NUEVOS PEPTIDOS OPIOIDES.(ES2171224)

k
OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
k
kInt. Cl. : C07K 5/107
11 Número de publicación:
7
51
ESPAÑA
k
2 171 224
A61K 38/07
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
12
kNúmero de solicitud europea: 96927978.5
kFecha de presentación: 14.08.1996
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 845 003
kFecha de publicación de la solicitud: 03.06.1998
T3
86
86
87
87
k
54 Tı́tulo: Nuevos péptidos opioides.
k
30 Prioridad: 18.08.1995 SE 9502877
07.11.1995 SE 9503924
151 85 Södertälje, SE
k
72 Inventor/es: Wang, Wuyi
k
74 Agente: Curell Suñol, Marcelino
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
01.09.2002
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
01.09.2002
ES 2 171 224 T3
k
73 Titular/es: AstraZeneca AB
Aviso:
k
k
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 171 224 T3
DESCRIPCION
Nuevos péptidos opioides.
5
Campo de la invención
La presente invención se refiere a compuestos peptı́dicos de tipo opioide. Más particularmente, se
refiere a compuestos peptı́dicos de tipo opioide que exhiben actividad analgésica periférica y selectividad
para los receptores de opioides del subtipo µ.
10
15
20
25
30
35
40
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50
55
60
Antecedentes de la invención
Muchos péptidos endógenos de origen mamı́fero y anfibio se unen a receptores opioides especı́ficos y
provocan una respuesta analgésica similar a los narcóticos opiáceos clásicos. Se ha demostrado que en
animales superiores coexisten muchos tipos diferentes de receptores de opioides. Por ejemplo, ver W.
Martin et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 197, p. 517 (1975); y J. Lord et al., Nature (Londres), 257, p.
495 (1977). Se han identificado tres tipos diferentes de receptores de opioides. El primero, δ, muestra una
afinidad diferencial para péptidos de tipo encefalina. El segundo, µ, muestra selectividad intensificada
para morfina y otros alcaloides policı́clicos. El tercero, κ, exhibe igual afinidad para cada grupo de los
ligandos de arriba y afinidad preferencial para dinorfina. En general, los receptores µ parecen estar más
implicados en efectos analgésicos. Los receptores δ parecen tener relación con efectos conductistas, a
pesar de que los receptores δ y κ también pueden mediar analgesia.
Cada receptor opioide, cuando está acoplado a un opiáceo, causa una respuesta biológica especı́fica
única para ese tipo de receptor. Cuando un opiáceo activa más de un receptor, se afecta la respuesta
biológica para cada receptor, produciendo de ese modo efectos secundarios. Cuanto menos especı́fico y
selectivo es un opiáceo, mayor es la posibilidad de causar mayores efectos secundarios mediante la administración del opiáceo.
En técnica anterior, opiáceos, péptidos opioides, y análogos de lo mismo, o bien han fracasado en
demostrar, o han demostrado un grado limitado de selectividad para el tipo de receptor, o receptores, a
los que se unen.
Los opiáceos pueden causar serios y potencialmente fatales efectos secundarios. Efectos secundarios
como la depresión respiratoria, tolerancia, capacidad de dependencia fı́sica, y sı́ndrome de abstinencia
son causados por interacciones no especı́ficas con receptores del sistema nervioso central. Ver K. Budd,
en International Encyclopedia of Pharmacology and Therapeutics; N.E. Williams y H. Wilkinson, Eds.,
Pergammon: (Oxford), 112, p.51 (1983). Por lo tanto, no es de esperar que analgésicos opioides que
actúen principalmente a través de receptores opioides en el sistema nervioso periférico causen similares
efectos secundarios no deseados como los efectos secundarios asociados a los analgésicos opioides que
afectan al sistema nervioso central.
Hasta el momento, una de las pocas clases de agentes que se sabe que ejercen efectos analgésicos periféricos son los agentes antiinflamatorios no esteroidales, tales como aspirina, ibuprofeno y ketorolac. Estos
agentes no interaccionan con receptores opiáceos pero se sabe que inhiben la ciclooxigenasa y atenúan la
sı́ntesis de prostaglandina. Estos débiles analgésicos no tienen efectos secundarios mediados centralmente,
pero pueden causar otros efectos secundarios tales como ulceraciones del tracto gastrointestinal.
