Tesis Electrónicas UACh - Universidad Austral de Chile

Universidad Austral de Chile
Facultad de Ciencias
Escuela de Química y Farmacia
PROFESOR PATROCINANTE: Karin Jürgens Sch.
INSTITUTO : Farmacia
FACULTAD : Ciencias
“ESTUDIO FITOQUÍMICO Y ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE PLANTAS UTILIZADAS
EN MEDICINA MAPUCHE"
Tesis de grado presentada como
parte de los requisitos para optar
al título de Químico Farmacéutico
KARLA IVÓN OJEDA ROJAS
VALDIVIA-CHILE
2013
“
Por qué te entregas a esa piedra
Niño de ojos almendrados
Con el impuro pensamiento
De derramarla contra el árbol.
Quien no hace nunca daño a nadie
No se merece tan mal trato.
Ya sea sauce pensativo
Ya melancólico naranjo
Debe ser siempre por el hombre
Bien distinguido y respetado:
Niño perverso que lo hiera
Hiere a su padre y a su hermano…”
Defensa del árbol
Del libro “Obra Gruesa” de Nicanor Parra
AGRADECIMIENTOS
Se acerca el final de una etapa importante en mi vida y es el momento de las reflexiones, hay
tantas personas a quienes debo agradecer:
En primer lugar quiero agradecer a la profesora Karin Jürgens por permitirme trabajar con ella
en su laboratorio, por todo el apoyo y los consejos entregados que permitieron que el trabajo en el
laboratorio se desarrollara de buena manera.
Al profesor Alejandro Jerez por aceptar formar parte de mi comisión de tesis, por su ayuda, por
compartir sus conocimientos de manera desinteresada y por el interés en mi trabajo. Gracias por
sus palabras…
Al profesor Marcelo Muñoz por aceptar ser profesor informante de mi tesis a pesar que no nos
conocemos demasiado.
Al profesor Joel Pardo por toda la ayuda prestada tanto en el trabajo de laboratorio como en los
simples detalles que permitieron que esta tesis culmine con éxito. Me hubiese encantado que
usted formara parte de mi comisión, pero por cosas del destino eso no sucedió. Infinitas gracias.
A don Eduardo Aguayo por su ayuda y alegría, por sus canciones… Porque siempre supo cómo
sacarme una sonrisa, aún en los momentos más tristes.
A los profesores del Instituto de Farmacia por confiar en mí, a pesar de los altos y bajos en el
transcurso de la carrera.
A mi mamá y mis hermanas por el apoyo entregado en todo sentido, por darme ánimo en los
momentos más tristes. Mamita, tú sabes que sin tu esfuerzo nada de esto hubiera sido posible,
gracias a ti soy lo que soy hasta ahora, gracias por entenderme y apoyarme siempre. Te quiero
mucho mamita, nunca lo olvides…
A Álvaro, mi novio, porque apareciste en un momento muy especial de mi vida. Gracias a ti he
aprendido a ser una mejor persona. Con tu apoyo he sabido afrontar muchas situaciones que
jamás pensé sería capaz de sobrellevar. Tengo tantas cosas para decirte y tan pocas líneas para
ello, pero al final todo puede resumirse en un “te amo”. Gracias por todo amor, espero que
sigamos construyendo nuestra vida juntos.
Finalmente quiero agradecer a todas las personas que de una u otra manera contribuyeron a que
mi tesis y mi carrera concluyeran de buena manera. Quiero que sepan que siempre trataré de dar
lo mejor de mí, en todo sentido. Gracias por la confianza y el cariño.
También quiero expresar que sí, creo en Dios… y espero que Él también crea en mí…
i
ÍNDICE
1-
RESUMEN ........................................................................................................................ 1
1.1
ABSTRACT ...................................................................................................................... 2
2-
INTRODUCCIÓN............................................................................................................. 3
2.1
Medicina tradicional Mapuche .......................................................................................... 3
2.1.1
Laurelia sempervirens ....................................................................................................... 5
2.1.2
Modiola caroliniana .......................................................................................................... 8
2.1.3
Gunnera tinctoria .............................................................................................................. 9
2.2
Caracterización de flavonoides ....................................................................................... 12
2.2.1
Identificación de flavonoides en Laurelia sempervirens y sus propiedades
farmacológicas ............................................................................................................................... 14
2.2.2
Identificación de flavonoides en Modiola caroliniana y sus propiedades
farmacológicas ............................................................................................................................... 15
2.2.3
Identificación de flavonoides en Gunnera tinctoria y sus propiedades
farmacológicas ............................................................................................................................... 17
2.3
Hipótesis .......................................................................................................................... 19
2.4
Objetivos ......................................................................................................................... 20
2.4.1
Objetivo general .............................................................................................................. 20
2.4.2
Objetivos específicos....................................................................................................... 20
3-
MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................... 21
ii
3.1
Materiales ........................................................................................................................ 21
3.1.1
Material vegetal ............................................................................................................... 21
3.1.2
Instrumentos .................................................................................................................... 21
3.1.3
Material de laboratorio .................................................................................................... 22
3.1.4
Reactivos ......................................................................................................................... 23
3.2
Metodología..................................................................................................................... 25
3.2.1
Recolección material vegetal........................................................................................... 25
3.2.2
Procesamiento material vegetal ....................................................................................... 25
3.2.3
Reacciones fitoquímicas generales .................................................................................. 27
3.2.3.1 Identificación de hidratos de carbono ............................................................................. 27
3.2.3.2 Identificación de gomas y mucílagos: ............................................................................. 28
3.2.3.3 Identificación de saponósidos ......................................................................................... 28
3.2.3.4 Identificación de taninos ................................................................................................. 28
3.2.3.5 Identificación de flavonoides mediante la reacción de la cianidina ................................ 28
3.2.3.6 Identificación de heterósidos antraquinónicos: Reacción de Bornträger ........................ 29
3.2.3.7 Identificación de derivados del núcleo esteroideo: Reacción de Liebermann ................ 29
3.2.3.8 Identificación de alcaloides en drogas vegetales ............................................................. 30
3.2.4
Obtención del extracto metanólico .................................................................................. 33
3.2.5
Fraccionamiento líquido-líquido ..................................................................................... 34
3.2.6
Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC) ........................................................ 37
iii
3.2.6.1
Cromatografía líquida de alta eficiencia con detector de arreglo de diodos
(HPLC-DAD) ................................................................................................................................ 37
3.2.7
Determinación de fenoles totales .................................................................................... 40
3.2.8
Determinación de flavonoides totales ............................................................................. 41
3.2.9
Evaluación actividad biológica ....................................................................................... 41
3.2.9.1 Evaluación capacidad antioxidante mediante ensayo con DPPH ................................... 41
4-
RESULTADOS ............................................................................................................... 43
4.1
Identificación de metabolitos secundarios ...................................................................... 43
4.1.1
Ensayos fitoquímicos generales ...................................................................................... 43
4.1.3
Identificación de flavonoides por cromatografía líquida de alta eficiencia con detector de
arreglo de diodos (HPLC-DAD).................................................................................................... 46
4.2
Determinación fenoles totales ......................................................................................... 53
4.3
Determinación flavonoides totales .................................................................................. 55
4.4
Evaluación efecto antioxidante ....................................................................................... 56
5-
DISCUSIÓN .................................................................................................................... 58
6-
CONCLUSIONES........................................................................................................... 67
7-
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 68
iv
INDICE DE FIGURAS
Figura 1: Drogas utilizadas en medicina Mapuche ........................................................................ 4
Figura 2: Hojas y ramas de Laurelia sempervirens........................................................................ 6
Figura 3: Partes aéreas de Modiola caroliniana............................................................................. 9
Figura 4: Hojas de Gunnera tinctoria .......................................................................................... 11
Figura 5: Estructura básica de los flavonoides y sistema de numeración .................................... 13
Figura 6: Flavonoides de Laurelia sempervirens ......................................................................... 14
Figura 7: Flavonoides de Modiola caroliniana ............................................................................ 16
Figura 8: Flavonoides de Gunnera tinctoria ................................................................................ 17
Figura 9: HLPC-DAD Shimadzu modelo Prominence, Instituto de Farmacia, Universidad
Austral de Chile ............................................................................................................................. 22
Figura 10: Instrumentos utilizados en el laboratorio .................................................................... 23
Figura 11: Material vegetal utilizado ........................................................................................... 26
Figura 12: Esquema de obtención de extracto metanólico crudo y posterior fraccionamiento
líquido-líquido .............................................................................................................................. 36
Figura 13: Reacción antrona en medio sulfúrico ......................................................................... 45
Figura 14: Reacción con reactivo Molisch .................................................................................. 45
Figura 15: Reacción licor de Fehling ........................................................................................... 45
Figura 16: Reacción con etanol (gomas) ..................................................................................... 45
Figura 17: Reacción con FeCl3 (taninos) ..................................................................................... 45
v
Figura 18: Reacción de la cianidina ............................................................................................ 45
Figura 19: Reacción de Bornträger ............................................................................................. 46
Figura 20: Reacción de Liebermann ........................................................................................... 46
Figura 21: Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 5 µL fracción AE4, canales de
absorbancia 253, 265, 354 nm, tiempo de corrida 60 minutos ..................................................... 47
Figura 22: Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 20 µL fracción M4, canales de
absorbancia 253, 265, 354 nm, tiempo de corrida 60 minutos ..................................................... 47
Figura 23: Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 5 µL fracción AE5, canales de
absorbancia 253, 265, 354 nm, tiempo de corrida 60 minutos ..................................................... 48
Figura 24: Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 20 µL fracción M5, canales de
absorbancia 253, 265, 354 nm, tiempo de corrida 60 minutos ..................................................... 48
Figura 25: Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 5 µL estándares de flavonoides
diluidos al 10%, canal de absorbancia 354 nm, tiempo de corrida 60 minutos............................. 49
Figura 26: Tabla de picos obtenidos en el análisis por HPLC-DAD de estándares de flavonoides
diluidos al 10% con sus correspondientes tiempos de retención, área y altura de los picos. ........ 49
Figura 27: Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 5 µL estándares de flavonoides
diluidos al 10%, con la identificación del compuesto correspondiente a cada pico de
absorbancia. ................................................................................................................................... 50
Figura 28: Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 20 µL fracción AE4: estándares
de flavonoides en proporción 10:1, canal de absorbancia 354 nm, tiempo de corrida 60 minutos.
Superposición de cromatogramas: naranjo muestra AE4, azul muestra AE4 + estándares .......... 51
vi
Figura 29: Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 20 µL fracción M4: estándares de
flavonoides en proporción 10:1, canal de absorbancia 354 nm, tiempo de corrida 60 minutos.
Superposición de cromatogramas: naranjo muestra M4, azul muestra M4 + estándares ............. 52
Figura 30: Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 20 µL fracción AE5: estándares
de flavonoides en proporción 10:1, canal de absorbancia 354 nm, tiempo de corrida 60 minutos.
Superposición de cromatogramas: naranjo muestra AE5, azul muestra AE5 + estándares .......... 52
Figura 31: Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 20 µL fracción M5: estándares de
flavonoides en proporción 10:1, canal de absorbancia 354 nm, tiempo de corrida 60 minutos.
Superposición de cromatogramas: naranjo muestra M5, azul muestra M5 + estándares ............. 53
Figura 32: Curva de calibración del método Folin-Ciocalteu con estándares de ácido gálico de
concentraciones 100, 200, 300, 400 y 500 µg/mL, ecuación de la recta y coeficiente de
correlación de los datos ................................................................................................................. 54
Figura 33: Curva de calibración del método cloruro de aluminio con estándares de quercetina
de concentraciones 5, 10, 15, 20 y 25 µg/mL, ecuación de la recta y coeficiente de correlación
de los datos .................................................................................................................................... 55
vii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1: Reacciones fitoquímicas realizadas a las drogas en análisis, metabolitos buscados y
resultados esperados en cada una de ellas .................................................................................... 32
Tabla 2: Cantidad de extracto y rendimiento obtenido para cada droga ...................................... 33
Tabla 3: Fase móvil utilizada para el análisis de extractos por HPLC-DAD de elución por
gradiente, con las correspondientes variaciones en los porcentajes de cada fase según el
tiempo de corrida ........................................................................................................................... 38
Tabla 4: Resumen de los resultados obtenidos en las reacciones fitoquímicas realizadas en
extractos de hojas y ramas de Laurelia sempervirens, de partes aéreas de Modiola caroliniana y
de láminas y peciolos de hojas de Gunnera tinctoria.................................................................... 44
Tabla 5: Resultados obtenidos en la determinación de fenoles totales de extractos de hojas y
ramas de Laurelia sempervirens, de partes aéreas de Modiola caroliniana y de láminas y peciolos
de hojas de Gunnera tinctoria mediante el método de Folin-Ciocalteu, expresados como la media
de 3 resultados ± desviación estándar............................................................................................ 54
Tabla 6: Resultados obtenidos en la determinación de flavonoides totales de extractos de hojas y
ramas de Laurelia sempervirens, de partes aéreas de Modiola caroliniana y de láminas y peciolos
de hojas de Gunnera tinctoria mediante el método cloruro de aluminio, expresados como la
media de 3 resultados ± desviación estándar ................................................................................. 56
Tabla 7: Porcentaje de inhibición del radical DPPH por estándares de ácido ascórbico de
concentraciones 4, 6, 8 y 10 µg/mL. Resultados expresados como el promedio de 3 medidas ±
desviación estándar ........................................................................................................................ 57
viii
Tabla 8: Porcentaje de inhibición del radical DPPH por extractos de hojas y ramas de Laurelia
sempervirens, de partes aéreas de Modiola caroliniana y de láminas y peciolos de hojas de
Gunnera tinctoria de concentraciones 1 y 0,5 mg/mL. Resultados expresados como el promedio
de 3 medidas ± desviación estándar ............................................................................................. 57
ix
ANEXOS
Anexo 1: Preparación de reactivos para reacciones fitoquímicas generales ................................. 80
Anexo 2: Cromatogramas de fracciones analizadas por HPLC-DAD sin co-inyección de
estándares (fracciones que no mostraron resultados en la co-inyección de estándares) ............... 81
1
1-
RESUMEN
Este estudio fue diseñado con la finalidad de contribuir a la validación del uso de plantas
medicinales utilizadas en medicina Mapuche. Para ello se escogieron tres plantas comúnmente
utilizadas por la población y con reconocidas propiedades medicinales: Laurelia sempervirens,
Modiola caroliniana y Gunnera tinctoria. Estas especies fueron sometidas a una serie de pruebas
fitoquímicas para lograr una identificación cualitativa de los grupos de compuestos presentes en
ellas. También algunos de los extractos de las distintas partes de estas plantas fueron analizados
mediante HPLC-DAD para poder identificar sus compuestos mayoritarios. Finalmente se evaluó
la actividad biológica de los extractos de estas drogas por medio de un ensayo de actividad
antioxidante a través de la inhibición del radical DPPH, la determinación del contenido de fenoles
totales con el método de Folin-Ciocalteu y del contenido de flavonoides totales.
