 10 min. en un
espectrofotómetro (Spectronic, Génesis 8), a una longitud de onda de 595 nm.
Para determinar la concentración de proteínas de las muestras, se realizaron
diluciones determinadas y luego se les agregó el reactivo; Las muestras se incubaron
por 10 min. a temperatura ambiente. La absorbancia fue leída a la misma longitud de
onda y su valor fue interpolado en la curva de calibración.
Todas las lecturas se realizaron contra su respectivo blanco, en este caso se
utilizó agua destilada, (que también se usó para las diluciones de las muestras), con el
reactivo de Bradford.
3.2.8 Producción de anticuerpos policlonales anti- F. psychrophilum
Se generaron anticuerpos policlonales contra proteínas de membrana y bacteria
completa de F. psychrophilum de la cepa 1306 y 4605. Para esto se utilizaron 3
conejos, los que fueron inmunizados por vía subcutánea en el lomo.
Se realizaron sangrías periódicas para evaluar el título de los anticuerpos séricos
mediante immunodetección en gota (Dot Blot). El proceso tardó 3 meses.
La primera inyección consistió de 0,5mg de antígeno disuelto en 0,5ml de
solución salina (PBS 1X), y emulsionada con 0,5ml de coadyuvante completo de
Freund. Las tres inyecciones suplementarias se efectuaron después de tres semanas,
luego de la primera inmunización con intervalos de tres semanas entre cada una de
31
ellas. Todas se realizaron con 0,5mg de antígeno disuelto en 0,5ml de solución salina y
emulsionada con 0,5ml de coadyuvante incompleto de Freund. Antes de comenzar la
inmunización se obtuvo el suero para el control preinmune y entre cada período de
inyección se realizaron sangrías para obtener el suero inmune a modo de control.
Al finalizar el período de inmunización se colectó la sangre de los 3 conejos en
tubos Falcon y se dejo por 3 horas a 37ºC para que coagule, luego se desprendió el
coagulo y el suero obtenido se centrifugó por 5 min. a 3000 rpm, obteniéndose así un
suero libre de células. Este fue alicuotado y almacenado a -20ºC.
3.2.9 Electroforesis en geles de poliacrilamida
Se prepararon geles con el sistema de tampón discontinuo en condiciones
denaturantes al 12%, de acuerdo al procedimiento descrito por Laemmli (1970).
El gel separador se preparó con acrilamida-bisacrilamida 30% (p/v) 0,8% (p/v) a
una concentración final de 12% (p/v), tamponado con Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8 y SDS
10 %. El gel espaciador, en cambio se preparó a una concentración final de 4% (p/v)
tamponado con Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 y SDS 10%. Ambos fueron polimerizados con
persulfato de amonio 10% (p/v), y TEMED 0,15% (p/v), de concentración final. Las
muestras con tampón de muestra y con un 5% (v/v), de β-mercaptoetanol fueron
denaturadas calentándolas por 10 min. en agua a 90ºC, para luego ser cargadas
cuidadosamente en los surcos del gel. Al sistema ya montado e inmerso en tampón de
corrida 1X (25mM Tris, 192mM glicina y 0,1% SDS, pH 8,3), se aplicó aproximadamente
una corriente de 80 volt hasta que el indicador del frente iónico llegó al borde inferior del
gel. Finalizada la electroforesis, el gel se fijó durante 1 h., luego se tiñó en solución de
32
teñido por 12 h. Finalmente el gel se destiñó mediante repetidos lavados con una
solución de desteñido (30% metanol y 10% ácido acético), hasta que el gel quedara
completamente claro y sólo se apreciaran las bandas teñidas. Todas estas etapas se
llevaron a cabo con agitación suave y constante en una plataforma rotatoria.
3.2.10 Western Blot
Primero se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% en
condiciones denaturantes, de las proteínas de membrana y lisado celular de las
distintas cepas de F. psychrophilum, cargando determinadas concentraciones de
proteínas por carril, detalladas en cada experimento. Luego de realizada la corrida
electroforética, los geles fueron electrotransferidos a una membrana de nitrocelulosa en
tampón de transferencia (48mM Tris, 30mM glicina, 20% metanol y 0,375% SDS), se
transfirió como mínimo 6 horas a 70 mA. Se tomó la membrana ya transferida y se
procedió a bloquear los sitios libres con solución de bloqueo (Tris-HCl 20mM, NaCl
150mM y leche descremada 5%). Luego se incubó con el primer anticuerpo
dependiendo del experimento, a la dilución indicada en cada figura, con una incubación
mínima de 6 horas, luego se realizaron 3 lavados con TBS 1X (Tris-HCl 20mM y NaCl
150mM), cada uno de 10 minutos con agitación suave. Se incubó con el segundo
anticuerpo anti-IgG de conejo unido a biotina a una dilución 1:2000 por 2 hora. Luego se
realizaron 3 lavados con TBS 1X, cada uno de 10 minutos con agitación suave.
Posteriormente se incubó con estreptavidina-peroxidasa a una dilución de 1:1000 por 1
hora. Luego se realizaron 3 lavados con TBS 1X, cada uno de 10 minutos con agitación
suave. Luego se realizaron nuevamente 3 lavados con TBS 1X, cada uno de 10 minutos
con agitación suave. Para el revelado de la membrana, se incubó con solución de
33
revelado (9ml de PBS, 1ml DAB 10mg/ml y 50µl de H2O2), por 5 minutos. La reacción
se detuvo sumergiendo la membrana en agua.
3.2.11 Ensayos de Dot Blot
Cada una de las muestras de proteínas de membrana y totales de cada cepa se
aplicaron en cada casillero en forma de spot, se secó la nitrocelulosa y luego se incubó
por 1 hora con tampón de bloqueo seguido de una incubación con el primer anticuerpo
toda la noche (anticuerpo policlonal o recombinante según corresponda), diluido en
tampón de bloqueo. En el caso de tratar con el anticuerpo policlonal, se incubó con el
segundo anticuerpo anti-IgG de conejo unido a biotina a una dilución 1:2000 por 2
horas. Se lavó tres veces por 10 minutos con TBS1X. Posteriormente se incubó con
estreptavidina-peroxidasa a una dilución de 1:1000 por 1 hora. Se lavó tres veces por
10 minutos con TBS1X. En el caso de tratar con el anticuerpo recombinante, se incubó
con el segundo anticuerpo anti-M13 de ratón a una dilución 1:1000 por 6 horas. Se lavó
tres veces por 10 minutos con TBS1X. Posteriormente se incubó con el tercer
anticuerpo anti-IgG de ratón unido a biotina a una dilución de 1:1000 por 2 horas. Se
lavó tres veces por 10 minutos con TBS1X. Posteriormente se incubó con
estreptavidina-peroxidasa a una dilución de 1:1000 por 1 hora. En ambos casos se
reveló con solución de revelado durante 5 minutos, y se detuvo con agua destilada.
34
3.2.12 Inmunohistoquímica
Se realizaron extendidos de cultivo puros e improntas de diferentes órganos de
truchas arcoiris para este ensayo. Solo las improntas se trataron con una mezcla de
metanol 100% (v/v), perhidrol 3% (v/v), durante 10 min. para inactivar las peroxidas
endógenas. Seguidamente, se lavó 3 veces durante 5 min. con PBS 1X. Posteriormente
para extendidos de cultivos e improntas, en una cámara húmeda, se cubrieron con una
solución de bloqueo (PBS 1X, Albúmina 1%, tritón X-100 0,3% y Leche descremada
5%), por 30 min. Con esto se bloquearon los posibles sitios de unión inespecífica del
anticuerpo. Luego se lavó 2 veces durante 10 min. con PBS 1X y se incubó con el
primer anticuerpo policlonal diluido en solución de bloqueo durante toda la noche. Se
lavó 3 veces durante 10 min. con PBS 1X. Se incubó con un segundo anticuerpo antiinmunoglobulina de conejo (DAKO), durante 20 minutos, se lavó 3 veces durante 5 min.
en PBS 1X. Luego se continuó con la incubación de estreptavidina-peroxidasa (DAKO),
durante 20 min; se lavó 3 veces durante 5 min. en PBS 1X. Para revelar se adicionó la
solución de revelado (40ml de PBS1X, 2ml de DAB 10mg/ml y 30µl de H2O2), por 10
min. en oscuridad, agregando 15 µl más de perhidrol a los 5 minutos de comenzado el
revelado. Se lavó 3 veces durante 5 min. con PBS 1X. Se realizó tinción de contraste
utilizando hematoxilina y tetraborato de sodio. Finalmente solo las improntas se
deshidrataron con una batería de xilol y alcoholes en gradiente descendente (100%,
90%,
80%, 70% y 50% v/v). Ambos, extendidos de cultivo puros e improntas, se
montaron con bálsamo de Canadá.