Se pensaba que los péptidos no-polares pasan más fácilmente al sistema nervioso central que los
péptidos polares atravesando la barrera hematoencefálica. Se ha publicado que TAPP (H-Tyr-D-AlaPhe-Phe-NH2 ) exhibe propiedades antinociceptivas tanto periféricamente como centralmente (P. Schiller
et al., Proceedings of the 20th European Peptide Symposium, 1988). En cambio, el presente inventor ha
encontrado que este tetrapéptido no actúa centralmente incluso a dosis de 100 mg/Kg.
El documento WO 95/22557 da a conocer agonistas selectivos de receptor opioide µ que tienen estructura de tetrapéptido, por ej. H-Tyr-D-Ala-Phe-Phe(pF)-NH2 y H-Tyr-D-Arg-Phe-Phe(pF)-NH2 .
Un objetivo de la invención es proporcionar compuestos peptı́dicos de tipo opioide que actúen periféricamente pero eviten sustancialmente los efectos secundarios indeseados asociados con los analgésicos
convencionales de acción periférica. Un objetivo adicional es proporcionar compuestos peptı́dicos que se
unan selectivamente al receptor opioide µ.
2
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Sumario de la invención
La presente invención proporciona nuevos compuestos peptı́dicos que actúan periféricamente y son
selectivos para receptores opioides µ, el compuesto representado por la fórmula (1):
5
Z
/
X—R1—R2 —R3 —R4—N
\
10
(1)
Y
y las sales, derivados y análogos del mismo
15
en la que,
R1 es Tyr o 2’,6’-dimetiltirosina, o un análogo o derivado del mismo;
R2 es D-Ala o D-Arg;
20
R3 es Phe(p-F);
R4 es Phe o Phe(p-F);
X es H ó C1−6 alquilo; y
25
Y y Z son independientemente H, aralquilo o C1−6 alquilo.
En otro aspecto de la invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un
compuesto de fórmula (1) en mezcla con un portador aceptable farmacéuticamente y/o un segundo agente
terapéuticamente activo.
30
En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para tratar el dolor que comprende
la administración a un mamı́fero necesitado de tal tratamiento de una cantidad farmacéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (1).
35
En un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de un compuesto de fórmula (1) para
la producción de un medicamento para tratar el dolor.
Breve descripción de las figuras
40
Las figuras 1, 2, y 4 ilustran el efecto inhibidor de los compuestos de la invención en dos ensayos diferentes
de placa caliente.
La figura 3 ilustra el efecto inhibidor de H-Tyr-D-Ala-Phe-Phe-NH2 en un ensayo de placa caliente.
45
La figura 5 ilustra el efecto inhibidor de compuestos de la invención en el ensayo de retirada de cola.
Descripción de la invención
Las siguientes abreviaciones comunes se usan a lo largo de toda la descripción y en las reivindicaciones:
50
55
60
Ala
Arg
Phe
Ser
Tyr
TAPP
GPI
MVD
Phe(p-F)
-
alanina
arginina
fenilalanina
serina
tirosina
H-Tyr-D-Ala-Phe-Phe-NH2
ı́leo de cobaya.
conducto deferente de ratón
para-fluoro fenilalanina
3
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HOBT
BOP
DMF
TFA
tBU
Pmc
FMOC
PBQ
5
- N-hidroxibenzotiazol
-benzotriazolil-N-oxi-tris(dimetilamino)fosfoniohexafluorofosfato
- dimetilformamida
- ácido trifluoracético
- tert-butil
- 2,2,5,7,8 pentametilcromano-6-sulfonilo
- 9-fluorenilmetiloxicarbonilo
- fenil-p-benzoquinona.
10
15
El término “ED50 ” como se muestra en la tabla 1 para los ensayos de contracciones abdominales con
PBQ se define como la dosis de fármaco que induce una reducción del 50 % en el número de contracciones
observado comparado con el control. El término “Kl ” en la tabla 1 para los ensayos de unión, es la
constante de inhibición del ligando conocido DAMGO de receptor µ y del ligando DADLE de receptor δ.