2
1.1
ABSTRACT
This study was designed in order to contribute to the validation of the use of medicinal plants
from the Mapuche’s medicine. Three plants were chosen for its medicinal properties: Laurelia
sempervirens, Modiola caroliniana and Gunnera tinctoria. These plants were subjected to a
series of phytochemical assays to achieve the presence of secondary metabolites. Also, in order to
identify the major compounds of these plants, some extracts were analyzed by HPLC-DAD.
Finally, biological activity of these drugs was evaluated: determination of antioxidant activity by
inhibition of the radical DPPH, determination of total phenolic content by Folin-Ciocalteu
method and determination of total flavonoid content.
3
2-
INTRODUCCIÓN
2.1
Medicina tradicional Mapuche
Desde tiempos antiguos las plantas han dado solución a las necesidades del hombre en cuanto a
vivienda, ropa, alimentos, entre otras. Del mismo modo han servido como fuente para la
generación de medicamentos y fragancias. El uso ancestral de las plantas con fines medicinales
ha contribuido a la creación de complejos sistemas de medicina tradicional alrededor del mundo
(Barboza et al., 2009). A partir de las plantas se han descubierto cientos de moléculas útiles en
medicina y hoy en día, gracias los avances en la ciencia de la etnobotánica y etnofarmacognosia,
esta práctica está retomando fuerza en pro de la búsqueda de nuevos medicamentos (GuribFakim, 2006).
Las comunidades aborígenes han dado gran importancia al uso de plantas con fines medicinales y
alimenticios, contribuyendo a su subsistencia, sobre todo de aquellas que viven en los bosques,
como por ejemplo la etnia Mapuche (Ladio et al., 2007). Los Mapuche son originarios de los
bosques templados del centro-sur de Chile y a partir de la segunda mitad del siglo XIX algunos se
han limitado a las reservas y otros han emigrado a la Argentina. A pesar de los trastornos sociales
que ellos han debido enfrentar, muchos aspectos de su cultura aún sobreviven (Houghton y
Manby, 1985). La flora medicinal Mapuche involucra una amplia variedad de plantas tanto
nativas como introducidas que se encuentran en su medio local. Esta diversidad le da una riqueza
inigualable. En medicina Mapuche se unen la dimensión simbólica y de las propiedades de las
plantas, lo que la vuelve una fuente de conocimientos muy compleja (Houghton y Manby, 1985;
Molares y Ladio, 2009). Hoy en día los Mapuche aún mantienen la tradición de recolección de
plantas, pues el uso de plantas y el conocimiento de ellas forman parte importante de su identidad
4
cultural (Ladio et al., 2007). Sin embargo la creciente urbanización de la población, junto con
otros factores ha llevado a una pérdida permanente de los conocimientos generados por el pueblo
Mapuche (Estomba et al., 2005; Houghton y Manby, 1985).
La medicina Mapuche incluye familias y especies botánicas que no han sido elegidas al azar,
siendo su selección basada en las tradiciones y también en las propiedades biológicas de las
plantas. Por lo tanto, el uso de todas estas especies en medicina parece ser el resultado de un
proceso de selección completo, mantenido y recreado por transmisión cultural. Basándose en los
conocimientos en cuanto a actividad de los diversos géneros y familias botánicas, se observa que
aquellas similares son utilizadas para tratar un tipo determinado de patología o afección. Lo
anterior podría entenderse como el resultado de patrones comunes de los conocimientos
botánicos a nivel mundial (Molares y Ladio, 2009). En este sentido, tanto la medicina Mapuche
como de otras comunidades indígenas son una fuente interesante de conocimiento y de nuevas
medicinas para el mundo de hoy.
Figura 1: Drogas utilizadas en medicina Mapuche
5
Existen muchas plantas dentro de la medicina Mapuche que carecen de estudios químicos,
farmacológicos o toxicológicos, sin embargo, sus propiedades medicinales son innegables. Un
ejemplo de ello son las especies endémicas chilenas de la familia Atherospermataceae, las que
tienen escasos estudios fitoquímicos y biológicos. Una de las especies pertenecientes a esta
familia es Laurelia sempervirens, especie que se ha utilizado para tratar enfermedades venéreas y
como expectorante (Avello et al., 2012). La infusión de las hojas es usada como digestivo, para
calmar dolores de cabeza y como diurético (Arbert et al., 2003). Por otra parte, Modiola
caroliniana, perteneciente a la familia Malvaceae, por ser considerada una maleza no es
comúnmente investigada, sin embargo, es frecuentemente utilizada en medicina Mapuche. Es
empleada entre los campesinos para tratar enfermedades de los bronquios y de la garganta
(Muñoz, 1980). Sus usos en medicina popular se basan en sus propiedades refrescantes, sedantes
y emolientes (Goleniowski et al., 2006). En relación a Gunnera tinctoria, perteneciente a la
familia Gunneraceae,
la decocción de sus raíces se utiliza contra la disentería (Montes y
Wilkomirsky, 1985). Las hojas bien cocidas puestas sobre la parte inferior de la espalda y riñones
hacen bajar la fiebre y por sus propiedades tónicas y astringentes se emplea contra las
hemorragias y las diarreas (Valdebenito et al., 2003).
2.1.1
Laurelia sempervirens
Laurelia sempervirens (Ruiz & Pav.) Tul es un árbol endémico de Chile, aunque existen
referencias de su presencia en Argentina (Montes y Wilkomirsky, 1985). Pertenece al reino
Plantae,
división
Magnoliophyta,
clase
Magnoliopsida,
orden
Laurales,
familia
Atherospermataceae, género Laurelia, especie L. sempervirens (Chase, 2009; Chase y Reveal,
2009; Haston et al., 2009). El nombre genérico procede del nombre vernáculo de la planta; el de
6
la especie significa siempreverde (Muñoz, 1980). Es conocido popularmente como “laurel”,
“tihue” o “trihue” (Hoffmann, 2005).
Crece desde la provincia de Colchagua hasta la provincia de Llanquihue (34º44’ - 41º10’S.),
desde los 20 hasta los 950 m. Habita en suelos más o menos profundos y húmedos, en quebradas
y en su distribución forma parte importante la selva valdiviana. Florece entre octubre y
noviembre y fructifica entre enero y febrero (Rodríguez y Quezada, 2001).
Es un árbol corpulento y frondoso, de crecimiento rápido que puede alcanzar 40 m de altura y
unos 2 m de diámetro. Su corteza es de gran grosor, tiene perfume agradable y se desprende en
placas circulares. Cuando nuevas, las ramillas están cubiertas de pelos que caen al lograr los
tejidos su madurez (Hoffmann, 2005). Sus hojas son opuestas, olorosas, oblongo-lanceoladas,
cortamente pecioladas, con pecíolos pubescentes de 1 cm de largo, láminas coriáceas, lustrosas,
de bordes algo revolutos, serrados hacia los dos tercios superiores y de 5-10 cm de largo por 2,55,0 cm de ancho, nervio medio algo pubescente por el envés (Muñoz, 1980). La madera del laurel
es blanco-verdosa, fácil de trabajar, algo blanda, de olor agradable y es muy valiosa para labores
de mueblería (Hoffmann, 2005).
Figura 2: Hojas y ramas de Laurelia sempervirens
7
Se ha descrito que la familia Atherospermataceae es una fuente importante de alcaloides
cuaternarios del tipo bencilisoquinolínico, flavonoides y aceites esenciales, donde Laurelia
sempervirens no es una excepción (Avello et al., 2012). La corteza del tallo de Laurelia
sempervirens R. et P. es una fuente rica de compuestos del tipo aporfinoides. En la fracción de
alcaloides diméricos de la corteza del tallo los principales componentes identificados son
obaberina, thalrugosina y oxiacantina (Cassels y Urzúa, 1985). De la madera y de la corteza de L.
sempervirens se pueden aislar los alcaloides liriodenina, oxonantenina, michelalbina, estefarina,
norantenina, anonaína y nornuciferina. Algunos compuestos volátiles identificados en el extracto
de acetato de etilo de la corteza de Laurelia sempervirens son isosafrol, safrol y espatulenol
(Montenegro et al., 2012; Montes y Wilkomirsky, 1985).
Mediante el análisis del aceite esencial de las hojas de Laurelia sempervirens se ha logrado la
identificación de varios compuestos mayoritarios, entre ellos (1R)-α-pineno, (1S)-α-pineno, βpineno, α-felandreno, cimol (p-cimeno), Z-ocimeno, terpinoleno, α-terpineol, safrol, germacreno
y espatulenol (Avello et al., 2012). El componente más importante del aceite esencial de las hojas
de L. sempervirens es safrol (Bittner et al., 2009). El segundo componente importante del aceite
de hojas es el limoneno. Safrol es también el principal componente del aceite de corteza, seguido
de metileugenol y limoneno (Zapata y Smagghea, 2010). En tanto en la fracción de alcaloides de
las hojas L. sempervirens se han identificado laurotetanina e isotetrandrina que son alcaloides del
tipo bisbencilisoquinolina (Schmeda-Hirschmann et al., 1996). Hasta ahora las referencias
existentes en cuanto a la composición química de Laurelia sempervirens destacan principalmente
la presencia de alcaloides y terpenos, estos últimos en el aceite esencial de diversas partes de la
planta, dejando de lado la investigación de metabolitos como los flavonoides u otros polifenoles.
8
2.1.2
Modiola caroliniana
El nombre de Modiola caroliniana (L.) G. Don (M. multifida Moench) proviene del latín
modiolus que significa “rueda de noria” (por la forma del fruto) y caroliniana por los habitantes
de Carolina. El nombre común de la planta es Pila-pila (Muñoz, 1980).
Esta especie es originaria de América tropical. En Chile crece entre la provincia de Huasco y la
de Osorno (29º05’ - 40º34’ S.), de los 5 a 2050 m, y también en el Archipiélago de Juan
Fernández (Marticorena, 2005). Se le encuentra en los lugares húmedos y constituye una maleza
muy esparcida (Muñoz, 1980).
Modiola caroliniana es una planta herbácea, de 15 a 45 cm de tamaño, rastrera, con tallo con
raíces en los nudos, sus hojas son alternas de 1,5 a 4 cm de longitud, tan anchas como largas,
palmatipartidas (5 a 7 veces), el peciolo puede ser más largo que la lámina y puede ser glabro o
pubescente, las estípulas son ovadas de 3 a 4 mm de longitud y de 1,5 a 3 mm de ancho. Tiene
pedúnculos solitarios, más o menos pubescentes, generalmente más cortos que los peciolos de las
hojas correspondientes, tiene 3 bractéolas en el calículo (cáliz) de forma lanceolada, de 4 a 5 mm
de longitud. Sus flores son solitarias, pequeñas y axilares, sus corolas miden de 6 a 8 mm, son de
color naranja oscura con el centro rojo y toman color rosado al secarse. Tiene un androceo
amarillento, el cáliz mide de 5 a 7 mm de longitud, tienen 5 lóbulos pubescentes con pelos de 1 a
2 mm de longitud. Tiene frutos parciales. Los mericarpos del fruto verde son reniformes de 5 a 6
mm de altura, tienen 2 espinas en el ápice y están partidos en 2 celdas. Las semillas son
negruzcas en el interior, reniformes, comprimidas, de aproximadamente 1,5 mm de longitud, con
pubescencia diminuta en su superficie casi lisa, de color café a café rojizo. (Rzedowski y
Rzedowski, 2005).
9
Figura 3: Partes aéreas de Modiola caroliniana
En las especies pertenecientes a la familia Malvaceae se pueden encontrar compuestos del tipo
ácidos grasos, ciclopropenoides y terpenoides basados en quinonas (Stevens, 2001). También se
ha reportado la presencia de betaínas; en el caso particular de Modiola caroliniana se ha descrito
la presencia de glicinbetaína (Blunden et al., 2001), además de la presencia de mucílagos (Montes
et al., 1992). Sin embargo Modiola caroliniana carece de estudios acabados sobre su
composición química y actividad biológica.
2.1.3
Gunnera tinctoria
Gunnera tinctoria (Molina) Mirbel pertenece a un género netamente del hemisferio sur, a la
familia Gunneraceae. Es una de las cerca de 14 especies de Gunnera de hoja grande en América
del Sur (Williams et al., 2005). El nombre genérico es en honor de Johann Ernst Gunner (17181773), botánico, autor de Flora noruégica y obispo de Drontheim (Suecia) en el año 1773
(Muñoz, 1980). Es conocida popularmente como “Nalca” o “Pangue”. El pangue es una de las
10
plantas más sorprendentes de las provincias centrales y australes, que crece a orillas de ríos,
acequias y lagos, en general, en todas aquellas partes donde exista agua en abundancia. Llama la
atención por sus hojas, que pueden alcanzar hasta más de 1 m de largo. El pangue forma
agrupaciones mayores que reciben el nombre de pangales (Montes y Wilkomirsky, 1985).