35
3.2.13 Inmunofluorescencia
Muestras de extendido de cultivo e improntas fueron fijadas con metanol absoluto
por 5 min a –20ºC. Posteriormente se realizó el bloqueo con el mismo tampón indicado
anteriormente, durante 30 minutos. Se agregó el primer anticuerpo policlonal diluido en
tampón de bloqueo y se incubó toda la noche en una cámara húmeda. Después de 3
lavados con PBS 1X, cada uno de 5 minutos, se incubó con el segundo anticuerpo anticonejo acoplado al fluoróforo Alexa Fluor 488 a una dilución de 1:200, por 1 hora. Luego
se lavó 3 veces con PBS 1X y se montó con un medio especial para fluorescencia
fabricado por DAKO.
3.2.14 Evaluación de fagos activos
Para evaluar si el fago M13 recombiante se encontraba activo, se cultivó E. coli
ER2537 en 10 ml de medió LB a 37ºC con agitación constante toda la noche.
Posteriormente en una placa de agar LB se agregó una mezcla que contenía agar
blando (contiene la mitad de agar agar que el agar LB original), y E. coli ER2537. Una
vez que la placa se enfrió se agregó una alícuota de fago recombínate (68, 97 y 125), y
de incubó a 37ºC toda la noche. La presencia de un halo de inhibición en la placa de
agar LB indicó que el fago lisó la bacteria y con esto se comprobó que el fago se
encontraba activo.
3.2.15 Amplificación y concentración de fagos
Se incubó una colonia de E. coli ER2537, en 10ml de medio LB toda la noche a
37ºC en agitación constante a 200rpm. Este cultivo fue diluido a una razón de 1:100 en
un nuevo medio LB y se incubó a 37ºC en agitación constante a 200rpm hasta obtener
36
una D.O600nm entre 0,3 y 0,5. Este cultivo se alicuotó de a 20ml y posteriormente se
agregó 20µl de cada clon positivo para F. psychrophilum incubándose a 37ºC por 4
horas en agitación a 200rpm. Luego cada uno de los cultivos fue trasladado a tubos
falcon de 50ml estériles y se centrifugaron a 10.000 rpm a 4ºC por 15 minutos. El
sobrenandante fue transferido a un nuevo tubo falcon de 50ml estéril, y se agregó 3,3ml
de PEG-NaCl estéril, se incubó a 4ºC toda la noche, para precipitar los fagos.
Posteriormente se centrifugaron a 10.000rpm a 4ºC por 15 minutos. Se descartó el
sobrenadante y el sedimento se resuspendió en 1ml de TBS 1X pH 7,4 estéril. Esta
suspensión se transfirió a un tubo eppendorf de 1,5 ml estéril y se agrego 1/6 de PEGNaCl estéril para posteriormente ser incubado por 1 hora en hielo. Transcurrido el
tiempo de incubación, se centrifugó por 10 minutos a 10.000 rpm a 4ºC. Se descartó el
sobrenadante. El sedimento fue resuspendido en 200µl de TBS 1X y se centrifugo a 4ºC
por 1 minuto a 13.000rpm, para sedimentar cualquier material insoluble. El
sobrenadante fue transferido a un nuevo tubo eppendorf de 1,5ml y se agrego 200µl de
glicerol 80% estéril. Este fue almacenado a -20ºC.
3.2.16 ELISA sandwich
Se activó una placa de ELISA poly-sorpTM surface (Nalge Nunc international),
con 100µl de los anticuerpos recombinantes previamente diluidos en tampón carbonatobicarbonato 0.05 M pH 9.6 a un título de 1:10. Se dejó activando toda la noche a 4ºC.
Se eliminó la solución de activación y se bloqueó por 2horas a 37ºC con 200µl de
solución de bloqueo (PBS 1X y 1% BSA). Se eliminó la solución de bloqueo y se lavó 3
veces con 200 µl de solución de lavado (PBS 1X y 0,05% Tween 20). Se prepararon
diluciones del antígeno en solución de bloqueo y se incubó por 1 hora a 37ºC. Se
37
eliminó el antígeno y se lavó 3 veces con 200µl de solución de lavado. Posteriormente
se incubó con el primer anticuerpo anti-proteínas de membrana 1306 1/15000 por 1
hora a 37ºC. Se eliminó el anticuerpo y se lavó 3 veces con 200µl de solución de
lavado. Luego se incubó con un segundo anticuerpo anti-conejo conjugado a
peroxidasa 1/5000 por 1 hora a 37ºC. Se eliminó el anticuerpo y se lavó 3 veces con
200µl de solución de lavado. Finalmente se reveló agregando 100µl de TMB hasta un
tiempo máximo de 30 minutos. La reacción se detuvo adicionando 100µl de H2SO4 5N.
La lectura se efectuó a 450nm. El valor final de absorbancia para cada muestra, se
determinó al restar el valor del pocillo control al del pocillo con el antígeno.
3.3 Análisis estadístico
Los análisis de la prueba de ELISA sándwich se llevaron a cabo con el programa
Microsoft Excel. Los datos se presentaron como promedio más menos error estándar.
Según el método recomendado por Brunell et al. (1983) se determinó el punto de
corte. Para ello se calculó el promedio más 3 desviaciones estándar, los valores sobre
este punto fueron clasificados como positivos y bajo este valor como negativos.
38
4. RESULTADOS
4.1 Caracterización de las cepas de F. psychrophilum
Se utilizaron dos cepas de trabajo, una cepa de referencia 1306 y una cepa de
campo 4605. Ambas cepas fueron cultivadas en agar TYES a 18ºC por 3 días,
presentando las características colonias circulares, convexas, brillantes de color
amarillo claro, como se observa en la Figura 1A. La pureza de cada cultivo se verificó
por tinción de Gram en donde se pudo observar los típicos bacilos filamentosos Gram
negativos (Figura 1B).
4.1.1 Identificación de F. psychrophilum mediante PCR
Asimismo ambas cepas fueron confirmadas mediante PCR utilizando partidores
PSY1 y PSY2 específicos que amplifican el gen ribosomal 16S.
Como resultado se obtuvo un fragmento de 1.100 pb aproximadamente
correspondiente a la amplificación parcial del gen ribosomal 16S de F. psychrophilum
como se muestra en la Figura 2. El tamaño de este fragmento fue similar para todos los
aislados utilizados en este estudio (14,15,16,25,27,31,40,41 y 46), los cuales fueron
caracterizados mediante técnicas moleculares (PCR y RFLP), por Figueroa (2008).
39
A
B
100X
Figura 1. Características morfológicas de Flavobacterium psychrophilum. En A
se muestran las colonias amarillas en agar TYES de
F. psychrophilum. En B se
muestra los bacilos filamentosos delgados y curvos, Gram-negativos de F.
psychrophilum. Imagen tomada a 100X.
40
A
pb
1.100
1.500
1.000
500
1
2
B
3
4
pb
1.100
1
2
3
4
1.500
1.000
500
Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa al 1% del producto de PCR específico
del gen 16S rRNA de Flavobacterium psychrophilum. En la figura se observa un
producto amplificado de 1.100pb lo cual se obtiene para ambas cepas de F.
psychrophilum en A para la cepa de referencia 1306 y en B para la cepa de campo
4605. Carril 1: estándar de peso molecular de 100pb; carril 2: cepa de F. psychrophilum,
carril 3: control positivo y carril 4: control negativo.
41
4.2 Producción de anticuerpos policlonales anti-F. psychrophilum
4.2.1 Extracción de proteínas de membrana de F. psychrophilum
Para la producción de anticuerpos policlonales primero se procedió a extraer las
proteínas de membrana de las cepas 1306 y 4605 tal como se describió en materiales y
métodos. Las proteínas fueron cuantificadas por el método de Bradford y
posteriormente fueron resueltas en un gel de poliacrilamida en condiciones
denaturantes al 12% teñido con azul de Coomassie.
En la Figura 3 se observa el patrón de bandas correspondientes a proteínas
totales y de membrana de F. psychrophilum, en A para la cepa 1306 y en B para la
cepa 4605, evidenciándose proteínas que van desde los 18 hasta por sobre los 120
Kda.