El término “Kδl /Kµl ” es un valor usado para indicar selectividad. Esta relación representa la relación de
las afinidades de péptidos opioides para unirse a receptores µ y δ.
Los compuestos de la presente invención están representados por la fórmula (1):
20
Z
/
X—R1—R2 —R3 —R4 —N
\
(1)
Y
25
y las sales, derivados y análogos de los mismos.
X es H o metil y es preferentemente H.
30
R1 es Tyr o 2’,6’-dimetiltirosina, y es preferentemente Tyr. El grupo alfa amino de R1 se sustituye con
X para formar un grupo amino cuando X es H o un grupo alquilamino cuando X es metil.
R2 es D-Ala o D-Arg, y es preferentemente D-Ala.
35
R3 es Phe(p-F).
R4 es Phe o Phe(p-F), y es preferentemente Phe.
40
Y y Z son independientemente H; aralquilo, tal como bencilo; y C1−6 alquilo, tal como metilo. Preferentemente, tanto Y como Z son H.
Los compuestos de la invención incluyen, pero no se limitan a:
45
50
55
Compuesto #1B
H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH2 ;
Compuesto #1C
H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH2 ;
Compuesto #2B
H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH2 ;
Compuesto #2C
H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe-NH2 .
y
En una forma de realización preferida, los compuestos de la invención se seleccionan a partir de un
grupo que consta de
Compuesto #1C
H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH2 ;
Compuesto #2C
H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe-NH2 .
y
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4
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En una forma de realización más preferida, el compuesto de la invención es
Compuesto #1C
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40
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55
H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH2
El derivado de aminoácido 2’,6’-dimetiltirosina (Dmt) puede ser sustituido por tirosina en los compuestos peptı́dicos opioides. Experimentos han demostrado que la sustitución de Dmt por tirosina en la
posición R1 , el primer residuo aminoacı́dico en la fórmula general 1, intensifica la potencia del péptido
opioide en el receptor µ hasta dos órdenes de magnitud. La selectividad para el receptor µ aumenta
cuando el compuesto incluye Dmt en la posición R1 . Esta sustitución causa un correspondiente cambio
en la relación de constantes de inhibición de unión para reflejar la mayor selectividad para el receptor µ.
La actividad opioide de los péptidos fue determinada in vitro usando la preparación de músculo longitudinal de ı́leo de cobaya (GPI) y su actividad antinociceptiva fue determinada in vivo en modelos de
contracciones abdominales inducidas por PBQ (actividad periférica) y en dos pruebas de placa caliente
(actividad central) en roedores. La actividad analgésica del compuesto de la invención también fue evaluada en el ensayo de retirada de cola. El ensayo de retirada de cola se usa para evaluar la actividad
analgésica central del compuesto. La comparación de las actividades de los compuestos de la invención
en los ensayos de contracciones abdominales, placa caliente, y retirada de cola demostró que los efectos
analgésicos eran mediados predominantemente en la periferia. La analgesia periférica fue demostrada por
una alta potencia en la prueba de contracciones abdominales junto con una baja potencia en la prueba
de placa caliente o en la prueba de retirada de cola.
Las contracciones abdominales inducidas por PBQ (fenil-p-benzoquinona) en ratones es una valoración de analgesia tanto central como periférica. Para protocolo experimental, ver Sigmund et al., Proc.
Soc. Exp. Biol. Med., 95, p. 729(1957) que se incorpora a la presente memoria como referencia. La analgesia central se determina por la inhibición de una respuesta a placa caliente en ratones. Para protocolo
experimental ver G. Wolfe y A. MacDonald, J. Pharmacol. Exp. Ther., 80, p.300 (1944) que se incorpora a la presente memoria como referencia. Ensayos para medir afinidades de unión a receptor opioide
para receptores µ y δ ası́ como el ensayo GPI fueron determinados mediante el protocolo experimental
explicado en Schiller et al., Biophys. Res. Commun., 85, p.1322 (1975), que se incorpora a la presente
memoria como referencia.
Los compuestos de la presente invención pueden ser producidos mediante métodos bien conocidos
en la técnica de quı́mica de péptidos. Por ejemplo, ver Principle of Peptide synthesis, Bodansky M.,
Spinger-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo 1984 o The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology,
editado por Erhard Gross y Johannes Meienhofer, Academic Press 1979.