El llamado “Ruibarbo chileno” es nativo de ambos lados de los Andes, en regiones andinas de
Argentina, Perú, Ecuador, Colombia y Venezuela. En Chile lo encontramos desde Coquimbo a
Magallanes. En el sur de Chile (en latitudes de 36° - 42° S) es un manjar asociado con
costumbres Mapuche (Muñoz, 1980; Williams et al., 2005).
Sus hojas son alternas, con pecíolos largos (hasta 1,5 m), gruesos, carnosos, sembrados de
verrugas puntiagudas; poseen una lámina de contorno orbicular-reniforme, nerviado-arrugadas,
ásperas y pubescentes, de 0,6-1,5 m de diámetro, de bordes con 5 o más lóbulos con dientes
agudos en los márgenes (Muñoz, 1980). La hoja es bifacial con un mesófilo constituido por
parénquima de empalizada y parénquima esponjoso bien definidos, la epidermis superior se
caracteriza por poseer una gruesa cutícula, a ello se suma la presencia de una hipodermis. En la
superficie adaxial la nervadura de la hoja se presenta hundida dejando surcos muy definidos, con
pelos filiformes unicelulares y conos pluricelulares. En la superficie abaxial se observan los
estomas elevados, la nervadura de la hoja está bien definida y sobre los haces vasculares se
encuentran pelos filiformes (Urbina et al., 2012).
La gente del campo emplea las raíces y otras partes de la planta para teñir de negro. La raíz se
vende en el comercio local para infusión (Valdebenito et al., 2003). Los pecíolos pequeños son
vendidos por vendedores ambulantes y se comen crudos (Williams et al., 2005). El pangue es
11
también utilizado en la cocina chilota, pues con sus hojas se cubre el curanto y se envuelven
porciones de masa a base de papas para su cocción (Valdebenito et al., 2003).
Figura 4: Hojas de Gunnera tinctoria
Los principales constituyentes de la planta son los taninos (Montes y Wilkomirsky, 1985). La raíz
contiene tanino y goma (Valdebenito et al., 2003). Se ha descrito que Gunnera tinctoria presenta
poca cantidad de principios activos farmacológicos. Sus hojas y tallos poseen algunos
compuestos del tipo triterpenos y esteroides, estimándose probable la presencia de triterpenos en
forma de heterósidos. También se ha estudiado que esta especie presentaría algunos compuestos
del tipo flavonoides (Pacheco et al., 1993). Las propiedades farmacológicas estudiadas hasta
ahora destacan por la gran diversidad de acciones atribuidas a esta planta. Por ejemplo la infusión
de las raíces tiene uso como diurético (Hansen et al., 1995). Diversos estudios han demostrado
que las hojas de Gunnera tinctoria poseen actividad anticoagulante y antihipertensiva, este último
efecto debido a la inhibición de la enzima convertidora de angiotensina (Hansen et al., 1995;
12
Rosa de Medeiros et al., 2000). Recientemente se ha determinado que los extractos acuosos de
Gunnera tinctoria presentan una potente actividad antibacteriana contra Helicobacter pylori
dependiente de la concentración del extracto (Pastene et al., 2012).
2.2
Caracterización de flavonoides
Los flavonoides son miembros de una clase de compuestos naturales llamados polifenoles.
Existen principalmente 6 clases de flavonoides con un total de más de 5000 compuestos,
presentando todos un esqueleto hidrocarbonado de 15 átomos de carbono. Esta estructura deriva
de la benzo- γ -pirona con un fenilo en posición 2. De los tres anillos, el A se biosintetiza a través
de la ruta de los poliacetatos y el B y la unidad C3 proceden de la ruta del ácido shikímico (Neira,
2009; Vanaclocha y Cañigueral, 2003).
Los flavonoides están ampliamente distribuidos entre los vegetales superiores, siendo las
Rutaceae, Poyigonaceae, Asteraceae y Apiaceae las principales familias que los contienen.
Abundan en las partes aéreas más jóvenes de la planta y más expuestas al sol, como hojas, frutos
y flores, ya que la luz solar favorece su síntesis (Vanaclocha y Cañigueral, 2003). Se sintetizan
como parte del metabolismo secundario de las mismas y actúan principalmente en la regulación
de genes, el metabolismo y crecimiento de las plantas. Los flavonoides también están implicados
en los mecanismos de respuesta frente al estrés como la radiación UV-B elevada, infecciones
provocadas por microorganismos o ataques de herbívoros (Anouar et al., 2012; Havsteen, 2002;
Rijke et al., 2006).
Farmacológicamente, los flavonoides destacan por su baja toxicidad, presentando en general
actividad protectora de la pared vascular, debido a la disminución de la permeabilidad y al
aumento de la resistencia de los capilares (Vanaclocha y Cañigueral, 2003). Adicionalmente, los
13
flavonoides poseen múltiples actividades biológicas de utilidad para los seres humanos, como por
ejemplo antibacterianos, inhibidores enzimáticos, inmunomoduladores, anticancerígenos, por lo
que su presencia en determinadas plantas les confiere propiedades medicinales (Havsteen, 2002).
Figura 5: Estructura básica de los flavonoides y sistema de numeración
Una de las propiedades más importantes de los flavonoides es su excelente capacidad atrapadora
de radicales libres. Esta característica resulta muy valiosa al momento de evaluar aplicaciones
terapéuticas y profilácticas de los flavonoides, como por ejemplo, después de infecciones,
inflamación, quemaduras o lesiones producidas por radiación (Havsteen, 2002).
Trabajos recientes realizados en la Universidad Austral de Chile han rescatado la búsqueda de
flavonoides como un importante eje de investigación en cuanto a la validación del uso de plantas
medicinales, enfocado principalmente en la investigación en plantas usadas en medicina
tradicional Mapuche (Scheel, 2011; Solís, 2012).
14
2.2.1 Identificación de flavonoides en Laurelia sempervirens y sus propiedades
farmacológicas
En un estudio realizado por Carvajal Navarro (2005) se determinó la presencia de quercetina,
miricetina, rutina y kaempferol en las hojas de Laurelia sempervirens. Otro estudio realizado por
Solís (2012) ratificó la presencia de quercetina en las hojas de esta especie, además de la
identificación de luteolina en esta misma parte de la planta.
Figura 6: Flavonoides de Laurelia sempervirens
La quercetina es un flavonoide del tipo flavonol que ha demostrado ser activa inhibiendo la DNA
topoisomerasa II, la fosfodiesterasa (PDE), la proliferación celular al interferir en la acción de la
proteína p53, la bomba de Ca2+, las tirosinas quinasas, entre otras. Todas estas acciones se
traducen en la observación de efectos analgésicos, antiinflamatorios, antimutagénicos y
antioxidantes, por mencionar algunos (Harwood et al., 2007; Havsteen, 2002).
15
La miricetina es otro flavonol que inhibe la acción de la enzima xantina oxidasa. El
funcionamiento normal de esta enzima provoca un aumento en la producción de radicales libres,
causando con ello daño oxidativo en tejidos isquémicos producto de la reperfusión posterior a un
infarto (Nagao et al., 1999).
La rutina es un glicósido en 3 de la quercetina que incrementa la actividad de la enzima glutatión
peroxidasa (GSH px), previniendo la peroxidación lipídica, ejerciendo efectos antiulcerosos y
antioxidantes (La Casa et al., 2000).
El kaempferol posee como una de sus principales propiedades la elevación de la concentración de
AMPc mediante la inhibición de la fosfodiesterasa (PDE), lo que se relaciona con un efecto
analgésico (Havsteen, 2002). Además, en muchos estudios in vitro se ha analizado el efecto
inductor de la apoptosis de kaempferol, el que puede ser al menos parcialmente atribuible a la
activación producida sobre la vía MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinases) (Chen y Chen,
2013).
La luteolina es una flavona con actividad estrogénica potente a bajas concentraciones, ya que se
pueden unir a receptores estrogénicos (ERs) y activar sus vías de señalización. Sin embargo,
también hay informes que muestran efectos anti-estrogénicos de luteolina. También se ha descrito
que luteolina ejerce efectos anti-inflamatorios a través de la supresión de la producción de
citoquinas proinflamatorias (Lin et al., 2008).
2.2.2 Identificación
de
flavonoides
en
Modiola
caroliniana
y
sus
propiedades
farmacológicas
En el año 2011, Scheel investigó la presencia de flavonoides en las partes aéreas de Modiola
caroliniana, informándose la presencia de compuestos relacionados a flavonoides: glucurónido
16
de quercetina, metoxi-quercetina, metoxi-quercetina ramnosa, derivados de ácido clorogénico y
derivados de apigenina.
Figura 7: Flavonoides de Modiola caroliniana
El glucurónido de quercetina pertenece a un grupo de compuestos que inhiben la modificación
oxidativa de la LDL humana. También posee actividad antioxidante (Moon et al., 2001).
Diversos estudios han mostrado que metoxi-quercetina presenta actividad espasmolítica y
antiinflamatoria (Machado, 2008).
El ácido clorogénico exhibe actividad atrapadora de radicales libres e inhibe la lipooxigenasa
(Yagasaki et al., 2000). En estudios in vitro se ha visto que el ácido clorogénico podría disminuir
el daño en el ADN, como también que inhibe la reacción de N-nitrosación, disminuyendo la
formación de compuestos de N-nitroso que son potencialmente mutagénicos y carcinogénicos
(Olthof et al., 2000).
17
Además de presentar efecto antioxidante, el flavonoide apigenina inhibe la lipogénesis por su
acción moduladora selectiva de los receptores PPAR-γ. También inhibe la formación de células
cancerígenas (García-Pérez et al., 2012; Muñoz Jáuregui y Ramos, 2007).
2.2.3 Identificación de flavonoides en Gunnera tinctoria y sus propiedades farmacológicas
Pacheco en su estudio del año 1993 demostró la presencia de flavonoides en Gunnera tinctoria.
Los flavonoides encontrados fueron: glicósidos de quercetina (quercetina 3-0 arabinósido,
quercetina 3-0 glucogalactósido, quercetina 3-0 digalactósido, quercetina 3-0 diglucósido),
isoramnetina, isoramnetina 3-0 glucósido, glicósidos de flavona y otros compuestos fenólicos.
Figura 8: Flavonoides de Gunnera tinctoria
El flavonoide quercetina 3-O arabinósido, conocido como guajavarina, se cree que puede exhibir
propiedades antiespasmódicas, ya que los extractos de las hojas de la planta en que ha sido
18
aislado, Psidium guajava, muestran este efecto farmacológico probablemente debido a sus
flavonoides (Kadir et al., 2013).
La isoramnetina es un flavonol que presenta actividad antitumoral in vitro, actividad antiadipogénica en tejido adiposo humano, entre otros efectos farmacológicos (Lee et al., 2010; Teng
et al., 2006).
El flavonoide isoramnetina 3-O glucósido, por sus propiedades antioxidantes, podría ser útil en el
tratamiento de las cataratas producidas por la toxicidad inducida por selenito. En estudios in vitro
se ha estudiado que este compuesto contribuiría a la protección de las proteínas del cristalino
mediante el mantenimiento de la actividad de la bomba de calcio ATPasa, la prevención del
estrés oxidativo, acumulación de calcio y la prevención de la peroxidación de lípidos (Gayathri et
al., 2010).
Las referencias revisadas en este estudio nos permiten observar la existencia de diversas
investigaciones realizadas con el fin de determinar la composición química de Laurelia
sempervirens, Modiola caroliniana y Gunnera tinctoria. Sin embargo sólo para las dos primeras
es posible encontrar información actualizada en cuanto a la identificación de flavonoides, siendo
escasos los estudios en este sentido para Gunnera tinctoria. Lo anterior nos lleva a plantearnos la
necesidad de continuar realizando estudios que permitan identificar y cuantificar todos los
compuestos del tipo flavonoides en estas especies, además de otros compuestos fenólicos que
pudieran estar presentes. Esto último, junto con la evaluación de la actividad biológica de
extractos o principios activos de estas especies, permitirá colaborar en la validación del uso de
estas plantas en medicina tradicional.
19
2.3
Hipótesis
De las hojas y ramas de Laurelia sempervirens, de las partes aéreas de Modiola caroliniana y de
las láminas y peciolos de las hojas de Gunnera tinctoria es posible identificar la presencia de al
menos un compuesto de los siguientes grupos de metabolitos: hidratos de carbono, saponósidos,
flavonoides, taninos, heterósidos antraquinónicos, compuestos con núcleo esteroideo, alcaloides.
Los extractos obtenidos de hojas y ramas de Laurelia sempervirens, partes aéreas de Modiola
caroliniana y láminas y peciolos de las hojas de Gunnera tinctoria poseen actividad antioxidante.
Un alto contenido de fenoles totales en los extractos de hojas y ramas de Laurelia sempervirens,
partes aéreas de Modiola caroliniana y láminas y peciolos de las hojas de Gunnera tinctoria se
relaciona con una mayor actividad antioxidante.
Un alto contenido de flavonoides totales en los extractos de hojas y ramas de Laurelia
sempervirens, partes aéreas de Modiola caroliniana y láminas y peciolos de las hojas de Gunnera
tinctoria se relaciona con una mayor actividad antioxidante.
20
2.4
Objetivos
2.4.1 Objetivo general
Identificar los grupos de compuestos mayoritarios presentes en hojas y ramas de Laurelia
sempervirens, partes aéreas de Modiola caroliniana y láminas y peciolos de las hojas de Gunnera
tinctoria, evaluar la capacidad antioxidante de los extractos y determinar el contenido de fenoles
y flavonoides totales.