El patrón electroforético de proteínas totales y de membrana de ambas cepas de
F. psychrophilum son similares y sólo se observan algunas diferencias en cuanto a
intensidad y presencia/ausencia de bandas como se indica en la Figura 3 en A y B
(flechas). Por ejemplo al comparar el patrón de las proteínas totales del carril 2 de la
Figura 3A y 3B, se puede observar en la Figura 3A una banda muy intensa a los 27 kDa
para las proteínas totales de la cepa 1306 no así para la cepa 4605. Asimismo si
comparamos las proteínas de membrana del carril 3 de la Figura 3A y 3B se puede
observar en esta última, una banda más intensa a los 49kDa para la cepa 4605 que
para la cepa 1306.
Una vez obtenidas las proteínas de membrana estas fueron almacenadas a
-20°C para posteriormente ser inoculadas en conejos y así producir anticuerpos
policlonales, tal como se detalló en materiales y métodos.
42
A
kDa
117
85
1
PT
B
PM
kDa
1
PT
PM
117
85
49
49
34
34
25
25
19
19
Figura 3. Electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% de proteínas totales y de
membrana
de Flavobacterium psychrophilum. Perfil electroforético de proteínas
totales y de membrana en A para la cepa 1306 y en B para la cepa 4605. Carril 1:
estándar preteñido de proteínas de 18-120 kDa, PT: proteínas totales (10µg) y PM:
proteínas de membrana (10µg).
43
4.2.2 Titulación de los anticuerpos policlonales anti-F. psychrophilum producidos
en conejo
El título de los anticuerpos se determinó por el método de dot blot. Se
adicionaron 6µg de proteínas constante a una membrana de nitrocelulosa pierce de
0.45 µm.
En la figura 4 se observa una clara diferencia en la intensidad de reacción entre
los anticuerpos anti-proteínas de membrana y los anticuerpos anti-bacteria completa
conforme van aumentando las diluciones de los anticuerpos, siendo más conservada
para las proteínas de membrana. Adicionalmente a un título de 1:50.000 sólo los
anticuerpos anti-proteínas de membrana son capaces de reconocer eficientemente las
proteínas de F. psychrophilum. Como controles negativos de la prueba se adicionaron
los sueros preinmunes de cada uno de los conejos, BSA y proteínas totales de hipófisis
de Salmo salar, donde no se observó reacción.
4.2.3 Determinación del límite de detección de antígenos utilizando anticuerpos
policlonales contra F. psychrophilum
Una vez determinado el título óptimo de los anticuerpos (1:50.000), se analizó la
cantidad mínima de proteínas de F. psychrophilum que el anticuerpo podía detectar.
En la Figura 5 se puede observar que los anticuerpos anti-bacteria completa solo
fueron capaces de detectar hasta 2 µg de los antígenos, a partir de los cuales fueron
generados. Sin embargo, los anticuerpos anti-proteínas de membrana fueron más
eficientes al detectar hasta 0,5 µg, mostrando tener mayor sensibilidad en este ensayo.
Por ende, los anticuerpos policlonales anti-proteínas de membrana serán utilizados para
los siguientes ensayos.
44
A
PM 4605
B
PM 1306
PT 1306
C
1:1000 1:3000 1:5000 1:10.000 1:15.000 1:30.000
1:50.000
SCP
BSA
PT-Ss
Controles negativos
Figura 4. Titulación de los anticuerpos policlonales contra Flavobacterium
psychrophilum mediante Dot blot. Se utilizaron distintas diluciones de los anticuerpos
cuyo título se determinó mediante dot blot. A, B y C corresponden a los ensayos
realizados utilizando los anticuerpos anti-proteínas de membrana (cepa 4605); antiproteínas de membrana (cepa 1306) y anticuerpo anti-bacteria completa (cepa 1306)
respectivamente. Como control negativo se utilizó el suero control preinmune (SCP),
BSA y proteínas totales de hipófisis de Salmo salar (PT-Ss).
45
µg de proteína
0,5
1
2
5
10
A
PM 1306
B
PM 4605
C
PT 1306
Figura 5. Análisis del límite de detección de proteínas utilizando anticuerpos
contra Flavobacterium psychrophilum mediante Dot blot. A, B y C corresponden a
los ensayos realizados utilizando los anticuerpos anti-proteínas de membrana (cepa
1306); anti-proteínas de membrana (cepa 4605) y anticuerpo anti-proteínas totales
(cepa 1306) respectivamente. Como control negativo se utilizó BSA y proteínas de
hipófisis de Salmo salar donde no se observó inmunoreacción.
46
4.3 Caracterización de los anticuerpos policlonales anti-proteínas de membrana
de F. psychrophilum
4.3.1 Análisis de los patrones de proteínas inmunoreactivas de F. psychrophilum
Las inmunoreacciones tanto de las proteínas de membrana como de las
proteínas totales de este patógeno, fueron analizadas mediante Western blot utilizando
los anticuerpos policlonales, hechos en conejos, específicos para las proteínas de
membrana de F. psychrophilum. Los anticuerpos anti-proteína de membrana 1306 y
4605 se utilizaron a una dilución de 1:50.000, en presencia de 5µg de proteínas totales
y de membrana de F. psychrophilum.
En la figura 6A y 6B se observan los distintos patrones de bandas
inmunoreactivas generados al utilizar los anticuerpos anti-proteína de membrana 4605
y 1306, respectivamente. Estos anticuerpos mostraron una fuerte inmunoreacción con
al menos 2 proteínas de membrana presentes en la cepa 4605 de 40 y 55kDa.
Asimismo estos anticuerpos también detectaron una proteína de 55kDa en la cepa 1306
presente en los extractos proteicos totales y de membrana. Sin embargo, también se
pudo detectar diferencias en cuanto a las proteínas antigénicas presentes en ambas
cepas. Los anticuerpos anti-PM1306 detectaron una proteína de alrededor de 88kDa en
la cepa 1306 tanto en extractos proteicos como de membrana. Al contrario, esta
proteína no fue detectada por los anticuerpos anti-PM4605. Estos anticuerpos además
detectaron en forma diferencial algunas proteínas de bajo peso molecular. Es así como
se pudo observar la presencia de una proteína de 19kDa en el extracto proteico de
membrana de la cepa 1306 y la cepa 4605 las cuales no fueron detectadas con el antiPM4605.
47
A
B
1
2
3
E
1
2
3 E
kDa
117
85
49
34
25
19
anti-PM 4605
anti-PM 1306
Figura 6. Análisis de Western blot de los patrones de proteínas inmunoreactivas.
A y B análisis de las proteínas de F. psychrophilum utilizando anticuerpos anti-proteínas
de membrana de la cepa 4605 y 1306 respectivamente. En A y B Carril 1: proteínas
totales de la cepa 1306; Carril 2: Proteínas de membrana de la cepa 1306; Carril 3:
proteínas de membrana de la cepa 4605 y carril E: estándar preteñido de proteínas. En
cada carril se cargaron 5 µg de proteínas. Los anticuerpos se utilizaron a una dilución
de 1:50.000.
48
4.3.2 Análisis de la reacción cruzada de los anticuerpos policlonales contra F.
psychrophilum en órganos de Salmo salar y bacterias patógenas de peces
Mediante análisis de Western blot se evaluó si los anticuerpos eran capaces de
reaccionar con proteínas de órganos de peces y bacterias de importancia para la
salmonicultura. Para esto se utilizo una dilución de 1:50.000 de los anticuerpos antiproteínas de membrana. En todos los análisis se utilizó como control positivo las
proteínas de membrana (5µg) de la cepa 4605 y 1306.
Para evaluar la reacción cruzada de los anticuerpos policlonales con proteínas de
órganos de Salmo salar, se cargaron 10 µg de proteínas. En este caso se puede
observar, en la Figura 7, que sólo 1 a 2 proteínas inmunoreactivas de gónada, hígado y
corazón reaccionaron con los anticuerpos anti-PM 4605 y anti-PM1306.
El análisis de la reacción cruzada con proteínas de patógenos de importancia se
realizó cargando 2 µg de proteínas. Como se observa en la figura 8 no hubo reacción
cruzada con ninguna de las proteínas de bacterias incluyendo las bacterias de su
misma familia como F. maritimus y F. columnare.
49
A
1 2
3 4
5
4605
7 8
9 10
anti-PM 4605
B
1 2
3 4
5
1306
7
8
9 10
anti-PM 1306
Figura 7. Análisis de Western blot de la reacción cruzada de los anticuerpos
contra Flavobacterium psychrophilum con proteínas de órganos de Salmo salar.