Los compuestos de la presente invención fueron preparados usando sı́ntesis en fase sólida como se
destaca más adelante según los procedimientos establecidos en la técnica de sı́ntesis de péptidos. Se
empleó para-fluoro-fenilalanina (Phe(p-F)) disponible comercialmente en el paso apropiado de sı́ntesis.
2’,6’dimetiltirosina también puede ser incorporada en la sı́ntesis y se prepara según lo establecido por las
técnicas de sı́ntesis quı́mica.
Sales de los péptidos de la presente invención farmacéuticamente aceptables pueden ser formadas
convencionalmente mediante reacción con un ácido apropiado. Sales adecuadas con adición de ácidos se
pueden formar por la adición de ácidos tales como hidroclórico, hidrobrómico, fosfórico, acético, fumárico,
salicı́lico, cı́trico, láctico, mandélico, tartárico, oxálico, metasulfónico, y otros ácidos adecuados conocidos
por los expertos en la materia.
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas. Las composiciones adecuadas tienen una cantidad efectiva de compuestos de la invención, o sales farmacéuticamente aceptables
de los mismos, en mezcla con un portador o adyuvante farmaceuticamente aceptables. Se puede formular una cantidad terapéuticamente efectiva de un péptido de la invención y una sustancia portadora
farmacéuticamente aceptable (por ej. carbonato de magnesio o lactosa) para formar una composición terapéutica, tal como (i) una pı́ldora, tableta, cápsula, o lı́quido para la administración oral a un paciente;
(ii) un lı́quido o ungüento capaz de ser administrado por inhalación, transdérmicamente, nasalmente,
rectalmente o sublingualmente; (iii) un lı́quido capaz de ser administrado intravenosamente, parentalmente, subcutáneamente o intraperitonealmente; o (iv) una formulación oral o de liberación parenteral
retardada.
60
La presente invención también proporciona un método para el tratamiento del dolor en mamı́feros,
incluyendo humanos. El método comprende la administración de una cantidad de un péptido de fórmula
5
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5
1 farmacéuticamente efectiva o una sal farmacéuticamente aceptable o composición del mismo en uno de
los modos tradicionales, por ej. oralmente, parenteralmente, transdérmicamente, o transmucosalmente,
en una formulación de liberación retardada usando un polı́mero biocompatible biodegradable, o mediante
liberación local usando micelas, geles y liposomas. Los péptidos se pueden administrar a un paciente
humano en dosis de alrededor de 0,01 a 100 mg/kg, preferentemente alrededor de 0,05 a 20 mg/kg y más
preferentemente alrededor de 0,1-1 mg/kg.
Los ejemplos siguientes se usan para una mejor descripción de la invención. Estos ejemplos tienen
únicamente fines ilustrativos, y no pretenden limitar la invención de ninguna forma.
10
Ejemplo 1
Preparación de 1C H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH2
15
20
25
El péptido sintético se preparó usando resina Knorr. Los aminoácidos usados tenı́an su grupo alfa
amino protegido con Fmoc y la cadena lateral de tirosina protegida con tBu. La dimetilformamida usada
en el paso de acoplamiento era libre de dimetilamina. El DMF usado para las etapas de lavado y el TFA
eran de pureza Biograde. Para la etapa de purificación se usó H2 O purificada con USP y acetonitrilo
de grado HPLC. Todos los solventes restantes fueron de pureza ACS y se usaron como tales sin ninguna
purificación.
La sı́ntesis en fase sólida se realizó manualmente en la resina, teniendo una carga de 0,84 mMoles/g.
La condensación de péptido se realizó usando de 1,5 a 2 equivalentes de Fmoc-aminoácido, HOBT y BOP
en DMF durante 3-24 horas a temperatura ambiente. Las etapas de desprotección de Fmoc del alfa amino
se realizaron usando 20 % (v/v) de piperidina en DMF durante 25 minutos. La escisión del péptido y
desprotección de la cadena lateral se efectuaron mediante tratamiento con TFA/CH2 Cl2 /anisol. Se trató
la resina péptidica con TFA durante dos periodos de 90 minutos a temperatura ambiente bajo atmósfera
de nitrógeno. Después del lavado con CH2 Cl2 y evaporación, se trató el residuo con éter de etilo, se filtró
el precipitado y se secó bajo vacı́o.