2.4.2 Objetivos específicos
1. Realizar la recolección de hojas y ramas de Laurelia sempervirens, partes aéreas de
Modiola caroliniana y láminas y peciolos de las hojas de Gunnera tinctoria y procesar el
material vegetal para su posterior utilización.
2. Obtener un extracto crudo de cada una de las especies a estudiar.
3. Fraccionar los extractos obtenidos usando un sistema de partición líquido-líquido.
4. Realizar reacciones fitoquímicas generales a las drogas desecadas.
5. Aislar e identificar los metabolitos secundarios presentes en Laurelia sempervirens,
Modiola caroliniana y Gunnera tinctoria a través de técnicas cromatográficas.
6. Evaluar la capacidad antioxidante de las 3 especies vegetales mediante la realización del
ensayo de DPPH.
7. Determinar la cantidad de fenoles totales y flavonoides totales de los extractos de hojas y
ramas de Laurelia sempervirens, partes aéreas de Modiola caroliniana y láminas y
peciolos de las hojas de Gunnera tinctoria mediante ensayos colorimétricos.
8. Relacionar la actividad antioxidante de las drogas evaluadas con el contenido de fenoles y
flavonoides totales de cada una de ellas.
21
3-
MATERIALES Y MÉTODOS
3.1
Materiales
3.1.1 Material vegetal
-
Hojas y ramas de Laurelia sempervirens.
-
Partes aéreas de Modiola caroliniana.
-
Láminas y peciolos de las hojas de Gunnera tinctoria
3.1.2 Instrumentos
-
Baños termorregulados marca Kioto
-
Baño de ultrasonido marca Kioto
-
Balanza analítica Shimadzu modelo AUX220
-
Balanza gravimétrica marca GP
-
Picadora Sindelen modelo P-123
-
Vórtex marca VELP scientifica
-
Lámpara UV UVP modelo 3UV-34 (254, 302, 365 nm)
-
Centrífuga Boeco modelo M-240
-
Rotavapor IKA®RV 10 basic
-
Espectrofotómetro UV-visible Thermo Sciectific
o Modelo Helios α, espectrofotómetro doble haz UV-Visible, de 190 a 1100 nm, 2 nm
de ancho de banda, con 7 celdas e impresora integrada
-
HPLC-DAD Shimadzu modelo Prominence
o Bomba cuaternaria LC-20AT
o Desgasificador DGU-20A5
22
o Horno CTO-20AC
o Autosampler SIL-20A
o Controlador de sistema CBM-20A.
o Detector de arreglo de diodos SPD-M20A
o Columna C-18 VP-ODS 250L x 4,6, tamaño de partícula 4,6 ± 0,3 μm
o Software LC Solutions ®
3.1.3 Material de laboratorio
Material de vidrio de laboratorio.
Figura 9: HLPC-DAD Shimadzu modelo Prominence, Instituto de Farmacia, Universidad
Austral de Chile
23
Figura 10: Instrumentos utilizados en el laboratorio. Superior izquierda: centrífuga; superior
derecha: espectrofotómetro; inferior: rotavapor.
3.1.4 Reactivos
-
1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH) Sigma
-
Acetato de etilo grado HPLC Merck
-
Acetato de plomo Merck
-
Ácido clorhídrico (HCl) Merck
-
Ácido gálico p.a. Merck
-
Ácido nítrico (HNO3) Merck
-
Ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado Merck
-
Ácido trifluoroacético (TFA) Merck
-
Agua desionizada
24
-
Agua destilada
-
Amoníaco (NH3) Merck
-
Anhídrido acético caliente Merck
-
Antrona en medio sulfúrico Merck
-
Carbonato de sodio Merck
-
Cloroformo Merck
-
Cloruro de aluminio al 2% Merck
-
Diclorometano grado HPLC Merck
-
Etanol grado HPLC Merck
-
Éter de petróleo grado HPLC Merck
-
Éter Merck
-
Fehling A: sulfato de cobre
-
Fehling B: tartrato de sodio y potasio en medio alcalino
-
Magnesio metálico
-
Metanol grado HPLC Merck
-
Quercetina p.a. Merck
-
Reactivo de Folin-Ciocalteu Merck
-
S.R. Bouchardat Merck
-
S.R. Cloruro férrico (FeCl3) Merck
-
S.R. Dragendorff Merck
-
S.R. Silicotúngstico Sigma
-
Sulfato de sodio (Na2SO4) anhidro Merck
25
3.2
Metodología
3.2.1 Recolección material vegetal
Las hojas y ramas de Laurelia sempervirens fueron recolectadas en septiembre del año 2012, en
la ciudad de Valdivia, en las dependencias del Arboretum, perteneciente a la Facultad de Ciencias
Forestales y Recursos Naturales de la Universidad Austral de Chile (39° 48' S 73° 16' O).
Las partes aéreas de Modiola caroliniana fueron recolectadas en septiembre del año 2012 en la
ciudad de Chillán, en los jardines de la Universidad de Concepción, sede Chillán (36° 36' S 72°
5' O).
Las láminas y peciolos de las hojas de Gunnera tinctoria fueron recolectadas en noviembre del
año 2012 en la playa La Misión, ubicada en el camino Niebla–Curiñanco, comuna de Valdivia
(39° 48' S 73° 24' O).
3.2.2 Procesamiento material vegetal
Las hojas y ramas de Laurelia sempervirens fueron secadas en estufa a una temperatura promedio
de 45ºC durante 30 horas. Luego hojas y ramas fueron separadas, pulverizadas y almacenadas en
bolsas independientes.
Las partes aéreas de Modiola caroliniana fueron secadas en estufa a una temperatura promedio
de 50ºC durante 48 horas. La planta fue pulverizada sin realizar separaciones entre tallos y hojas.
Las láminas de las hojas de Gunnera tinctoria debido a su gran tamaño fueron picadas
manualmente antes de introducirlas al horno. Éstas se secaron en estufa a una temperatura
promedio de 50ºC durante 60 horas. Luego las nervaduras fueron separadas de la hoja y el resto
fue pulverizado. Los peciolos de las hojas de Gunnera tinctoria una vez desprovistos de las
26
cubiertas fueron cortados en rebanadas de entre 1-2 cm de grosor. Las cubiertas se secaron en
estufa a una temperatura promedio de 50ºC durante 60 horas. Por otro lado la parte comestible
del peciolo fue secada a temperatura ambiente por aproximadamente 2 semanas. Tanto las
cubiertas como la parte comestible del peciolo fueron pulverizadas o trituradas en pequeños
trozos.
Figura 11: Material vegetal utilizado. Izquierda: hojas y ramas de Laurelia sempervirens;
derecha: peciolos comestibles de Gunnera tinctoria
Según lo anterior, el material vegetal total se dividió de la siguiente manera:
-
Hojas de Laurelia sempervirens
-
Ramas de Laurelia sempervirens
-
Partes aéreas de Modiola caroliniana
-
Láminas de hojas de Gunnera tinctoria
-
Cubierta de peciolos de Gunnera tinctoria
-
Peciolos comestibles de Gunnera tinctoria
27
3.2.3 Reacciones fitoquímicas generales
La batería de reacciones fitoquímicas realizada es la misma para las 3 especies vegetales y para
cada una de las distintas partes de las plantas a investigar. Para todos ellos se utilizó la droga seca
pulverizada.
3.2.3.1 Identificación de hidratos de carbono
a) Antrona en medio sulfúrico: a una alícuota de solución extractiva acuosa de la droga se agrega
1 mL de reactivo de antrona. Con esta reacción se identifican todo tipo de azúcares. Al calentar
carbohidratos en presencia de un ácido fuerte (ácido sulfúrico) estos resultan hidrolizados y
posteriormente deshidratados, formando derivados del furano. La antrona (9,10-dihidro-9cetoantraceno) reacciona con estos derivados produciendo compuestos de color verde, que
presentan un máximo de absorción a 620 nm (Bolaños et al., 2003; Domínguez, 1973).
b) Reactivo de Molisch: a la solución acuosa de la droga adicionar gotas del reactivo de Molisch
y 1 mL de ácido sulfúrico. De manera similar a lo que ocurre en la reacción con antrona, α-naftol
reacciona con los derivados del furano producidos por la adición de ácido sulfúrico en la
reacción, generando complejos de color morado (Domínguez, 1973; Quesada, 2007).
c) Licor de Fehling: en un tubo de ensayo agregar la solución acuosa de la droga, alícuotas de las
soluciones Fehling A y Fehling B en partes iguales y calentar a la llama del mechero. Esta
determinación es una reacción redox que se basa en el poder reductor del grupo carbonilo de un
aldehído (de los azúcares). El aldehído se oxida a ácido y reduce la sal de cobre en medio alcalino
a óxido de cobre formando un precipitado de color rojo (Jerez, 2008). La reacción con licor de
Fehling es una reacción de óxido-reducción y como tal puede necesitar la adición de energía para
producirse, y esta energía podría ser agregada en forma de calor (Dickerson, 1993).
28
3.2.3.2 Identificación de gomas y mucílagos:
Al extracto acuoso de la muestra se le agregan 3 volúmenes de etanol. Las gomas y mucílagos
son polisacáridos presentes en los exudados de los vegetales que se caracterizan por ser altamente
solubles en agua e insolubles en alcohol, por lo cual la adición de etanol a una solución acuosa
provocará la precipitación de estos compuestos (Domínguez, 1973).
3.2.3.3 Identificación de saponósidos
Los saponósidos son glucósidos en los cuales la aglicona consiste en un núcleo esteroidal o
triterpénico; característica en su estructura les confiere propiedades como anfótero,
permitiéndoles actuar como tensioactivos. La agitación del líquido extractivo acuoso de la droga
provocará la formación de espuma abundante con apariencia de panal de abeja, la que persistirá
por al menos 30 minutos (Domínguez, 1973; Carvajal et al., 2009).
3.2.3.4 Identificación de taninos
Estos polifenoles tienen la propiedad de formar complejos con metales pesados. La muestra debe
ser extraída con agua. A continuación se deben añadir gotas de cloruro férrico a la muestra. Una
formación de color indica la presencia de taninos debido a la formación de complejos coloreados:
el color azul-negro indica la presencia de taninos pirogálicos mientras que un color verde nos
señala la presencia de taninos catéquicos (Carvajal et al., 2009; Falcão y Araújo, 2011).
3.2.3.5 Identificación de flavonoides mediante la reacción de la cianidina
El extracto etanólico de la droga es puesto en un tubo de ensayo, se adiciona magnesio en polvo.
Seguidamente se adiciona ácido clorhídrico concentrado, gota a gota, hasta observar burbujeo y
aparición de diversas coloraciones, según el tipo de flavonoide: anaranjado para flavonas, rojo
cereza para flavonoles y rojo violeta para flavanonas.
29
En esta reacción, el magnesio metálico es oxidado por el ácido clorhídrico concentrado, dando
como productos hidrógeno molecular y cloruro de magnesio, y este último es el que forma
complejos con los flavonoides dando coloraciones características (Carvajal et al., 2009; Ruíz et
al., 2010).
Mg 0 + 2 HCl (con)
MgCl2 + H2
3.2.3.6 Identificación de heterósidos antraquinónicos: Reacción de Bornträger
En esta prueba la droga se extrae con éter o cualquier disolvente orgánico inmiscible con el agua.
El extracto etéreo filtrado se alcaliniza con soda cáustica o amoniaco, con ello la capa acuosa
muestra, después de la agitación, colores rosa, rojo o violeta. La prueba de Bornträger es negativa
en caso de antranoles (formas reducidas). En este caso se debe ebullir por algunos minutos la
droga con agua acidulada con ácido nítrico, enfriar y agotar con solvente orgánico, decantar y en
caso necesario filtrar. En la fase orgánica que contiene las geninas se practica la reacción de
Bornträger (Domínguez, 1973; Prakashan, 2008).
La reacción de Bornträger produce una coloración roja cuando el hidróxido de sodio reacciona
con uno de los grupos hidroxilo de las antraquinonas. La coloración depende de la cantidad de
electrones deslocalizados en movimiento (Ruíz et al., 2010).
3.2.3.7 Identificación de derivados del núcleo esteroideo: Reacción de Liebermann
La reacción de Liebermann es típica de esteroides o triterpenos, los que presentan insaturaciones
en los anillos A, B o C. La muestra se extrae con diclorometano o cloroformo y se trata con
sulfato de sodio anhidro para eliminar el agua de la muestra. Luego de esto la solución es
evaporada a baño maría y el residuo es solubilizado en anhídrido acético caliente. Las moléculas
30
de agua reaccionan con el anhídrido acético, por ello se debe evitar al máximo la presencia de
ésta. Finalmente se agregan a la solución gotas de ácido sulfúrico concentrado. El ácido sulfúrico
favorece la deficiencia electrónica del anhídrido acético, el cual es estabilizado por los electrones
de los dobles enlaces (dienos) conjugados de los esteroides. La etapa inicial de la reacción
consiste en la protonación del grupo OH de los esteroles, con la consiguiente pérdida de agua
obteniéndose un ión carbonio. La oxidación secuencial de este ión carbonio alílico por el anión
SO2- produce la aparición de cromóforos que pueden ser detectados por espectrofotometría UVvis (Domínguez, 1973; Véjar, 2005; Vidaurre et al., 2007).
La aparición de compuestos coloreados comienza como un color rosa violáceo y progresa a
través de un verde claro y luego de color verde muy oscuro. El color es debido a que el grupo
hidroxilo (-OH) de los esteroles reacciona con los reactivos e incrementa la conjugación de la
insaturación en el anillo fusionado adyacente. En presencia de un derivado esteroídeo (ciclo
pentanoperhidro-fenantreno) se desarrolla un color verde. En presencia de compuestos
triterpénicos se desarrolla color rosado (Burke et al., 1974; Domínguez 1973).