A y B corresponden al análisis de proteínas de órganos de S. salar con los anticuerpos
anti-proteínas de membrana 4605 y 1306 respectivamente. Carril 1: gónada, carril 2:
corazón, carril 3: riñón, carril 4: bazo, carril 5: ciegos pilóricos, carril 7: hígado, carril 8:
músculo, carril 9: branquias y carril 10: cerebro. El carril 6 corresponde a las proteínas
de membrana de F. psychrophilum (5 µg) de las cepas 4605 y 1306, respectivamente.
50
A
1 2 3
4
5
4605
7 8
9 10
B
1 2 3 4
5
anti-PM 4605
1306
7
8 9
10
anti-PM 1306
Figura 8. Análisis de Western blot de la reacción cruzada de los anticuerpos
contra Flavobacterium psychrophilum con proteínas de bacterias patógenas de
peces. A y B corresponden al análisis de proteínas de bacterias patógenas de peces
con los anticuerpos anti-proteínas de membrana 4605 y 1306. Carril 1: Piscirickettsia
salmonis, carril 2: Escherichia coli, carril 3: Flexibacter maritimus, carril 4: Aeromonas
hidrophila, carril 5: Aeromonas salmonicida, carril 7: Vibrio ordalii, carril 8:
Flavobacterium columnare, carril 9: Bacillus cereus y carril 10: Renibacterium
salmoninarum. El carril 6 corresponde a las proteínas de membrana de F.
psychrophilum (5 µg) de las cepas 4605 y 1306, respectivamente.
51
4.3.3 Inmunodetección de proteínas totales de distintos aislados de F.
psychrophilum
Previó a los ensayos de inmunodetección, se realizó una electroforesis en gel de
poliacrilamida en condiciones denaturantes al 12% de las proteínas totales de los
aislados de F. psychrophilum.
En la figura 9 se pueden apreciar los perfiles electroforéticos de las proteínas
totales de 9 cepas de campo, evidenciándose una serie de bandas de distintos tamaños
teñidas con azul de Coomassie, junto al estándar de peso molecular (carril E).
Posteriormente se evaluó mediante análisis de Western blot si los anticuerpos
contra proteínas de membrana de F. psychrophilum eran capaces de reconocer
proteínas de los distintos aislados de este patógeno. Para ello se cargaron 5µg de
proteínas totales de los 9 aislados previamente caracterizados mediante sus
características morfologías (Gram) y genotipificar usando técnicas moleculares como
PCR y RFLP (Figueroa, 2008).
Los anticuerpos anti-proteínas de membrana 1306 y 4605 se utilizaron a una
dilución de 1:50.000, tal como se usaron en ensayos anteriores. Como controles
positivos se utilizaron 5µg de proteínas de membrana de las cepas 4605 y 1306.
En la Figura 10A, se observa que al tratar con los anticuerpos anti proteínas de
membrana 4605 se identifican en todos los aislados bandas de 40 y 55 Kda las cuales
varían en intensidad al comparar con el control positivo. Asimismo la mayoría de los
aislados presentaron patrones inmunoreactivos por sobre los 80 kDa. Por otra parte
sólo los aislados 14, 15 16 y 25 presentaron bandas bajo los 25 Kda.
En la Figura 10B se observa el mismo patrón que en A en cuanto a las bandas
que se encuentran a los 40 y 55 kDa, siendo más intensas al tratar con el anticuerpo
52
anti proteínas de membrana 1306. Asimismo se observa que la mayoría de los aislados
presentan bandas inmunorreactivas por sobre los 80kDa pero en menor intensidad.
Además sólo los aislados 14, 27, 31, 40, 41 y 46 presentaron una banda muy
características a los 19Kda aproximadamente.
53
kDa
14
15
16
25 27
E
31
40
41
46
117
85
49
34
25
19
Figura 9. Electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% de proteínas totales de
aislados de Flavobacterium psychrophilum. Perfil electroforético de proteínas totales
de los aislados 14, 15, 16, 25, 27, 31, 40, 41 y 46. Se cargaron 10µg de proteínas
totales en cada carril. Carril E: estándar preteñido de proteínas de 18-120 kDa.
54
A
kDa
14 15 16 25
4605
27 31 40 41 46
117
85
49
34
25
19
B
kDa
14 15 16 25
1306
27 31 40 41 46
117
85
49
34
25
19
Figura 10. Análisis de Western blot de la reacción de los anticuerpos policlonales
contra proteínas totales de distintos aislados de Flavobacterium psychrophilum.
A y B, patrones de proteínas inmunoreactivas de distintos aislados de F. psychrophilum
utilizando los anticuerpos anti-proteínas de membrana 4605 y 1306 respectivamente.
Cada carril indica el aislado de F. psychrophilum utilizado, los que fueron confirmados
mediante Gram y PCR (Figueroa, 2008). Como controles positivos se utilizaron
proteínas de membrana de las cepas 4605 y 1306 respectivamente.
55
4.3.4 Identificación de F. psychrophilum en peces infectados naturalmente con
este patógeno
F. psychrophilum fue detectado en truchas arcoiris (O. mikyss) infectadas
naturalmente. Para ello se realizaron improntas tomando muestras de lesión externa en
la zona del pedúnculo y de lesión interna de bazo para confirmar mediante aislamiento
en agar TYES, tinción de Gram y PCR la presencia del patógeno.
En la Figura 11A se observa una impronta de la zona del pedúnculo donde se ve
la presencia de bacilos largos filamentosos Gram negativos. Lo mismo se observa en la
Figura 11B en una impronta de bazo del mismo pez infectado.
En la Figura 11C se muestra una confirmación de la presencia del patógeno en el
pez mediante tinción de Gram de las colonias obtenidas. La bacteria presente en el pez
fue aislada en agar TYES cultivándola por 3 días a 18ºC, obteniéndose las
características colonias amarillas. En C se muestra una confirmación de la presencia
del patógeno en el pez.
En la Figura 11D se observa la identificación de la bacteria mediante la reacción
de PCR, obteniéndose para las muestras de la zona del pedúnculo (Carril 2) y bazo
(Carril 3) un fragmento de 1.100pb aproximadamente, que corresponde a parte del gen
16S del ARN ribosomal de F. psychrophilum.
56
A
B
100X
C
100X
D
E
1
2
3 4
1100 pb
40X
Figura 11. Caracterización de Flavobacterium psychrophilum de lesiones de
peces infectados naturalmente. La presencia de F. psychrophilum en las lesiones de
peces infectados, se confirmaron por Gram en improntas de lesión. A, impronta de
lesión externa, en la zona del pedúnculo (flecha) y B, impronta de lesión interna,
bazo(flecha). Imágenes tomadas a 100X. En C, se muestra un cultivo puro de F.
psychrophilum obtenida de la lesión del pez. Asimismo se confirmo mediante PCR
específico la presencia de F. psychrophilum. Imagen tomada a 40X. Carril E: estándar
de peso molecular de 100pb, carril 1: control positivo, carril 2: muestra de la zona del
pedúnculo, carril 3: muestra de bazo y carril 4: control negativo.
57
4.3.5 Inmunodetección en extendidos de cultivo del patógeno y lesiones de
truchas arcoiris (O. mykiss) infectados naturalmente con F. psychrophilum
Para las pruebas de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia se estableció
una dilución de los anticuerpos anti-proteínas de membrana 1306 y 4605 de 1:15.000.
4.3.5.1 Inmunohistoquímica (IHQ)
Se realizaron análisis inmunohistoquímicos de extendidos de cultivo puro de
psychrophilum
fijados con metanol
F.
y de improntas de lesión externa (zona del
pedúnculo) e interna (bazo) de truchas arcoiris infectadas naturalmente con este
patógeno, como se muestran en las figuras 12 y 13.
La Figura 12 muestra el análisis inmuhistoquímico utilizando el anticuerpo anti
proteínas de membrana 1306 (anti-PM1306). En A se observa la inmundetección de la
cepa 1306, observándose bacilos de color café. En B se muestra el control negativo
donde no se observó tinción inmunopositiva. En C se observan numerosas bacterias
teñidas positivamente presentes en impronta de lesión externa (zona del pedúnculo), de
peces infectados naturalmente con el patógeno. En D se muestra un control negativo de
impronta de lesión externa. En E se observan pocas bacterias (indicadas con fechas),
teñidas positivamente pero presentes en impronta de lesión interna (bazo). Finalmente
en F se observa
el
control negativo de bazo donde no se observa reacción del
anticuerpo.
