La infección crónica con Toxoplasma gondii induce células capaces de suprimir una inflamación alérgica pulmonar Fenoy Ignacio; Sánchez Vanesa; Soto Ariadna; March Florencia; Martín Valentina; Goldman Alejandra 1Centro de Estudios en Salud y Medio Ambiente-ECyT, Universidad Nacional San Martín. RESULTADOS INTRODUCCIÓN Supresión in vitro El incremento en la incidencia de desórdenes atópicos observado durante las ultimas décadas ha sido asociado a una disminución en la prevalencia de ciertas infecciones. proliferación T supresión * 35 25 30 20 25 15 Index índice Estudios epidemiológicos mostraron que la incidencia de alergias respiratorias es menos frecuente en personas expuestas a microorganismos orofecales tales como Toxoplasma gondii (BMJ. 320:412 2000). 20 15 10 10 5 5 0 0 Normal Toxo Ov a O+T N Toxo O+T Células provenientes de ganglios toráxicos fueron estimuladas in vitro con OVA. Luego de 5 días (OVA) de cultivo se evaluó la proliferación celular por incorporación de 3[H]timidina. Células de ganglios torácicos de ratones alérgicos fueron co-cultivadas con células de ganglio torácico provenientes de ratones normales, infectados o infectados y sensibilizados y estimulados in vitro con OVA. *p<0,05 vs todos los grupos. T. gondii es un parásito intracelular obligado del phylum apicomplexa. La infección induce una fuerte inmunidad celular, caracterizada por una alta respuesta polarizada de tipo Th1 en etapas tempranas de la infección (Clin Microbiol Rev. 11:569 1998). Supresión in vivo Día 44-45-46 Desafío oral OVA Demostramos previamente que la infección crónica con Toxoplasma gondii es capaz de proteger frente al desarrollo de una inflamación alérgica pulmonar (Clinical and Experimental Immunology, 155:275-284, 2009). Hipotetizamos que los niveles de IFN-γ secretados en respuesta a la infección durante la etapa crónica, aunque más bajos que en la etapa aguda, son suficientes para inhibir la diferenciación de precursores hacia Th2 sin inducir un desvío hacia una respuesta celular Th1. De hecho no observamos un aumento de IFN-γ en respuesta al alergeno. Día 0 Inf. oral T. gondii Día 30 Día 48 Transferencia Adoptiva Día37 ip OVA/ALUM Día 53 Análisis Día 35 Día 42 Día 49-50-51 ip Desafío oral OVA/ALUM OVA De todas formas, otros mecanismos podrían también estar involucrados. Se ha demostrado que ciertas infecciones bloquearían el desarrollo de alergias a través de la inducción de citoquinas regulatorias como IL-10 y TGF- , y la expansión de células regulatorias CD4+Foxp3+. No hay muchos datos bibliográficos acerca de las células regulatorias inducidas por la infección con T.gondii (Microbes and Infection 13: 394, 2011; Journal of Biomedicine and Biotechnology 1:1, 2010; J Exp Med 204:273, 2007) El objetivo del presente trabajo fue analizar si células de ganglio toráxico proveniente de animales infectados eran capaces de suprimir in vivo el desarrollo de un fenotipo alérgico. Se evaluó además, en ganglio toráxico, la población CD4+Foxp3+ y los niveles de citoquinas regulatorias IL-10 y TGF- . mucus * 8 60 3 7 50 6 40 30 20 2 5 Indice ** Indice %eosinófilas Previamente demostramos in vitro que células de ganglios toráxicos de ratones crónicamente infectados y sensibilizados muestran una menor proliferación frente a OVA. Esta disminución esta dada por la presencia de células con capacidad supresora. infiltrado eosinofilia 4 3 1 2 10 1 0 0 N T 0 N OT T OT N T OT Los pulmones fueron lavados con PBS y fijados con formalina. Se realizó un conteo diferencial en las células presentes en el lavado para obtener la eosinofilia. Los pulmones fijados se cortaron y tiñeron con PASHematoxilina. Células de ganglios torácicos fueron estimulados in vitro con OVA o ConA. MEDIA±ES.ANOVA con Bonferroni a posteriori : *p<0,05 vs todos los grupos. ** p<0,05 vs N Células regulatorias en ganglio toráxico MATERIALES Y METODOS Modelo de asma experimental Se utilizaron ratones BALB/c hembras de dos meses de edad. FOX+CD4+/CD4+ Día 48 Análisis Día 30 Día37 Día 44-45-46 ip Desafío oral OVA/ALUM OVA Transferencia adoptiva Células de ganglio toráxico (5x106) de ratones N, T y OT fueron inoculadas iv en ratones BALB/c luego de haber sido sensibilizados intraperitonealmente y previo al desafío por vía aérea con OVA. % 5 0 N TGF- IL-10 700 * 0.2 * 600 500 400 300 0.1 200 100 0.0 0 Citometría Células de ganglio toráxico (1x106) fueron marcadas con anticuerpo α-CD4 FITC. Luego se fijaron, permeabilizaron y marcaron con α-FOXP3 PE. OT Citoquinas regulatorias en ganglio toráxico pg/ml pulmones fueron instilados con formalina, removidos y fijados en la misma solución. Los cortes para microscopía fueron teñidos con H&E y PAS. La infección fue confirmada por medición de IgG especifica para T. gondii. O Células de ganglios torácicos de ratones alérgicos fueron marcadas con anticuerpos contra CD4 FITC y FOXP3 PE. MEDIA±ES, ANOVA con Bonferroni a posteriori: **p<0,05 vs N Histopatología pulmonar Los animales fueron sacrificados y sangrados por punción cardíaca. Se realizó un conteo diferencial a partir de lavados broncoalveolares (BAL) (Tincion 15 (BiopurSA), versión modificada de Wright-Giemsa). Luego del lavado, los T CD4+ OD Medición de citoquinas Células de ganglio torácico (3x105) fueron cultivadas y estimuladas in vitro con OVA. Luego de 72 hs se midió, en el sobrenadante, la concentración de IL-10 y TGF- por ensayos de ELISA tipo sandwich. ** ** 10 FOXP3 Día 0 Inf. oral T. gondii 15 N T O OT N T O OT Se midió la concentración de IL-10 y TGF-por ELISA en sobrenadante de células provenientes de ganglio toráxico estimuladas in vitro con OVA . MEDIA±ES, ANOVA con Bonferroni a posteriori. *p<0,05 vs todos los grupos Resultados similares se obtuvieron cuando los ratones fueron sensibilizados en la etapa aguda de la infección CONCLUSIONES: • Las células provenientes de ganglio toráxico son capaces de disminuir la eosinofilia y el infiltrado peribronquial incluso en animales previamente sensibilizados. • La infección crónica con T. gondii muestra un aumento significativo en la población regulatoria CD4+FOXP3+ • El aumento de TGF-β en células de ganglio toráxico provenientes de animales infectados y sencibilizados correlaciona con la supresión observada • La IL-10 producida por células de ganglio toráxico se comporta como una citoquina Th2 • Estos datos sugerirían que el TGF- y/o la población de células CD4+Foxp3+ estarían involucrados en la supresión ejercida por las células de GT de ratones infectados y sensibilizados.