3.2.3.8 Identificación de alcaloides en drogas vegetales
Los alcaloides son compuestos de estructura compleja y muy diversa; se caracterizan por
presentar moléculas de nitrógeno (y generalmente también de oxígeno) en su estructura lo que les
confiere un carácter básico. En la naturaleza los podemos encontrar en forma de bases libres o
formando sales, lo que les confiere distintas propiedades en cuanto a solubilidad. Las bases
alcaloideas son solubles en solventes orgánicos como cloroformo o diclorometano, en cambio las
sales son solubles en medio acuoso. Para realizar la extracción de alcaloides se trata directamente
la droga en polvo con un solvente orgánico en medio alcalino, esto implica agregar a la solución
31
gotas de amoniaco u otro compuesto básico para asegurar que la totalidad de los alcaloides
presentes en la muestra se encuentren en estado de base. Luego se evapora el solvente a baño
maría y el residuo se solubiliza con gotas de ácido clorhídrico. En esta solución se practican las
reacciones generales de alcaloides. Los alcaloides forman sales dobles con compuestos de
mercurio, oro, bismuto, platino y yodo. Estas sales alcaloideas formadas en medio acuoso son
insolubles, por lo que forman precipitados característicos:
a) S.R. Dragendorff: precipitado pardo anaranjado
b) S.R. Bouchardat: precipitado pardo anaranjado
c) S.R. Silicotúngstico: precipitado blanco (Domínguez, 1973; Gennaro, 2003)
En la tabla 1 se resumen las reacciones realizadas para la identificación de diversos grupos de
metabolitos presentes en vegetales y los resultados esperados en cada una de ellas.
32
Tabla 1: Reacciones fitoquímicas realizadas a las drogas en análisis, metabolitos buscados y
resultados esperados en cada una de ellas
Ensayos
Metabolitos buscados
Resultado positivo
Antrona en medio sulfúrico
Todo tipo de azúcares
Anillo verde en la interfase
Reactivo de Molisch
Azúcares reductores y no
reductores
Anillo violeta en la interfase
Licor de Fehling
Azúcares reductores
Precipitado rojo
Reacción con etanol
Gomas y mucílagos
Precipitado blanco gelatinoso
Reacción de espuma
Saponinas
Espuma abundante y persistente
Reacción con FeCl3
Taninos
Coloración azul negro o verde
Reacción de la cianidina
Flavonoides
Coloración anaranjada, rojo
cereza o rojo violáceo
Reacción de Bornträger
Heterósidos antraquinónicos
Fase acuosa roja o rosada
Reacción de Liebermann
Derivados del núcleo esteroideo
Color verde o rosado
S.R. Dragendorff
Alcaloides
Precipitado pardo anaranjado
S.R. Bouchardat
Alcaloides
Precipitado pardo anaranjado
S.R. Silicotúngstico
Alcaloides
Precipitado blanco
33
3.2.4 Obtención del extracto metanólico
Prácticamente todos los componentes de interés fitoquímico presentan alguna solubilidad en
mezclas de etanol o metanol al 80%, de tal modo que estas se utilizan con mucha frecuencia en la
extracción de principios activos (Álvarez y Bagué, 2012). La utilización de un rotavapor permite
la evaporación del solvente, en este caso metanol, para obtener un extracto puro. La preparación
de un extracto metanólico permitirá realizar ensayos como cromatografía en capa fina y
determinación de compuestos a través de HPLC.
Para la obtención de los extractos metanólicos se pesaron 150 g de cada droga en vasos de
precipitados y se les agregó metanol en volúmenes variables, esto según el volumen ocupado por
cada droga para que el material vegetal quede completamente cubierto por el solvente. Se dejó
macerar durante 2 días a temperatura ambiente y protegido de la luz solar. Una vez transcurrido
ese tiempo se procedió al filtrado. Las soluciones obtenidas fueron concentradas hasta sequedad
en rotavapor a presión reducida a 40° C durante tiempo necesario para obtener un extracto denso.
Los volúmenes de metanol y las cantidades obtenidas de cada extracto se expresan en la Tabla 2.
Tabla 2: Cantidad de extracto y rendimiento obtenido para cada droga
Fracción
Extracto obtenido (g)
Rendimiento (%)
Hojas Laurelia sempervirens
9,7470
6,498
Ramas Laurelia sempervirens
9,1507
6,100
Partes aéreas Modiola caroliniana
4,2701
2,847
Láminas hojas Gunnera tinctoria
15,4901
10,327
Cubierta peciolo Gunnera tinctoria
19,2001
12,800
Peciolo comestible Gunnera tinctoria
20,6819
13,788
34
3.2.5 Fraccionamiento líquido-líquido
El procedimiento para realizar el fraccionamiento de los extractos se basa en la metodología
clásica de fraccionamiento por polaridad de solvente. El fraccionamiento o extracción líquidolíquido consiste en separar una o varias sustancias disueltas en un disolvente mediante su
transferencia a otro disolvente insoluble, o parcialmente insoluble, en el primero. La transferencia
de materia se consigue mediante el contacto directo entre las dos fases líquidas. Una de las fases
es dispersada en la otra para aumentar la superficie interfacial y aumentar el caudal de materia
transferida (Valcárcel y Gómez, 1988).
Los extractos metanólicos fueron resuspendidos en su totalidad en 50 mL de solución
metanol/agua en proporción 9:1, esto es 45 mL de metanol y 5 mL de agua. Estas soluciones
fueron vertidas en embudos de decantación. Se realizaron 2 extracciones sucesivas con 50 mL de
éter de petróleo (EP). Luego de cada adición de solvente se agitaron enérgicamente las soluciones
y se dejó decantar hasta lograr la completa separación de las fases. Las fracciones de EP fueron
recolectadas en matraces Erlenmeyer de 200 mL. Una vez recolectadas las fracciones del primer
solvente nuevamente se depositaron las fases hidroalcohólicas en embudos de decantación.
Luego se realizaron 2 extracciones sucesivas con 50 mL de diclorometano (DCM). Se agitaron
enérgicamente las soluciones y se dejó decantar. En esta fase del fraccionamiento fue necesaria la
adición de un volumen de agua, en este caso se agregaron 10 mL en cada embudo y en las
fracciones de hojas de Laurelia sempervirens y partes aéreas de Modiola caroliniana se agregó 5
mL extra de agua, esto para lograr la completa separación de las fases. Las fracciones de DCM
fueron depositadas en matraces Erlenmeyer de 200 mL. Acabado este proceso se depositaron
nuevamente las fases hidroalcohólicas en embudos de decantación y se realizó una extracción con
50 mL de acetato de etilo. Se agitaron fuertemente las soluciones y se dejó decantar. En esta
35
etapa también fue necesario agregar agua para facilitar la separación, por lo cual se adicionaron 5
mL de agua a cada fracción. Las fracciones de acetato de etilo fueron depositadas en matraces
Erlenmeyer de 200 mL al igual que las fracciones hidroalcohólicas. Finalmente las fracciones
obtenidas fueron concentradas hasta sequedad en rotavapor a presión reducida a 40° C durante
tiempo necesario para obtener un extracto denso (Sarker et al., 2009).
Cada una de las fracciones fue identificada con un número, como una manera de evitar
confusiones. La asignación numérica a cada una de las fracciones es la siguiente:
-
Hojas de Laurelia sempervirens
(1)
-
Ramas de Laurelia sempervirens
(2)
-
Partes aéreas de Modiola caroliniana
(3)
-
Láminas de hojas de Gunnera tinctoria
(4)
-
Cubierta de peciolos de Gunnera tinctoria (5)
-
Peciolos comestibles de Gunnera tinctoria (6)
Además, a cada fracción proveniente de la extracción líquido-líquido le fue asignado un código
relacionado con el solvente utilizado:
-
Fracción éter de petróleo
(EP)
-
Fracción diclorometano
(D)
-
Fracción acetato de etilo
(AE)
-
Fracción metanol
(M)
Según esto, después del fraccionamiento por polaridad de solventes se obtuvieron 24 extractos
diferentes, los cuales fueron analizados mediante técnicas cromatográficas.
36
Material vegetal seco
pulverizado 150 g
Metanol
Macerar durante 48 horas
Filtrar
Concentrar en rotavapor
Extracto metanólico crudo
Resuspender 50 mL metanol /agua 9:1
Fracción metanólica
50 mL éter de petróleo (en duplicado)
Fracción éter de petróleo
Fracción metanólica
(refinada)
50 mL diclorometano (en duplicado)
Agua en cantidad necesaria
Fracción diclorometano
Fracción metanólica
(refinada)
50 mL acetato de etilo
Agua en cantidad necesaria
Fracción acetato de etilo
Fracción metanólica
(refinada)
Figura 12: Esquema de obtención de extracto metanólico crudo y posterior fraccionamiento
líquido-líquido
37
3.2.6 Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC)
La cromatografía es un método de separación de compuestos, donde la separación se puede
realizar por diferencias en tamaño de partículas, polaridad, entre otros. La palabra cromatografía
deriva del griego chroma que significa color y graphein que significa escribir. Existen muchas
técnicas cromatográficas, pero todas ellas comparten un principio común. En todas existe una
fase móvil que transporta la muestra analizada, haciéndola pasar a través de una fase estacionaria
que es inmiscible con la fase móvil. Según esto, la muestra puede adherirse a la fase estacionaria
o eluir junto a la fase móvil según sus características físico-químicas y la afinidad con las mismas
(Skoog et al., 2001).
La cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) es un tipo de cromatografía donde la fase
móvil es un líquido. La fase móvil debe eluir a través de una columna muy delgada rellena con
sílica que constituye la fase estacionaria. Para favorecer la salida de los compuestos la fase móvil
debe ser bombeada a altas presiones (Sierra et al., 2010). La técnica HPLC permitió la separación
de algunos de los principales componentes de la droga analizada. Para este análisis se siguió la
metodología desarrollada por Scheel (2011) y Solís (2012), los cuales después de diversas
pruebas decidieron utilizar los extractos de acetato de etilo y metanol para la determinación de
flavonoides.
3.2.6.1 Cromatografía líquida de alta eficiencia con detector de arreglo de diodos (HPLCDAD)
La cromatografía que se utilizó es la denominada “cromatografía en fase reversa”, que consiste
en una fase estacionaria apolar (un hidrocarburo) y una fase móvil de polaridad moderada (agua,
metanol, acetonitrilo). En este tipo de cromatografía se busca que los compuestos apolares se
38
adhieran mayormente a la columna para favorecer la separación de los compuestos polares, los
que eluyen más rápidamente. Para que la muestra no quede atrapada eternamente en la columna
es necesario agregar un solvente orgánico miscible con el agua (Cartaya y Reynaldo, 2001).
La fase estacionaria corresponde a micropartículas de octadecilsilano, moléculas de sílica
modificadas con hidrocarburos de 18 átomos de carbono (columna C-18). La columna usada
corresponde a una columna analítica marca Shimadzu, modelo VP-ODS de dimensiones 250 x
4,6 mm, con un tamaño de partícula de 4,6 ± 0,3 µm.
La fase móvil utilizada está formada por dos sistemas: fase móvil A ácido trifluoroacético 0,1%
en agua (TFA 0,1%) y fase móvil B metanol. El tipo de elución fue por gradiente, es decir, los
distintos analitos fueron eluídos con variaciones en los porcentajes en la composición de las fases
móviles. El flujo programado para la elución de la fase móvil fue 1,2 mL/min, a una temperatura
de 30°C y cada corrida tuvo una duración de 60 minutos. La composición de la fase móvil se
detalla en la tabla 3.
Tabla 3: Fase móvil utilizada para el análisis de extractos por HPLC-DAD de elución por
gradiente, con las correspondientes variaciones en los porcentajes de cada fase según el tiempo
de corrida
Fase móvil/
Tiempo
Minuto
0
Minuto
20
Minuto
30
Minuto
40
Minuto
45
Minuto
55
Minuto
60
Fase móvil A
TFA 0,1%
90
60
30
0
0
90
90
Fase móvil B
metanol
10
40
70
100
100
10
10
39
El detector utilizado fue SPD-M20A detector de arreglo de diodos, programado para obtener
cromatogramas entre los 190 y 900 nm. Este tipo de equipos permite hacer un cromatograma a lo
largo de estas longitudes de onda, recogiendo el espectro de los analitos detectados a intervalos
de 1 nm (cromatografía tridimensional) (Skoog et al., 2001). La detección de compuestos fue
realizada a tres diferentes longitudes de onda: 253, 265 y 354 nm.
Las fracciones seleccionadas para el análisis fueron tratadas de la siguiente manera: se tomaron
alícuotas de 80 µL de extracto concentrado, se depositaron en tubos Eppendorf y se solubilizaron
con 720 µL de metanol para lograr una dilución al 10%. Se agitaron los tubos con ayuda de un
vórtex y se introdujeron en una centrífuga donde se mantuvieron las muestras por 7 minutos a
una velocidad de 14000 RPM y 18620 G. Del sobrenadante obtenido se tomaron alícuotas de 600
µL, las que fueron depositados en viales ámbar.
En una segunda etapa de análisis, las fracciones fueron tratadas de la misma manera, con la
diferencia que de las soluciones diluidas al 10% se tomaron alícuotas finales de 200 µL y se
adicionó en cada muestra una alícuota de 20 µL de un pool de estándares de flavonoides de
concentración 40 µg/mL. Los estándares presentes en el pool agregado fueron quercetina,
kaempferol, pinocembrina, crisina y galangina. Antes de realizar la co-inyección de muestras y
estándares se determinaron los tiempos de retención de los flavonoides presentes en el pool
respecto a la fase móvil descrita en la metodología.