La Figura 13 muestra el análisis inmuhistoquímico utilizando el anticuerpo anti
proteínas de membrana 4605 (anti-PM 4605). En A se observa la inmundetección de la
cepa 4605, observándose bacilos de color café. En B se muestra el control negativo
donde no se observó reacción.
58
Para los cuadros C, D, E y F se observaron los mismos resultados que lo descrito
anteriormente para la Figura 12. La única diferencia radica en la utilización de un
anticuerpo (anti-PM 4605), distinto al de la Figura 12.
Tanto en extendidos de cultivo como en improntas de lesión se observa que las
bacterias se encuentran bien preservadas conservando su morfología alargada de
extremos redondeados.
4.3.5.2 Inmunofluorescencia (IFAT)
En la Figura 14 se muestra un análisis mediante inmunofluorescencia de
extendidos de bacterias en cultivo y lesiones de peces infectados naturalmente con F.
psychrophilum. Los anticuerpos anti-proteínas de membrana 1306 (anti-PM 1306) y
4605 (anti-PM 4605) fueron probados a una dilución de 1:15.000, tal como se indicó
anteriormente. En la Figura 14A y 14C, corresponden a extendidos de bacterias en
cultivo donde se observa la presencia de bacilos alargados, con morfología
característica de F. psychrophilum. En la Figura 14B y 14D, corresponden a lesiones
externas (zona del pedúnculo) de peces infectados naturalmente con el patógeno,
donde se observa la presencia de bacilos con extremos redondeados correspondientes
al patógeno (flechas). No se observó reacción en los controles negativos de extendido
de cultivo e improntas de lesión externa.
59
A
B
100X
100X
D
C
100X
E
100X
F
100X
100X
Figura 12. Inmunodetección en extendidos de bacterias en cultivo e improntas de
lesiones de peces infectados naturalmente con Flavobacterium psychrophilum
mediante IHQ. A y B, extendidos de cultivo puro de F. psychrophilum de la cepa 1306.
C y D, improntas de la zona del pedúnculo de trucha arcoiris. E y F, improntas de bazo
de trucha arcoiris. B, D y F son los controles negativos de cada ensayo realizado.
Imágenes tomadas a 100X.
60
A
B
100X
C
100X
D
100X
E
100X
F
100X
100X
Figura 13. Inmunodetección en extendidos de bacterias en cultivo e improntas de
lesiones de peces infectados naturalmente con Flavobacterium psychrophilum
mediante IHQ. A y B, extendidos de cultivo puro de F. psychrophilum de la cepa 1306.
C y D, improntas de la zona del pedúnculo de trucha arcoiris. E y F, improntas de bazo
de trucha arcoiris. B, D y F son los controles negativos de cada ensayo realizado.
Imágenes tomadas a 100X
61
A
B
control
control
Anti-PM1306
63X
C
40X
D
control
control
63X
40X
Anti-PM4605
Figura 14. Inmunodetección en extendidos de bacterias en cultivo y lesiones de
peces infectados naturalmente con Flavobacterium psychrophilum mediante
IFAT. A y C extendidos de cultivo puro de F. psychrophilum de la cepa 1306 y 4605,
respectivamente (imágenes tomadas a 63X). B y D, improntas de la zona del pedúnculo
de trucha arcoiris (imágenes tomadas a 40X). Los cuadros superiores derechos son los
controles negativos de cada ensayo realizado.
62
4.4 Evaluación de los anticuerpos recombinantes
En un paso previo a los ensayos de inmunodetección, se evaluó si el fago M13
recombinante se encontraba activo (ver detalle sección 3.2.14). Como resultado se
observó en todas las placas (LB-agar), lisis completa de la bacteria E. coli ER2537,
confirmando que estos se encontraban activos.
4.4.1 Inmunodetección de F.
psychrophilum utilizando los anticuerpos
recombinantes mediate Dot-blot
Se analizó la reacción de los anticuerpos recombinantes contra las cepas 4605 y
1306, utilizando la bacteria completa y sus respectivas proteínas totales (5µg) y de
membrana (5µg).
Buttcovich (2005) analizó grupos de anticuerpos recombinantes dentro de los
cuales identificó y caracterizó 3 de ellos (68, 97 y 125) mediante IFAT y ELISA. Estos
anticuerpos recombinantes mostraron ser específicos para F. psychrophilum
al ser
analizados por ambas técnicas. Así se escogieron estos 3 anticuerpos, los cuales
fueron utilizaron a una dilución de 1:10 (Buttcovich, 2005).
En la Figura 15 se puede observar que todos los fagos en estudio reconocen
proteínas de membrana de ambas cepas. Sin embargo, éstos no fueron capaces de
reconocer las proteínas totales de la cepa 1306 pero sí de la cepa 4605. Además estos
clones fueron capaces de reaccionar principalmente con la bacteria completa de la cepa
4605. Como control negativo se utilizó BSA y E. coli, donde no se observa
inmunorreacción.
63
68
4605
97
1306
4605
125
1306
4605
1306
F.p.
PT
PM
BSA
E.c.
Figura 15. Análisis de Dot blot de los anticuerpos recombinantes contra
Flavobacterium psychrophilum. En la Figura se muestra la inmunodetección de la
bacteria completa (F.p.) y proteínas totales (PT) y de membrana (PM) de F.
psychrophilum con los distintos anticuerpos recombinantes 68, 97 y 125. Como control
negativo se utilizó BSA y E. coli (E. c.) donde no se observa inmunorreacción.
64
4.4.2 Inmunodetección de aislados de F. psychrophilum utilizando anticuerpos
recombinantes mediante Dot-blot
Se utilizaron 5 µg de proteínas totales de los aislados 14, 15, 16, 25, 27, 31, 40,
41
y
46
previamente
caracterizados
por
Figueroa
(2008).
Los
anticuerpos
recombinantes fueron utilizados a una dilución de 1:10.
En la Figura 16 se puede observar que los anticuerpos recombinantes son
capaces de reconocer todos los aislados a excepción del aislado 31 el cual fue sólo
reconocido por el anticuerpo recombinante 68.
4.4.3 Titulación anticuerpos recombinantes
En una primera etapa se procedió a titular los anticuerpos recombinantes
mediante esta prueba, los cuales se utilizaron como anticuerpo de captura. Para ello se
realizaron distintas diluciones de los anticuerpos recombinantes 68, 97 y 125 partiendo
con una dilución de 1:10 hasta una dilución de 1:1.280. La titulación de los anticuerpos
recombinantes se realizó utilizando 0,5µg constante de proteínas de membrana de la
cepa 1306 y 4605. El anticuerpo policlonal anti-proteínas de membrana 1306 fue
utilizado para estas pruebas a una dilución de 1:15.000.
En la Figura 17 y 18 se muestran las curvas correspondientes a la titulación de
los 3 anticuerpos recombinantes 68, 97 y 125. En ambas Figuras se observa que al
aumentar las diluciones disminuye la absorbancia radicalmente. En la Figura 17, en
presencia de PM-1306,
los 3 anticuerpos recombinante utilizados para capturar el
antígeno originaron absorbancias de alrededor de 0,2 al utilizar una dilución de 1:10, la
cual decae a 0,08 al aumentar la dilución a 1:20. En la Figura 18, en presencia de PM4605 se observa que sólo el anticuerpo recombinante 68 obtiene una absorbancia
65
alrededor de 0,15 al utilizar una dilución de 1:10 mientras que los clones 97 y 125 dan
una absorbancia bajo 0,1. Con estos datos se escogió el anticuerpo recombinante 68
para continuar con la caracterización mediante las pruebas de ELISA.
4.5 Desarrollo de una prueba de ELISA sandwich para detectar F. psychrophilum
Para el desarrollo de la prueba de ELISA sandwich, se utilizó como anticuerpo de
captura el anticuerpo recombinante 68 a una dilución de 1:10 y como anticuerpo de
detección se utilizó el anticuerpo policlonal-anti proteínas de membrana1306 a una
dilución de 1:15.000
4.5.1 Análisis de la sensibilidad de la prueba de ELISA sándwich
La sensibilidad de esta prueba fue analizada a distintas cantidades de proteínas
totales de la cepa 1306 y de membrana de la cepa 1306 y 4605. Se partió con una
cantidad de 3,2 µg hasta una cantidad de 0,5 µg de proteína.
En la Figura 19 se muestran las curvas correspondientes a la detección de las
distintas cantidades de proteínas totales y de membrana, por parte de los anticuerpos
de captura y detección. En esta figura se observa que ambos anticuerpos son capaces
de detectar eficazmente bajas cantidades de las proteínas de membrana de la cepa
1306 obteniendo una absorbancia alrededor de 0,39. Sin embargo, no se observó lo
mismo a bajas cantidades de las proteínas totales (1306) y de membrana (4605).
Siendo estas eficientemente detectadas por sobre los 1,5 µg de proteína.
66
14
15
16
25
27
31
40
41
46
68
97
125
Figura 16. Análisis de Dot blot de proteínas totales de aislados de Flavobacterium
psychrophilum utilizando anticuerpos recombinantes. En la Figura se muestra las
proteínas totales de los distintos aislados de F. psychrophilum inmunodetectadas con
los distintos anticuerpos recombinantes 68, 97 y 125.
67
Absorbancia (450nm)
0,25
0,2
68
0,15
97
0,1
125
0,05
0
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Diluciones anticuerpo de captura
Figura 17. Titulación de los anticuerpos recombinantes en presencia de PM-1306
mediante ELISA sandwich
68
Absorbancia (450nm)
0,16
0,14
0,12
0,1
68
0,08
97
0,06
125
0,04
0,02
0
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Diluciones anticuerpo de captura
Figura 18. Titulación de los anticuerpos recombinantes en presencia de PM-4605
mediante ELISA sándwich
69
Absorbancia (450nm)
0,6
0,5
0,4
PM1306
0,3
PM4605
PT1306
0,2
0,1
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
ug de proteína
Figura 19. Análisis de la sensibilidad de la prueba de ELISA sandwich. El gráfico
representa la sensibilidad dada por la detección de bajas cantidades de proteínas de F.
psychrophilum utilizando los anticuerpos de captura (68) y detección (anti-PM1306)
70
4.5.2 Análisis de la especificidad de la prueba de ELISA sandwich
Para evaluar la especificidad de la prueba de ELISA contra F. psychrophilum, se
realizaron pruebas de reacción cruzada contra las proteínas totales de órganos de
Salmo salar y de bacterias de importancia para la salmonicultura.
Para estas pruebas se utilizaron como controles positivos, el anticuerpo policlonal
anti-F. psychrophilum donado por el Dr. Hugo Folch y proteínas totales de la cepa 1306
de F. psychrophilum.
En la Figura 20 se muestra la prueba de reacción cruzada con órganos de Salmo
salar (barra 4 a la 14), en donde se utilizaron 0,5µg de proteínas totales. En esta figura
se puede observar que no hubo reacción cruzada con ninguna de las proteínas de
órganos de S. salar al comparar con el control negativo y con los controles positivos.
En la Figura 21 se muestra la prueba de reacción cruzada con bacterias de
importancia para la salmonicultura (barra 4 a la 12), en donde se utilizaron 0,5µg de
proteínas totales. En esta figura, como en la figura anterior, no se observó reacción
cruzada con ninguna de las proteínas de bacterias al comparar con el control negativo
y con los controles positivos.
71
0,3
Absorbancia (450nm)
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Antígeno
Figura 20. Análisis de la especificidad de la prueba de ELISA sandwich contra las
proteínas totales de órganos de Salmo salar. Barra 1: Control positivo, anticuerpo
policlonal-anti F. psychrophilum; barra 2: control positivo, proteínas totales de la cepa
1306 de F. psychrophilum; barra 3: control negativo, BSA; barra 4: gónada; barra 5:
corazón; barra 6: riñón; barra 7: bazo; barra 8: ciegos pilóricos; barra 9: hígado; barra
10: músculo; barra 11: branquias; barra 12: cerebro y barra13: hipófisis.
72
Absorbancia (450nm)
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Antígeno
Figura 21. Análisis de la especificidad de la prueba de ELISA sandwich contra las
proteínas totales de bacterias patógenas de peces. Barra 1: Control positivo,
anticuerpo monoclonal-anti F. psychrophilum; barra 2: control positivo, proteínas totales
de la cepa 1306 de F. psychrophilum; barra 3: control negativo, BSA; barra 4:
Renibacterium salmoninarum; barra 5: Bacillus cereus; barra 6: Flavobacterium
columnare; barra 7: Vibrio ordalli; barra 8: Aeromonas salmonicida; barra 9: Aeromonas
hidrophila; barra 10: Flexibacter maritimus; barra 11: Escherichia
Piscirickettsia salmonis
coli y
barra 12:
73
4.5.3 Inmunodetección de aislados de F. psychrophilum por el método de ELISA
sandwich
Para evaluar si la prueba de ELISA fue capaz de reaccionar con diferentes
cepas de F. psychrophilum, se utilizaron 10 aislados de este patógeno (14, 15, 16, 25,
27, 31, 40, 41 y 46). De estos aislados, se utilizaron las proteínas totales (0,4µg)
previamente cuantificadas por el método de Bradford.
Como control negativo se utilizó BSA y como control positivo proteínas totales
de la cepa 1306 de F. psychrophilum.
Para la estandarización de la técnica de ELISA se siguió la metodología
recomendada por Brunell et al. (1983), con la finalidad de obtener un punto de corte
para clasificar a las muestras como positivas o negativas.
Como control positivo se utilizaron las proteínas totales cepas de F.
psychrophilum y como control negativo se utilizó BSA y proteínas totales de bacterias
patógenas y órganos de peces. Para el grupo control positivo se obtuvieron los
siguientes resultados: media = 0,1933 y la desviación estándar = 0,1174 y para el grupo
control negativo se obtuvieron los siguientes resultados: media = 0.0491 y la desviación
estándar = 0.0028.
El punto de corte se obtuvo sumando el promedio del grupo control negativo y
3 desviaciones estándar. El resultado obtenido de esta sumatoria fue 0.0575. Con este
valor de punto de corte se puede concluir que la prueba de ELISA es capaz de detectar
8 de los 9 aislados utilizados para esta prueba. Los aislados reconocidos positivamente
fueron 14, 15, 16, 25, 27,31,41 y 46. Sólo el aislado 40 no fue detectado por esta
prueba.
74
0,45
Absorbancia (450nm)
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Antígeno
Figura 22. ELISA sandwich para la detección de las proteínas totales de los
distintos aislados de Flavobacterium psychrophilum. Barra 1: Control positivo,
anticuerpo monoclonal-anti F. psychrophilum; barra 2: control positivo, proteínas totales
de la cepa 1306 de F. psychrophilum; barra 3: control negativo, BSA; barra 4: aislado
14; barra 5: aislado 15; barra 6: aislado 16; barra 7: aislado 25; barra 8: aislado 27;
barra 9: aislado 31; barra 10: aislado 40; barra 11: aislado 41 y barra 12: aislado 46.
75
5. DISCUSIÓN
Flavobacterium psychrophilum es una importante bacteria Gram negativa
causante de la “Enfermedad Bacteriana de Agua Fría” y el “Síndrome del Alevín de la
Trucha arcoiris”. Las proteínas de la membrana externa de este patógeno son
consideradas moléculas claves en la interface entre la célula y su ambiente. Estas
proteínas de membrana son importantes en la interacción del patógeno con las células
y tejido del hospedero en el contexto de su patogénesis e inmunidad a la infección
(Dumetz et al., 2008). Varios componentes de la superficie de F. psychrophilum han
sido implicados en su patogénesis e identificados como posibles candidatos para el
diagnóstico. Entre ellos podemos mencionar a las metaloproteasas Fpp1 y Fpp2
(Secades et al. , 2001 y 2003), lipopolisacáridos de baja y alta masa molecular (Crump
et al., 2001) y una glicoproteína de membrana (Merle et al., 2003), los que pueden ser
utilizados con fines diagnósticos y de control de la enfermedad que produce este
patógeno.
Se han descrito con anterioridad estudios sobre el desarrollo de una prueba de
ELISA sandwich basada en el uso de células enteras como antígenos y anticuerpos
policlonales hechos en conejo para detectar F. psychrophilum (Rangdale and Way,
1995; Lorenzen and Olesen, 1997; Mata and Santos, 2001).
En este trabajo, con la obtención de proteínas de membrana de F.
psychrophilum, la posterior generación de anticuerpos policlonales contra estas
proteínas en conejos y la utilización de anticuerpos recombinantes ya producidos en el
laboratorio de Biotecnología y Patología Acuática, se logró desarrollar por primera vez
una prueba de ELISA sandwich para detectar cepas de F. psychrophilum.