40
3.2.7 Determinación de fenoles totales
Para esta determinación se utilizó el método de Folin-Ciocalteu. Este método se basa en la
capacidad de los fenoles para reaccionar con agentes oxidantes. El reactivo de Folin-Ciocalteu
contiene molibdato y tungstato sódico, que reaccionan con cualquier tipo de fenol, formando
complejos fosfomolíbdico-fosfotúngstico. La transferencia de electrones a pH básico reduce los
complejos fosfomolíbdico-fosfotúngstico en óxidos, cromógenos de color azul intenso, de
tungsteno (W8O23) y molibdeno (Mo8O23), siendo proporcional este color al número de grupos
hidroxilo de la molécula (Gutiérrez, 2008).
La preparación de un extracto etanólico permitió la determinación cuantitativa de algunos
metabolitos presentes en las drogas, los que fueron encontrados gracias a las pruebas de
identificación fitoquímica. Este extracto también fue utilizado en la determinación de flavonoides
totales. Para su preparación se pesó en balanza analítica sobre vidrio reloj 1 g de cada una de las
drogas secas y pulverizadas. Luego fueron agregadas dentro de matraces Erlenmeyer de 200 mL,
adicionando sobre ellas 20 mL de etanol al 80%. Se aplicó ultrasonido por 30 min (el sonicador
debe estar seteado a 60º C) y se filtró por papel. Se llevaron las soluciones a matraces aforados de
25 mL y se completaron a volumen con etanol 80% (Lock, 2006).
Se tomó una alícuota de 150 µL de cada una de las soluciones extractivas etanólicas y se
agregaron a tubos de ensayo. Se adicionaron 2,4 mL de agua y 300 µL de reactivo FolinCiocalteu. Se agitaron enérgicamente y dejaron reposar por 8 min. Luego se agregaron 150 µL de
carbonato de sodio al 20%. El blanco contiene todos los reactivos a excepción de la muestra, la
que fue remplazada por agua destilada. Se dejaron los tubos con las muestras y el blanco en
oscuridad por 1 hora. La absorbancia fue leída a 760 nm. Los resultados se expresaron como mg
41
equivalentes de ácido gálico por cada 100 gramos de droga. La curva de calibración debe ser
entre 50-500 µg/mL de ácido gálico (Palomino y Lady, 2009).
3.2.8 Determinación de flavonoides totales
Para esta determinación se utilizó el método colorimétrico de cloruro de aluminio. En esta prueba
los flavonoides reaccionan con el cloruro de aluminio en etanol produciendo un complejo de
color amarillo que posee un pico de absorción de luz a 420-425 nm (Manrique, 2008).
Se tomaron alícuotas de 2 mL de soluciones extractivas etanólicas y se agregaron en tubos de
ensayo. Se adicionaron 2 mL de cloruro de aluminio al 2% (en etanol) en cada tubo. Se agitaron
las soluciones. El blanco contiene todos los reactivos a excepción de la muestra, la que fue
remplazada por agua destilada. Se dejaron las muestras y el blanco durante 1 hora en incubación
a temperatura ambiente. La absorbancia se leyó a 420 nm. Los resultados se expresaron como mg
equivalentes de quercetina por cada 100 gramos de droga. La curva de calibración debe ser entre
5 – 25 µg/mL de quercetina (Palomino y Lady, 2009).
3.2.9 Evaluación actividad biológica
3.2.9.1 Evaluación capacidad antioxidante mediante ensayo con DPPH
La sustancia 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH) es una especie de radical orgánico estable. El
ensayo de DPPH oxidativo se utiliza en todo el mundo en la cuantificación de la capacidad
atrapadora de radicales libres (FRS). La solución alcohólica de DPPH es de color morado oscuro
con un pico de absorción a 517 nm. Este ensayo se basa en el principio de que el DPPH acepta un
átomo de hidrógeno de la molécula antioxidante. Esto resulta en una reducción de DPPH a
DPPH2 y en un cambio de color púrpura a amarillo. El cambio de color se controla por
espectrofotometría y se utiliza para la determinación de parámetros de propiedades antioxidantes.
42
La capacidad de los reactivos biológicos para captar el radical DPPH se puede expresar como la
magnitud de la capacidad antioxidante. Comparado con otros métodos, el ensayo de DPPH tiene
muchas ventajas, tales como buena estabilidad, sensibilidad creíble, la simplicidad y la viabilidad
(Deng et al., 2011; Mishra et al., 2012).
Para este ensayo se utilizó una solución DPPH de concentración 20 mg/L, las concentraciones de
los extractos a evaluar fueron de 1 mg/mL y 0,5 mg/mL. Todas estas soluciones fueron
preparadas con metanol.
Se tomaron alícuotas de 1,5 mL de solución de DPPH, se agregaron 750 μL de soluciones de los
extractos a evaluar. Se mezcló bien, se esperó 10 minutos y se midió la absorbancia de la mezcla
a 517 nm. Se realizó cada una de las reacciones en triplicado. El blanco fue preparado en las
mismas condiciones, pero en lugar de extractos se agregó 750 μL de agua desionizada.
El porcentaje de inhibición se calculó de la siguiente manera:
Como solución patrón se utilizó ácido ascórbico. Para realizar la curva de calibración se
prepararon soluciones de ácido ascórbico de 4, 6, 8 y 10 μg/mL en metanol y se siguió el mismo
tratamiento de las muestras a evaluar, esto es a 1,5 mL de solución de DPPH se agregó 750 μL de
cada una de las soluciones de ácido ascórbico. Se mezcló y luego de 10 minutos se midió la
absorbancia de las mezclas a 517 nm.
43
4-
RESULTADOS
4.1
Identificación de metabolitos secundarios
4.1.1 Ensayos fitoquímicos generales
La ejecución de estos ensayos permitió dilucidar la presencia o ausencia de ciertos grupos de
metabolitos en las drogas analizadas. Se pudo identificar la presencia de hidratos de carbono,
taninos, flavonoides y esteroides para todas las plantas analizadas.
En la prueba de la cianidina realizada en extractos de hojas y ramas de Laurelia sempervirens y
en partes aéreas de Modiola caroliniana los resultados fueron difíciles de evidenciar debido a la
alta pigmentación de los extractos. Aunque en los extractos antes mencionados no fue posible
distinguir las coloraciones características de este ensayo, se consideró como resultado positivo el
cambio de color de verde intenso a café anaranjado. Esta observación explica los resultados
positivos para todos los extractos evaluados.
El resumen de los resultados se muestra en la Tabla 4.
44
Tabla 4: Resumen de los resultados obtenidos en las reacciones fitoquímicas realizadas en
extractos de hojas y ramas de Laurelia sempervirens, de partes aéreas de Modiola caroliniana y
de láminas y peciolos de hojas de Gunnera tinctoria. Simbología: (++) positivo, (+) positivo con
observaciones, (-) negativo
Ensayos
Antrona en
medio sulfúrico
Reactivo de
Molisch
Hojas
Ramas
Laurelia
Laurelia
sempervirens sempervirens
Partes
Láminas de
aéreas
hojas
Modiola
Gunnera
caroliniana tinctoria
Cubierta
peciolo
Gunnera
tinctoria
Peciolo
comestible
Gunnera
tinctoria
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
–
++
–
–
–
–
–
–
–
++
++
++
++
++
++
+
+
+
++
++
++
++
++
++
–
–
++
++
++
++
++
++
++
S.R. Dragendorff
–
–
–
–
–
–
S.R. Bouchardat
–
–
–
–
–
–
S.R.
Silicotúngstico
–
–
–
–
–
–
Licor de Fehling
Reacción con
etanol
Reacción de
espuma
Reacción con
FeCl3
Reacción de la
cianidina
Reacción de
Bornträger
Reacción de
Liebermann
45
Figura 13: Reacción antrona en medio sulfúrico
Izquierda: control positivo almidón maíz
Derecha: partes aéreas M. caroliniana
Figura 14: Reacción con reactivo Molisch
Izquierda: control positivo almidón maíz
Derecha: cubierta peciolos G. tinctoria
Figura 15: Reacción con licor de Fehling
Izquierda: control positivo almidón maíz
Derecha: ramas L. sempervirens
Figura 16: Reacción con etanol
Izquierda: control positivo goma
Derecha: partes aéreas M. caroliniana
Figura 17: Reacción con FeCl3
Izquierda: control positivo Camellia sinensis
Derecha: peciolo comestible G. tinctoria
Figura 18: Reacción de la cianidina
Izquierda: control positivo Matricaria
chamomilla
Derecha: peciolo comestible G. tinctoria
46
Figura 19: Reacción de Bornträger
Izquierda: control positivo Aloe sp.
Derecha: hojas L. sempervirens
Figura 20: Reacción de Liebermann
Izquierda: control positivo Digitalis sp.
Derecha: lámina hojas G. tinctoria
4.1.3 Identificación de flavonoides por cromatografía líquida de alta eficiencia con
detector de arreglo de diodos (HPLC-DAD)
Los trabajos realizados por Scheel (2011) y Solís (2012) en relación a la investigación de
flavonoides en extractos de Modiola caroliniana y de Laurelia sempervirens respectivamente,
consideraron la utilización de las fracciones acetato de etilo y metanol. Se resuelve continuar con
la metodología planteada por estos dos autores para las especies señaladas, ampliándose a las
fracciones acetato de etilo y metanólicas obtenidas de los extractos lámina de hojas, cubierta de
peciolos y peciolo comestible de Gunnera tinctoria.
La técnica cromatográfica usada favoreció la elución de compuestos polares. El sistema de
gradientes permitió que los metabolitos fueran adecuadamente resueltos, eluyendo los
compuestos más importantes entre los 20 y 40 minutos de corrida. Cada color de los
cromatogramas representa tres diferentes longitudes de onda: rojo 253 nm, verde 265nm y azul
354 nm. A continuación se presentan los cromatogramas más representativos.
47
Figura 21: Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 5 µL fracción AE4, canales de
absorbancia 253, 265, 354 nm, tiempo de corrida 60 minutos.
Figura 22: Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 20 µL fracción M4, canales de
absorbancia 253, 265, 354 nm, tiempo de corrida 60 minutos.
48
Figura 23: Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 5 µL fracción AE5, canales de
absorbancia 253, 265, 354 nm, tiempo de corrida 60 minutos.
Figura 24: Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 20 µL fracción M5, canales de
absorbancia 253, 265, 354 nm, tiempo de corrida 60 minutos.
49
Paralelamente se realizó una corrida con un pool estándares de flavonoides bajo las mismas
condiciones antes mencionadas, lo que permitió obtener los tiempos de retención de los
flavonoides del pool utilizado. Los estándares eluyeron entre los 30 y 40 minutos.
Figura 25: Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 5 µL estándares de flavonoides
diluidos al 10%, canal de absorbancia 354 nm, tiempo de corrida 60 minutos.
Figura 26: Tabla de picos obtenidos en el análisis por HPLC-DAD de estándares de flavonoides
diluidos al 10% con sus correspondientes tiempos de retención, área y altura de los picos
50
Figura 27: Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 5 µL estándares de flavonoides
diluidos al 10%, canal de absorbancia 354 nm, tiempo de corrida 60 minutos, con la
identificación del compuesto correspondiente a cada pico de absorbancia
Posteriormente se realizaron co-inyecciones de las fracciones analizadas y el pool de estándares,
empleando para ello soluciones en proporción 10:1 muestra: pool de estándares. Los resultados
de cada una de las co-inyecciones fueron contrastados con los cromatogramas obtenidos de las
muestras sin estándares agregados. Para la identificación de flavonoides se comprobaron los
tiempos de retención de los compuestos obtenidos de los cromatogramas de las muestras con
estándares y sin ellos. También se realizó un contraste visual de los cromatogramas, el que se
expresó gráficamente por medio de la superposición de los cromatogramas correspondientes por
métodos computacionales. Como lo muestran los siguientes cromatogramas, sólo fue posible
observar aumento de algunos picos en las fracciones acetato de etilo y metanol de lámina de hoja
y de la cubierta del peciolo de Gunnera tinctoria.
51
En la fracción de acetato de etilo de láminas de hojas de Gunnera tinctoria fue posible identificar
los flavonoides quercetina y kaempferol. En tanto en la fracción metanólica de láminas de hojas
de Gunnera tinctoria y en las fracciones acetato de etilo y metanol de cubierta de peciolo de esta
misma planta sólo se pudo identificar el flavonoide quercetina. Los colores de cada
cromatogramas representan la superposición de 2 cromatogramas de una misma fracción: el color
naranjo corresponde a la muestra pura evaluada a 365 nm, en tanto el color azul corresponde a la
muestra más los estándares de flavonoides evaluados a la misma longitud de onda. Los
cromatogramas de dichas fracciones se exponen a continuación.
Figura 28: Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 20 µL fracción AE4: estándares
de flavonoides en proporción 10:1, canal de absorbancia 354 nm, tiempo de corrida 60 minutos.
Superposición de cromatogramas: naranjo muestra AE4, azul muestra AE4 + estándares.
52
Figura 29: Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 20 µL fracción M4: estándares de
flavonoides en proporción 10:1, canal de absorbancia 354 nm, tiempo de corrida 60 minutos.
Superposición de cromatogramas: naranjo muestra M4, azul muestra M4 + estándares.
Figura 30: Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 20 µL fracción AE5: estándares
de flavonoides en proporción 10:1, canal de absorbancia 354 nm, tiempo de corrida 60 minutos.
Superposición de cromatogramas: naranjo muestra AE5, azul muestra AE5 + estándares.
53
Figura 31: Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 20 µL fracción M5: estándares de
flavonoides en proporción 10:1, canal de absorbancia 354 nm, tiempo de corrida 60 minutos.
Superposición de cromatogramas: naranjo muestra M5, azul muestra M5 + estándares.