76
Uno de los primeros objetivos de este trabajo fue producir anticuerpos
policlonales en conejos contra las proteínas de membrana y la bacteria completa de F.
psychrophilum. Mediante el método descrito por Massias et al. (2004) con algunas
modificaciones, se logró extraer proteínas de membrana, las cuales fueron
posteriormente resueltas por SDS-PAGE al 12% visualizándose proteínas que van de
los 18 a los 120kDa, tal como se observó en la Figura 3. Al comparar las proteínas de
membrana y totales de las cepas en estudio (1306 y 4605),
sólo se observaron
diferencias en cuanto a intensidad y presencia/ausencia de bandas, tal como se indicó
en ésta Figura. Los patrones de proteínas obtenidos aquí fueron comparados con los
patrones de proteínas de membrana y totales descritos por otros autores (Merle et al.,
2003; Massias et al., 2004; Sudheesh et al., 2007; Dumetz et al., 2007), observándose
similitud en estos patrones.
La obtención de estas proteínas de membrana permitió generar anticuerpos
policlonales en conejos, los cuales en el desarrollo de esta tesis fueron caracterizados
mediante diversos análisis para comprobar que éstos podían ser utilizados en el
desarrollo de una prueba de ELISA sandwich.
Para poder determinar la dilución óptima de los anticuerpos policlonales y el
limite de detección del antígeno se realizaron análisis de Dot blot. Los anticuerpos
policlonales producidos contra las proteínas de membrana (PM) de ambas cepas
presentaron altos títulos (1:50.000) frente a una cantidad constante de proteína, como
se observó en la Figura 4. Estos anticuerpos además detectaron bajas cantidades de
proteínas (0,5µg), en comparación con los anticuerpos policlonales generados contra la
bacteria completa. Estos resultados nos indican que los anticuerpos anti-PM son
capaces de reconocer fuertemente las proteínas de membrana de F. psychrophilum y
77
por lo tanto, son los más adecuados para ser utilizados en los ensayos de
inmunodetección.
Posterior a esto se realizó la caracterización de los anticuerpos policlonales
contra las proteínas de membrana de F. psychrophilum mediante análisis de Western
blot. Estos análisis revelaron que ambos anticuerpos no sólo fueron capaces de
reaccionar con las proteínas a partir de los cuales fueron generados, sino que también
éstos fueron capaces de reconocer varias proteínas de una cepa distinta a la utilizada
para producirlos, como se observó en la Figura 6.
Estos
resultados
muestran
diferencias
entre
los
patrones
de
bandas
inmunoreactivas obtenidas al tratar con ambos anticuerpos anti-proteínas de
membrana. Cabe destacar que las bandas más predominantes con una masa molecular
aproximadamente de 88kDa, 55kDa, 40kDa, 24kDa, 23kDa y 19kDa son altamente
inmunogénicas tal como ha sido descrito por Sudheesh et al. (2007). Esto resultados
además han sido demostrados por LaFrenz et al. (2004) en estudios de la naturaleza
inmunogénica de esta bacteria. Estos autores identificaron 3 regiones inmunogénicas
del patógeno correspondiente a 18-28kDa, 41-49kDa, y 70-100 kDa mediante análisis
de Western blot usando suero inmune de trucha arcoiris (O. mykiss). Si bien, estas
regiones fueron detectadas con un suero de peces, nuestros resultados sugieren que
estas regiones también serían detectadas con los anticuerpos hechos en conejo.
Respecto de la posible naturaleza de las proteínas inmunodetectadas en este
estudio, se sugiere que algunas podrían ser proteasas de acuerdo a lo descrito por
algunos autores. Bertolini et al. (1994) encontraron 2 proteasas de F. psychrophilum de
114 y 152kDa las que degradaban caseína y gelatina y otras ocho proteasas desde 32
78
a 86kDa, que degradaban gelatina, no así caseína. Además Secades et al. (2001)
caracterizó una metaloproteasa psicrofílica de 55kDa la que denominó como Fpp1.
Una vez que se demostró que los anticuerpos policlonales anti-proteínas de
membrana eran capaces de reconocer antígenos de superficie de F. psychrophilum, se
procedió a evaluar, mediante análisis de Western blot, si estos eran capaces de
reconocer otras proteínas de órganos de Salmo salar y de bacterias patógenas de
peces. Para evaluar la reacción cruzada de los anticuerpos policlonales anti-PM en
órganos de Salmo salar, los análisis de Western blot sólo mostraron 1 a 2 proteínas
inmunorreactivas en gónada, corazón e hígado. Sin embargo, estos hallazgos no
afectarían la aplicación de estos anticuerpos en métodos de diagnóstico, ya que para la
detección de este patógeno se utilizan muestras de bazo y riñón principalmente. Mas
aún, en ocasiones se utilizan muestras de cerebro de peces infectados con esta
bacteria (Cipriano and Holt, 2005), para realizar el diagnóstico, órgano que no presentó
inmunorreacción con nuestros anticuerpos. Al realizar el análisis de la reacción cruzada
con bacterias patógenas de peces, no se observaron reacciones positivas para ninguna
de las bacterias utilizadas. Mas aún, bacterias de la misma familia de este patógeno
como F. maritimus y F. columnare no fueron detectadas con los anticuerpos.
Autores como Lorenzen and Karas (1992) y Crump et al. (2001) han generado
anticuerpos policlonales hechos en conejo contra F. psychrophilum completa. Estos
anticuerpos a diferencia de nuestros anticuerpos, presentaron reacción cruzada con F.
maritimus y F. columnare, bacterias de la misma familia de este patógeno.
Uno de los objetivos de esta tesis fue además determinar si los anticuerpos
obtenidos eran capaces de reconocer los distintos aislados de F. psychrophilum. Por
medio de los ensayos de Western blot, ambos anticuerpos policlonales anti-PM
79
inmunodetectaron distintas proteínas en los aislados. De hecho, se pudo observar
diferencias en los patrones de proteínas inmunorreactivas en los distintos aislados
(Figura 10). Tal como se observó en la Figura 6, ambos anticuerpos policlonales
detectaron proteínas inmunorreactivas predominantes alrededor de 19kDa, 40kDa,
55kDa y 88kDa para estos aislados (Figura 10). Además cabe destacar que para todos
los aislados se conservaron proteínas muy intensas de masa molecular aproximada a
los 40kDa y 55kDa. La conservación de ciertas proteínas inmunorreactivas en distintos
aislados de F. psychrophilum ha sido descrita por Crump et al. (2001). En este estudio
se describe una proteína de 80kDa aproximadamente, la cual estaría presente también
en nuestros aislados pero con una menor intensidad. Cabe destacar la presencia en
algunos de nuestros aislados de una proteína inmunoreactiva de baja masa molecular
de aproximadamente 19kDa. Crump et al. (2001) identificaron el mismo patrón
inmunoreactivo señalando que esta proteína de baja masa molecular correspondería a
un lipolisacárido. Si bien este resultado confirmó que nuestros anticuerpos reconocían
proteínas en los distintos aislados de F. psychrophilum, también permitirá aplicarlos en
estudios de caracterización antigénica de este patógeno.
Posteriormente, los anticuerpos policlonales obtenidos fueron aplicados en
ensayos de inmuhistoquímica
e inmunofluorescencia para evaluar la capacidad de
éstos para reconocer los antígenos de F. psychrophilum en la bacteria. Los resultados
obtenidos mostraron que F. psychrophilum puede ser detectada en extendidos de
cultivo e improntas de peces infectados naturalmente con los anticuerpos anti-PM1306
y anti-PM4605 a una dilución de 1:15.000 (Figura 12, 13 y 14). En todos los ensayos se
observó una reacción positiva dada por la presencia de bacilos alargados. Los controles
negativos no mostraron reacción. La detección de F. psychrophilum mediante las
80
técnicas de Western blot, IHQ e IFAT confirmaron que los anticuerpos son capaces de
detectar antígenos de F. psychrophilum tanto en su forma secuencial y conformacional.
Lorenzen and Karas (1992) realizaron análisis de inmunofluorescencia de
improntas de bazo de alevines de trucha arcoiris utilizando antisuero de conejo
preparado contra F. psychrophilum. Estos autores lograron detectar la bacteria tanto
viva como muerta. Adicionalmente Ekman and Norrgren (2003) realizaron análisis
inmunohistoquímicos de tejidos de riñón y bazo principalmente de trucha arcoiris y
salmón del atlántico. En ambos tejidos se observó fuertemente la presencia de F.
psychrophilum.