4.2
Determinación fenoles totales
Se determinó el contenido de fenoles totales de los extractos metanólicos de hojas y ramas de
Laurelia sempervirens, partes aéreas de Modiola caroliniana, y láminas y peciolos de hojas de
Gunnera tinctoria. Para ello se prepararon extractos etanólicos (80% en agua) de concentración
40 mg/mL, los cuales debieron ser diluidos 10 veces para lograr mediciones de absorbancia
acordes a la ley de Lambert-Beer. La absorbancia fue leída a 760 nm. Las medidas fueron
realizadas en triplicado para cada extracto. Los resultados se expresaron como mg equivalentes
de ácido gálico por 100 g de droga. Los resultados se expresan como la media de 3 resultados ±
desviación estándar. Los resultados se muestran en la tabla 5.
54
Curva calibración ácido gálico
2.000
y = 0.0039x
R² = 0.9979
1.800
Absorbancia
1.600
1.400
1.200
1.000
0.800
0.600
0.400
0.200
0.000
0
100
200
300
400
500
Concentración ácido gálico (μg/mL)
Figura 32: Curva de calibración del método Folin-Ciocalteu con estándares de ácido gálico de
concentraciones 100, 200, 300, 400 y 500 µg/mL, ecuación de la recta y coeficiente de
correlación de los datos
Tabla 5: Resultados obtenidos en la determinación de fenoles totales de extractos de hojas y
ramas de Laurelia sempervirens, de partes aéreas de Modiola caroliniana y de láminas y peciolos
de hojas de Gunnera tinctoria mediante el método de Folin-Ciocalteu, expresados como la media
de 3 resultados ± desviación estándar
Material vegetal
mg equivalentes ácido gálico/ 100 g de droga
Hojas Laurelia sempervirens
38,8517 ± 0,9042
Ramas Laurelia sempervirens
16,2057 ± 0,7886
Partes aéreas Modiola caroliniana
6,9320 ± 0,8131
Láminas de hojas Gunnera tinctoria
177,1267 ± 2,7405
Cubierta peciolo Gunnera tinctoria
28,7717 ± 0,7829
Peciolo comestible Gunnera tinctoria
8,6629 ± 1,2411
55
4.3
Determinación flavonoides totales
Se determinó el contenido de flavonoides totales de los extractos metanólicos de hojas y ramas de
Laurelia sempervirens, partes aéreas de Modiola caroliniana, y láminas y peciolos de hojas de
Gunnera tinctoria. Los extractos fueron preparados con etanol al 80%; la concentración de los
extractos fue 40 mg/mL. Luego de la preparación los extractos debieron ser diluidos 10 veces
para lograr mediciones de absorbancia acordes a la ley de Lambert-Beer. La absorbancia fue leída
a una longitud de onda de 420 nm. Se realizaron 3 medidas para cada uno de los extractos. Los
resultados se expresaron como mg equivalentes de quercetina por 100 g de droga. Los resultados
se expresan como la media de 3 resultados ± desviación estándar. Los resultados se muestran en
la tabla 6.
Curva calibración quercetina
1.000
y = 0.0375x
R² = 0.9981
0.900
Absorbancia
0.800
0.700
0.600
0.500
0.400
0.300
0.200
0.100
0.000
0
5
10
15
20
25
Concentración quercetina (μg/mL)
Figura 33: Curva de calibración del método cloruro de aluminio con estándares de quercetina de
concentraciones 5, 10, 15, 20 y 25 µg/mL, ecuación de la recta y coeficiente de correlación de los
datos
56
Tabla 6: Resultados obtenidos en la determinación de flavonoides totales de extractos de hojas y
ramas de Laurelia sempervirens, de partes aéreas de Modiola caroliniana y de láminas y peciolos
de hojas de Gunnera tinctoria mediante el método de cloruro de aluminio, expresados como la
media de 3 resultados ± desviación estándar
Material vegetal
4.4
mg equivalentes quercetina/ 100 g de droga
Hojas Laurelia sempervirens
17,5750 ± 0,2963
Ramas Laurelia sempervirens
2,8996 ± 0,0785
Partes aéreas Modiola caroliniana
6,9791 ± 0,5722
Láminas de hojas Gunnera tinctoria
20,8493 ± 0,4298
Cubierta peciolo Gunnera tinctoria
2,6438 ± 0,3397
Peciolo comestible Gunnera tinctoria
0,7293 ± 0,1647
Evaluación efecto antioxidante
Se evaluó el efecto antioxidante de los extractos metanólicos de hojas y ramas de Laurelia
sempervirens, partes aéreas de Modiola caroliniana, y láminas y peciolos de hojas de Gunnera
tinctoria. Las concentraciones evaluadas fueron 1 mg/mL y 0,5 mg/mL. Las reacciones fueron
realizadas en triplicado para cada uno de los extractos. Las mediciones se efectuaron luego de 10
minutos del inicio de la reacción, midiendo la extinción del color violeta del DPPH a 517 nm.
Los valores de absorbancia obtenidos son transformados a porcentaje de inhibición del radical
DPPH. Los resultados se expresan como la media de 3 resultados ± desviación estándar. Los
resultados de las mediciones efectuadas tanto a estándares como a muestras se expresan en las
tablas 7 y 8.
57
Tabla 7: Porcentaje de inhibición del radical DPPH por estándares de ácido ascórbico de
concentraciones 4, 6, 8 y 10 µg/mL. Resultados expresados como el promedio de 3 medidas ±
desviación estándar
Concentración ácido ascórbico
Porcentaje inhibición
4 μg/mL
34,593 ± 2,484
6 μg/mL
62,112 ± 0,168
8 μg/mL
78,391 ± 1,101
10 μg/mL
92,151 ± 0,581
Tabla 8: Porcentaje de inhibición del radical DPPH por extractos de hojas y ramas de Laurelia
sempervirens, de partes aéreas de Modiola caroliniana y de láminas y peciolos de hojas de
Gunnera tinctoria de concentraciones 1 y 0,5 mg/mL. Resultados expresados como el promedio
de 3 medidas ± desviación estándar
Inhibición radical DPPH (%)
Material vegetal
Concentración 1 mg/mL Concentración 0,5 mg/mL
Hojas Laurelia sempervirens
64,0504 ± 1,4917
30,9109 ± 0,6051
Ramas Laurelia sempervirens
63,8566 ± 1,1006
33,0426 ± 1,7762
Partes aéreas Modiola caroliniana
10,2713 ± 1,1748
2,4225 ± 0,9345
Láminas de hojas Gunnera tinctoria
91,0853 ± 1,6010
89,8256 ± 0,5814
Cubierta peciolo Gunnera tinctoria
90,3101 ± 0,4440
88,1783 ± 0,8881
Peciolo comestible Gunnera tinctoria
80,9109 ± 0,9345
46,6873 ± 1,0695
58
5-
DISCUSIÓN
En esta investigación se realizaron estudios fitoquímicos y de actividad biológica de plantas
utilizadas comúnmente en medicina Mapuche. Por sus usos populares se escogieron 3 especies
vegetales: Laurelia sempervirens, Modiola caroliniana y Gunnera tinctoria. Se realizó una
identificación de los grupos de compuestos mayoritarios presentes en los extractos de estas
drogas, además se evaluó la capacidad antioxidante de estos extractos y se determinó el contenido
de fenoles y flavonoides totales de estas drogas.
Las pruebas de caracterización fitoquímica practicadas en los extractos de hojas y ramas de
Laurelia sempervirens, partes aéreas de Modiola caroliniana y láminas y peciolos de las hojas de
Gunnera tinctoria mostraron resultados positivos para la presencia azúcares reductores, azúcares
no reductores, taninos, flavonoides y esteroides para todas las partes analizadas. En algunas de
estas drogas también se determinó la presencia de antraquinonas, gomas y mucílagos. Comprobar
la presencia de taninos en estas drogas es importante debido al potencial terapéutico de estos
compuestos. La literatura refiere que los taninos tienen propiedades anti-inflamatorias,
antidiarreicas y cicatrizantes. Sus propiedades anti-inflamatorias se deben principalmente a la
capacidad atrapadora de radicales libres, y por medio de esta capacidad podrían detener algunos
procesos inflamatorios (Fenglin et al., 2004). Según esto, es probable que la presencia de taninos
en Gunnera tinctoria sea la responsable de la acción de esta planta contra la disentería debido a
su poder astringente (Henry, 1923). Por otro lado, la presencia de antraquinonas tampoco había
sido descrita con anterioridad para ninguna de las drogas estudiadas en esta investigación, aunque
sí se menciona la presencia de compuestos derivados de quinonas, por ejemplo, en Modiola
caroliniana (Stevens, 2001). Los compuestos antraquinónicos se caracterizan por presentar
59
propiedades laxantes al ser administradas a los animales (Domínguez, 1973), por lo que la
presencia de antraquinonas en los extractos de Gunnera tinctoria podría ocasionar una
disminución del efecto antidiarreico que esta planta posee. Por otra parte, existen evidencias de la
presencia de flavonoides en estas plantas (Pacheco et al., 1993), lo cual fue corroborado en
nuestro estudio. Los flavonoides exhiben múltiples propiedades beneficiosas al ser administrados
en seres humanos, lo que podría explicar el uso que se le da a estas especies vegetales en
medicina tradicional Mapuche. Por ejemplo el infuso de las hojas de Laurelia sempervirens es
utilizado para calmar dolores de cabeza (Arbert et al., 2003), lo cual puede estar relacionado con
las propiedades analgésicas mostradas por flavonoides como por ejemplo kaempferol. En la
literatura se ha descrito la acción anti-inflamatoria in vitro e in vivo de la aglicona kaempferol,
efecto que se explica por inhibición de las enzimas óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y
ciclooxigenasa 2 (COX-2) de una manera dependiente de la dosis (De Melo et al., 2009; Kim et
al., 2004). Finalmente, en este estudio no pudo ser determinada la presencia de alcaloides en
ninguna de las drogas investigadas, sin embargo existen múltiples referencias sobre el contenido
de alcaloides en Laurelia sempervirens, en especial alcaloides del tipo bisbencilisoquinolínicos
(Schmeda-Hirschmann et al., 1996; Urzúa et al., 1978). Las extracciones de alcaloides
generalmente presentan un muy bajo rendimiento, lo cual podría ser una complicación al trabajar
con pequeñas cantidades de droga. Además para la obtención de estos alcaloides SchmedaHirschmann et al. (1996) describen un procedimiento diferente al utilizado en la metodología de
nuestra investigación para la determinación cualitativa de estos metabolitos. Lo anterior nos lleva
a pensar que el hecho que las pruebas para determinar presencia de alcaloides en nuestras drogas
hayan mostrado resultados negativos no significa necesariamente que dichas drogas no contengan
60
alcaloides, sino que la metodología escogida no fue la indicada para determinar la presencia de
este tipo de metabolitos en las especies de este estudio.
De acuerdo a los resultados positivos de la prueba de la cianidina para todas las especies
estudiadas, se decidió realizar un análisis de los diversos extractos obtenidos mediante
fraccionamiento líquido-líquido a través de HPLC-DAD. Los resultados mostraron la presencia
de los flavonoides quercetina y kaempferol en los extractos de láminas de hojas y cubiertas de
peciolos de Gunnera tinctoria. En un estudio de Pacheco (1993) se reporta la presencia de
diversos glicósidos de quercetina en las hojas de esta planta, coincidiendo parcialmente con
nuestros resultados. Además en ese mismo estudio se informa de la presencia de kaempferol y
glicósidos de kaempferol en especies peruanas y bolivianas del género Gunnera. La
determinación de la presencia de flavonoides en esta especie vegetal nos lleva a señalar que esta
especie podría ser utilizada para el tratamiento de otras patologías, distintas a las descritas en la
medicina tradicional Mapuche. Como mencionamos con anterioridad, el flavonoide quercetina
presenta una inmensa variedad de efectos farmacológicos como efectos analgésicos,
antiinflamatorios, antimutagénicos, antioxidantes entre muchos otros (Harwood et al., 2007;
Havsteen, 2002). Mientras que el flavonoide kaempferol es reconocido por su efecto analgésico
(De Melo et al., 2009; Kim, 2004 et al.; Havsteen, 2002). Se hace necesario entonces, evaluar la
actividad biológica de esta droga frente a las actividades descritas para cada uno de estos
compuesto fenólicos. Debemos dejar en claro que estos flavonoides han sido encontrados en
láminas de hojas y cubiertas de peciolos de Gunnera tinctoria, partes que generalmente son
descartadas por las personas debido a que se ingiere sólo la parte interna del peciolo, conocido
popularmente como un vegetal comestible. Este hallazgo le da un valor adicional al uso de partes
de desecho de este vegetal por sus propiedades farmacológicas.
61
La determinación del contenido de fenoles totales en extractos etanólicos en las especies
estudiadas fue realizada través del método de Folin-Ciocalteu. Este método es mundialmente
utilizado para la determinación de compuestos polifenólicos en extractos vegetales y tiene
muchas variaciones. Aun así los reactivos utilizados son idénticos en todos los casos, variando
únicamente las cantidades usadas y el tiempo esperado para realizar las mediciones
espectrofotométricas de las muestras. La sencillez de este método asegura su reproducibilidad,
volviéndolo un método altamente fiable (Rodríguez-Amado et al., 2011). Los valores finales del
contenido de fenoles en los extractos fueron expresados en mg equivalentes de ácido gálico
(EqAG) por cada 100 gramos de droga en peso seco, obteniéndose resultados entre 6,9 mg
EqAG/100 g para el caso de partes aéreas de Modiola caroliniana y 177,1 mg EqAG /100 g para
el extracto de láminas de hojas de Gunnera tinctoria. Si bien no existe una categorización que
permita establecer si los contenidos de fenoles totales en frutas y vegetales son altos o bajos, si
existen algunas referencias en la literatura respecto a un contenido aceptable de fenoles. Por
ejemplo valores finales de 60 mg EqAG /g de extracto concentrado son considerados “moderado
contenido” de fenoles cuando se usa el reactivo de Folin-Ciocalteau para medir reducción de la
capacidad antioxidante (Michelle et al., 2008). A pesar de ello, valores individuales de catequina
o ácido hidroxibenzóico de 200 mg/100 g de droga seca se consideran como “alto contenido”
(Bhatt et al., 2012). Según estos antecedentes podríamos considerar que el extracto de láminas de
hojas de Gunnera tinctoria presenta un “alto contenido” de fenoles totales, mientras que las
demás drogas estudiadas presentarían un “moderado a bajo contenido” de fenoles.