En resumen, se obtuvieron anticuerpos policlonales específicos contra proteínas
de membrana de F. psychrophilum, capaces de detectar distintos aislados del patógeno
tanto por Western blot, IHQ e IFAT, los que ahora pueden ser aplicados para el
desarrollo de una prueba de ELISA.
Posterior a esto se evaluó mediante análisis Dot blot y ELISA, si los anticuerpos
recombinantes eran capaces de detectar F. psychrophilum. Buttcovich (2005) en su
tesis de pregrado, analizó una biblioteca de anticuerpos recombinantes contra F.
psychrophilum mediante ELISA e IFAT. Buttcovich logró obtener 2 clones específicos
contra este patógeno de peces. Estos clones recombinantes no reaccionaron con las
diferentes cepas bacterianas de salmónidos (A. hidrophila, A. salmonicida, A. sobria, R.
salmoninarum, V. anguilarum, Y. ruckeri, P. salmonis), como tampoco lo hicieron con
las bacterias de la misma familia (F. columnare, F. maritimus). Estos tampoco
presentaron reacción cruzada con tejido renal. Demostrando que estos clones son
aplicables a métodos de diagnóstico inmunológico como ELISA.
81
Tres anticuerpos recombinantes positivos para la detección de F. psychrophilum
fueron utilizados(68, 97 y 125). Previó a los ensayos de inmunodetección se comprobó
que éstos se encontraran activos mediante la observación de lisis celular de E. coli
ER2537 en placa de agar LB.
Mediante análisis de Dot blot, se confirmó que estos anticuerpos eran capaces
de detectar la bacteria completa y sus proteínas totales y de membrana, utilizando las
cepas 1306 y 4605. Como se observó en la Figura 15 todos los clones fueron capaces
de reconocer las distintas proteínas y también la bacteria completa de la cepa 4605, lo
que no ocurrió con la cepa 1306 en donde sólo se reconoció, por parte de los 3 clones,
sólo las proteínas de membrana. Lo anterior sugiere que existe una diferencia en el
reconocimiento de proteínas totales por parte de los anticuerpos recombinantes. Esto
no debería influir al momento de desarrollar la prueba de ELISA puesto que estos
anticuerpos están dirigidos contra un epítope de la superficie de la bacteria. Además los
clones 68 y 97 son capaces de reconocer la bacteria completa de la cepa 1306, lo que
demuestra que estos son más adecuados para ser utilizados en los ensayos
posteriores.
Por otra parte, mediante ensayos de Dot blot, se observó que 2 anticuerpos
recombinantes fueron capaces de detectar 8 de los 9 aislados del patógeno y sólo el
anticuerpo 68 fue capaz de detectarlos en su totalidad. Estos resultados indican que el
clon 68 reconoció un antígeno específico de F. psychrophilum
presente en los 9
aislados y en las 2 cepas en estudio (1306 y 4605).
Los anticuerpos recombinantes han sido generados, utilizando la tecnología del
“Phage display” o despliegue en fago, y empleados por muchos autores. Cao et al.
(2000) produjeron anticuerpos recombinantes como inhibidores del crecimiento de
82
Helicobacter pylori. Adicionalmente, Manoutcharian et al. (2004) han producido
anticuerpos recombinantes para inmunizaciones y fabricación de vacunas contra
Cisticercosis por Taenia solium en cerdos. Además se han utilizado en enfermedades
infecciosas. Investigaciones realizadas sobre el ántrax, han utilizado una biblioteca de
scFv humana expresada en fagos para ser sometida a una selección directa in vitro
contra espora vivas nativas de Bacillus subtilis. Con esto se desarrollo un método para
detectar esporas individuales mediante el uso de bibliotecas de anticuerpos acopladas a
fluoresceína y expresadas en fago (Santamaría, 2003).
Es importante contar con este tipo de tecnología (“Phage display”) sobre todo
cuando se quiere desarrollar una prueba de diagnóstico lo más sensible y específica
posible para poder detectar patógenos de importancia en la salmonicultura. Cabe
destacar que este trabajo describe por primera vez el uso de anticuerpos recombinantes
y policlonales específicos para detectar F. psychrophilum.
Para el montaje de la prueba de ELISA sandwich se utilizó como anticuerpo de
captura el anticuerpo recombinante 68 a una dilución de 1:10 y como anticuerpo de
detección el anticuerpo policlonal anti-PM 1306 a una dilución de 1:15.000.
Mediante esta prueba se determinó el título óptimo de los anticuerpos
recombinantes y además se determinó con cuales de estos 3 clones se obtendría una
mayor detección de las proteínas de membrana de las cepas 1306 y 4605. Los
resultados muestran que la dilución óptima del anticuerpo de captura para el ensayo fue
de 1:10 para todos los clones (Figuras 17 y 18). Sin embargo, sólo con el clon 68 se
obtuvieron absorbancias por sobre 0,15 de OD450nm al utilizar PM-1306 y PM-4605, lo
que confirmó que este clon es más sensible que los otros dos (97 y125) para ser
utilizado en la prueba final.
83
La sensibilidad de la prueba fue analizada utilizando distintas cantidades de
proteínas totales de la cepa 1306 y de membrana de la cepa 1306 y 4605. De la Figura
19, se puede concluir que la prueba de ELISA fue capaz de detectar bajas cantidades
de proteínas totales y de membrana (0,5-1,0 µg). Lo cual demuestra que estos
anticuerpos son capaces de detectar positivamente las proteínas de la superficie de F.
psychrophilum.
La especificad de la prueba fue analizada mediante pruebas de reacción cruzada
con proteínas totales de órganos de peces (Salmo salar) y con bacterias patógenas de
importancia para la salmonicultura, como se describió para los anticuerpos policlonales.
Los resultados observados en la Figura 20 y 21 no arrojaron valores positivos para
ninguna de las proteínas totales de órganos y bacterias utilizadas para esta prueba, lo
cual demuestra que ambos anticuerpos son específicos para F. psychrophilum.
Posterior a esto se realizó una prueba para evaluar si estos anticuerpos en
conjunto eran capaces de detectar antígenos de la membrana de distintos aislados tal
como se realizó para cada anticuerpo por separado. Para esto se utilizaron 9 aislados
de F. psychrophilum en donde se lograron detectar positivamente 8 de los 9 aislados
(Figura 22). Para diferenciar que muestras eran positivas y negativas se obtuvo el
punto de corte de nuestra prueba (0,0575) siguiendo el método recomendado por
Brunell et al. (1983).
Estudios previos se han realizado utilizando la prueba de ELISA sandwich para
diferenciar serológicamente entre aislados de F. psychrophilum. Estos estudios se
realizaron utilizando anticuerpos policlonales hechos en conejo y preparados de
bacteria completa (Lorenzen and Olensen, 1997). Mata y Santos (2001) también
realizaron ensayos utilizando la técnica de ELISA sandwich con el fin de mejorar el
84
diagnóstico de enfermedades causadas por F. psychrophilum en salmón y trucha. Estos
autores lograron montar un ensayo de ELISA específico, sensible y rápido utilizando
anticuerpos policlonales y de bacteria completa.
La prueba de ELISA ha sido utilizada ampliamente en el diagnóstico de
patógenos de peces. La unión covalente de enzimas a las moléculas de anticuerpos sin
alterar las propiedades catalíticas de éstas y la especificidad del anticuerpo produce
una herramienta inmunológica que posee alta sensibilidad y alta especificidad. Esta
prueba puede ser usada para la detección del antígeno soluble extraído desde el tejido
infectado, y es probablemente el método más sensible. Permite analizar un gran
número de muestras y está especialmente bien adaptada para los requerimientos de
certificación sanitaria.
La prueba de ELISA sandwich desarrollada en este estudio a demostrado ser un
método de diagnóstico sensible, específico y confiable para la detección de F.
psychrophilum. Es por esto, que es importante seguir realizando pruebas con los
anticuerpos recombinantes y policlonales y buscar nuevos métodos de detección para
aumentar la sensibilidad de la prueba de tal manera de poder detectar cualquier aislado
de este patógeno de peces.
A futuro se espera poder utilizar esta prueba de manera efectiva para detectar,
en etapas temprana de la infección, cantidades bajas de la bacteria completa para así
poder controlar y dar tratamiento a tiempo a especies salmónidas afectadas.
85
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