La determinación del contenido de flavonoides totales en extractos etanólicos de las especies
estudiadas fue realizada a través del método colorimétrico de cloruro de aluminio. Este método es
muy utilizado, pero muestra mucha variación en los resultados. En la naturaleza es común
62
encontrar flavonoides en forma de glicósidos y la presencia de estos azúcares puede impedir la
adecuada quelación de los flavonoides con el cloruro de aluminio. Además un bloqueo de los
grupos hidroxilo por glicosilación en carbonos de las posiciones 3, 5, 3’ o 4’ podría evitar la
quelación con cloruro de aluminio. Incluso la metoxilación en estos carbonos de las flavonas y
flavonoles puede reducir la formación de complejos coloreados (Denni y Mammen, 2012). A
pesar de los antecedentes mencionados no existe un método más sencillo de aplicar para la
determinación de flavonoides que sea mundialmente aceptado por su reproducibilidad. En estos
momentos el método colorimétrico con cloruro de aluminio es la técnica más fiable para medir el
contenido de flavonoides totales en extractos vegetales. Por otro lado la expresión de resultados
de este ensayo es otra variable que dificulta la comparación de resultados. Muchos autores
expresan sus resultados como mg equivalentes de quercetina (EqQ)/100 g de droga, pero hay
otros que expresan resultados en base a otros flavonoides como rutina, cianidina, catequina entre
otros. Los resultados del contenido de flavonoides totales de esta investigación muestran valores
entre 0,7 mg EqQ/100 g para el extracto de peciolos comestibles de Gunnera tinctoria y 20,8 mg
EqQ/100 g para el extracto de láminas de hojas de esta misma planta. Si bien no podemos
comparar los resultados de esta determinación con otras referencias, sí podríamos inferir que
estos valores están relacionados con el contenido de fenoles totales encontrados en estas mismas
plantas, debido al carácter polifenólico de los flavonoides.
La actividad antioxidante de las plantas estudiadas fue analizada mediante la realización del
ensayo con el radical DPPH. Esta prueba es uno de los ensayos de capacidad antioxidante más
comúnmente utilizado y con más variaciones existente (Sharma y Bhat, 2009). En este ensayo se
evaluaron extractos metanólicos de concentraciones 1 mg/mL y 0,5 mg/mL, esto para descartar
posibles limitantes del método. El ácido gálico, ácido ascórbico y butilhidroxitolueno (BHT) se
63
usan comúnmente como patrones de referencia en la evaluación comparativa de las propiedades
antioxidantes de nuevas moléculas. La reacción del ácido ascórbico con DPPH es muy rápida y
llega a término en cosa de minutos (Mishra et al., 2012), por lo cual se usó en esta oportunidad
como patrón. Los resultados más altos encontrados en esta prueba fueron los arrojados por
láminas de hojas y cubiertas de peciolos de Gunnera tinctoria, en ambos casos tanto los extractos
de concentración 1 mg/mL como de 0,5 mg/mL mostraron valores de porcentaje de inhibición
mayores a 90%, comparables con el estándar de ácido ascórbico de concentración 10 µg /mL. En
tanto en los extractos de concentración 1 mg/mL de peciolos comestibles de Gunnera tinctoria y
de hojas y ramas de Laurelia sempervirens se observaron valores de porcentaje de inhibición
mayores a 50%, pero al disminuir las concentraciones a 0,5 mg/mL los porcentajes respectivos
disminuyeron aproximadamente a la mitad de su valor. En el caso de los extractos de partes
aéreas de Modiola caroliniana para la solución de 1 mg/mL el valor obtenido fue 10% y para la
solución de 0,5 mg/mL se obtuvo un 2% de inhibición, valores evidentemente inferiores a la
inhibición producida por el estándar de ácido ascórbico de concentración 4 µg /mL. No fue
posible encontrar reportes en la literatura respecto a la actividad antioxidante de Laurelia
sempervirens, Modiola caroliniana y Gunnera tinctoria. En este estudio se informa por primera
vez el porcentaje de inhibición del radical DPPH para estas especies.
Si bien existen múltiples ensayos para determinar la capacidad antioxidante de extractos
vegetales, de ellos el que muestra mayor correlación con los ensayos de contenido de fenoles
totales y de flavonoides totales es el ensayo con el radical ABTS (del inglés 2,2'-azino-bis (3ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid). Aun así, el ensayo con el radical DPPH es uno de los
más sencillos y reproducibles, y a pesar que en muchas ocasiones arroja valores menores que el
ensayo con ABTS, se ha comprobado que ambos ensayos correlacionan ampliamente (Floegel et
64
al., 2011). Según estos antecedentes podríamos asumir que los resultados de capacidad
antioxidante con DPPH presentan correlación con los resultados de las determinaciones de
fenoles y flavonoides totales. Los resultados obtenidos en esta investigación así lo demuestran, ya
que los extractos de láminas de hojas de Gunnera tinctoria arrojaron los valores más altos para
todas las mediciones efectuadas y, por otro lado, los extractos de partes aéreas de Modiola
caroliniana mostraron los valores más bajos en la mayoría de las pruebas, en especial en el
ensayo con DPPH y de contenido de fenoles totales.
Es interesante analizar los resultados de las pruebas de actividad biológica efectuadas en los
extractos de peciolos comestibles de Gunnera tinctoria, ya que exhiben una capacidad
antioxidante cercana al 80% de inhibición del radical DPPH, sin embargo presentaron un bajo
contenido de fenoles y flavonoides totales, 8,6 mg EqAG/100 g y 0,7 mg EqQ/100 g
respectivamente. En la mayoría de los resultados encontrados en las demás drogas los valores de
inhibición de DPPH y fenoles y flavonoides totales mostraron cierta relación que permitió asumir
la correlación de los resultados. Esta ambigüedad podría tener varias lecturas, la principal y más
lógica sería asumir que la actividad antioxidante de este extracto no se deba únicamente a la
presencia de flavonoides y compuestos fenólicos. Muchas investigaciones se han dedicado a
determinar la actividad antioxidante de otras moléculas como por ejemplo los alcaloides,
demostrando que en algunos casos los alcaloides pueden presentar mayor actividad antioxidante
que otras moléculas, incluidos algunos flavonoides, pero que debido a su baja concentración en
extractos vegetales no siempre son los responsables de la actividad antioxidante de los extractos
crudos (Schmeda-Hirschmann et al., 2003). Por otro lado, una diferencia entre esta y las demás
drogas analizadas se produjo en el proceso de secado. Los peciolos comestibles no pudieron ser
secados en estufa debido a la aparición de hongos de apariencia filiforme, por eso se decidió
65
secar estas muestras a temperatura ambiente y protegidos de la luz solar. El tiempo requerido
para el proceso de secado mantuvo la droga en contacto prolongado, entre otros compuestos, con
el oxígeno del ambiente. El oxígeno puede jugar un papel importante en la degradación de
metabolitos secundarios durante los diferentes pasos del procesamiento y almacenamiento de
muestras conteniendo flavonoides. La presencia de oxígeno puede acelerar su degradación ya sea
a través de un mecanismo oxidativo directo o a través de la actividad catalítica de enzimas como
la polifenol oxidasa (Ioannou et al., 2012).
Analizando los procesos de secado llevados a cabo en nuestras drogas y comparándolos con
estudios de otros investigadores se pueden encontrar varias diferencias. Algunos autores sugieren
que los tratamientos térmicos podrían disminuir el contenido de compuestos polifenólicos en las
frutas (Agostini et al., 2004), lo cual podría ser aplicable también a otras partes de las plantas.
Los flavonoides son sensibles al calor y esta sensibilidad depende de la naturaleza de las
condiciones del tratamiento térmico y del entorno físico-químico en que este tratamiento se
desarrolla. Por otro lado, para muestras con flavonoides en solución la degradación depende del
tiempo y temperatura, de la estructura del flavonoide, el pH y la presencia de otros compuestos
químicos en la solución que favorezcan este proceso (Ioannou et al., 2012). Si consideramos que
el tratamiento térmico aplicado a las plantas utilizadas en esta investigación pudo haber
disminuido el contenido de sustancias fenólicas sería interesante realizar estas pruebas en estas
mismas plantas, pero con muestras frescas, y así determinar si el calor aplicado al momento del
secado o el tratamiento de las muestras provoca degradación de metabolitos secundarios.
66
Es necesario realizar más ensayos tendientes a dilucidar la composición química completa de
estas especies, así como también determinar la influencia del lugar de recolección de cada
especie, periodo del año en que se realiza dicha recolección y tratamiento realizado al material
vegetal, y la influencia de estas variables en la cantidad de principios activos farmacológicos
encontrados en ellas. También se cree necesario realizar estudios de actividad biológica in vivo e
in vitro, pues la idea es administrar los infusos o extractos de estas drogas en el tratamiento de
enfermedades en los seres humanos. A pesar de ello confiamos en haber contribuido en la
validación del uso de estas especies vegetales en la medicina, proyectando mucho trabajo por
realizar en el futuro.
67
6-
CONCLUSIONES
Basándonos en los resultados obtenidos y en la literatura revisada se puede concluir que:
- Mediante la realización de reacciones fitoquímicas es posible identificar la presencia de
metabolitos de los siguientes grupos en todas las plantas analizadas: hidratos de carbono, taninos,
flavonoides y esteroides. Por otro lado, se identificó la presencia de gomas y mucílagos en hojas
y ramas de Laurelia sempervirens, en partes aéreas de Modiola caroliniana y en cubiertas de
peciolos de Gunnera tinctoria. Además se identificó la presencia de heterósidos antraquinónicos
en hojas y ramas de Laurelia sempervirens, en partes aéreas de Modiola caroliniana y en
peciolos comestibles de Gunnera tinctoria.
- El análisis por HPLC-DAD nos permite confirmar la presencia de los flavonoides quercetina y
kaempferol en los extractos de Gunnera tinctoria.
- La actividad antioxidante encontrada en los extractos de hojas y ramas de Laurelia
sempervirens y en láminas de hojas, cubiertas de peciolo y peciolos comestibles de Gunnera
tinctoria de concentraciones 1 mg/mL y 0,5 mg/mL son comparables a la actividad antioxidante
mostrada por soluciones de ácido ascórbico en un rango de concentraciones entre 4 µg/mL a 10
µg/mL. Mientras la actividad antioxidante de los extractos de Modiola caroliniana es menor a la
mostrada por soluciones de ácido ascórbico en todas las concentraciones evaluadas.
- El valor más alto de contenido de fenoles totales de los extractos ensayados fue encontrado en
láminas de las hojas de Gunnera tinctoria, el cual mostró la mayor actividad antioxidante.
- El valor más alto de contenido de flavonoides totales de los extractos ensayados fue encontrado
en láminas de las hojas de Gunnera tinctoria, el cual mostró la mayor actividad antioxidante.
68
7-
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80
ANEXOS
Anexo 1: Preparación de reactivos para reacciones fitoquímicas generales.
-
Reactivo de antrona: Disolver 200 mg de antrona en 100 mL de ácido sulfúrico concentrado
(98%).
-
Reactivo de Molisch: Disolver 2 g de α-naftol en 100 mL de metanol. Utilizar fresco.
-
Licor de Fehling: Se forma mezclando 2 soluciones en el momento de ejecutar la reacción.
Fehling A: Disolver 35 g de sulfato de cobre pentahidratado en 500 mL de agua.
Fehling B: Disolver 158 g de tartrato de sodio y potasio en un pequeño volumen de agua y
agregar 112 g de hidróxido de potasio y agua en c.s.p. 500 mL.
-
Reactivo de Dragendorff: Se compone de 2 soluciones, las cuales se mezclan y se dejan
reposar por 24 horas. Una vez que el reactivo decanta, aforar a 100 mL con agua.
Solución A: Disolver 8 g de nitrato de bismuto pentahidratado en 20 mL de ácido nítrico al
30%.
Solución B: Disolver 27,2 g de yoduro de potasio en 50 mL de agua.
-
Reactivo de Bouchardat: Mezclar 1 g de yodo molecular y 2 g de yoduro de potasio. Disolver
con agua, aforando a 100 mL.
-
Reactivo Silicotúngstico: Disolver 12 g de ácido silicotúngstico en agua, aforando a 100 mL.
81
Anexo 2: Cromatogramas de fracciones analizadas por HPLC-DAD sin coinyección de
estándares.
Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 5 µL fracción AE1, canales de absorbancia
253, 265, 354 nm, tiempo de corrida 60 minutos.
Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 20 µL fracción M1, canales de absorbancia
253, 265, 354 nm, tiempo de corrida 60 minutos.
82
Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 5 µL fracción AE2, canales de absorbancia
253, 265, 354 nm, tiempo de corrida 60 minutos.
Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 20 µL fracción M1, canales de absorbancia
253, 265, 354 nm, tiempo de corrida 60 minutos.
83
Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 100 µL fracción AE3, canales de absorbancia
253, 265, 354 nm, tiempo de corrida 60 minutos.
Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 100 µL fracción M3, canales de absorbancia
253, 265, 354 nm, tiempo de corrida 60 minutos.
84
Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 10 µL fracción AE6, canales de absorbancia
253, 265, 354 nm, tiempo de corrida 60 minutos.
Cromatograma obtenido por HPLC-DAD, muestra 20 µL fracción M6, canales de absorbancia
253, 265, 354 nm, tiempo de corrida 60 minutos.