30
Se purificó el péptido crudo obtenido mediante HPLC en una columna C18 10µ-15µ 300A de fase
inversa, con un gradiente de elución usando 0,06 % TFA/H2 O y 0,06 % TFA/acetonitrilo. Se realizó la
monitorización a 220 nm. Se juntaron las fracciones puras y se liofilizaron. El material purificado fue
convertido a su forma de sal hidroclórica para dar el compuesto de tı́tulo puro.
35
De forma similar, también se sintetizaron los siguientes péptidos:
1A
1B
40
H-Tyr-D-Ala-Phe-Phe-NH2
H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH2
Ejemplo 2
Preparación de 2C H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe-NH2
45
50
55
60
El péptido sintético se preparó usando resina Knorr. Los aminoácidos usados tenı́an su grupo Alfa
amino protegido con Fmoc y las siguientes cadenas laterales protegidas: (Pmc) para D-Arginina, y tBu
para Tirosina. La dimetilformamida usada en la etapa de acoplamiento estaba exenta de dimetilamina.
El DMF usado para las etapas de lavado y el TFA eran de pureza Biograde. Para la etapa de purificación
se usó H2 O purificado con USP y acetonitrilo de grado HPLC. Todos los solventes restantes fueron de
pureza ACS y se usaron como tales sin ninguna purificación.
La sı́ntesis en fase sólida se realizó manualmente en la resina con una carga de 0,84 mMoles/g. La
condensación de péptido se realizó usando 2 equivalentes de Fmoc-aminoácido, HOBT y BOP en DMF
durante 2-5 horas a temperatura ambiente. Las etapas para desproteger alfa amino de Fmoc se realizaron
usando 20 % (v/v) piperidina en DMF durante 25 minutos. La escisión del péptido y desprotección de
la cadena lateral fueron efectuados mediante tratamiento con TFA/CH2 Cl2 /Anisol. La resina péptidica
fue tratada con TFA durante dos periodos de 90 minutos a temperatura ambiente bajo atmósfera de
nitrógeno. Después del lavado con CH2 Cl2 y evaporación, se trató el residuo con éter de etilo, se filtró el
precipitado y se secó bajo vacı́o.
El péptido crudo obtenido fue purificado mediante HPLC en una columna C18 10µ-15µ 300A de fase
inversa, con un gradiente de elución usando 0,06 % TFA/H2 O y 0,06 % TFA/Acetonitrilo. Se realizó la
6
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monitorización a 220 nm. Se juntaron las fracciones puras y se liofilizaron.
De forma similar, se sintetizaron los siguientes compuestos peptı́dicos:
2A
2B
5
H-Tyr-D-Arg-Phe-Phe-NH2
H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH2 ;
Ejemplo 3
10
Ensayo de unión de radioligando
Preparación de la membrana
15
20
Mediante inhalación de CO2 se sacrificaron ratas macho Sprague-Dawley que pesaban entre 350-450 g.
Las ratas fueron decapitadas y los cerebros menos cerebelo fueron extraı́dos y colocados en una solución
salina enfriada con hielo y después se homogenizaron en un tampón Tris 50 mM pH 7,4 enfriado con hielo
(10 ml/cerebro). Se centrifugaron las membranas a 14000 rpm durante 30 min a 4◦ C. Se resuspendieron los pellets en aproximadamente 6 ml/cerebro de tampón Tris 50mM pH 7,4 enfriado con hielo y se
guardaron a -78◦ C hasta su utilización. Se realizó la cuantificación de proteı́na de los homogenizados de
cerebro según el equipo adquirido para el ensayo de proteı́na (Bio-Rad)
Inhibición por radioligando
25
30
35
Se usaron (3 H)-DAMGO y (3 H) DAGLE como radioligandos para los receptores µ y δ, respectivamente. Se incubaron 50 µl de radioligando, 100 µl de membranas y diluciones seriadas del compuesto
prueba durante 1 h a 22◦ C. Se determinó la unión no especı́fica usando un exceso de 500 veces del ligando
no marcado en la presencia de indicador y membranas. Se separó el ligando libre del unido mediante
filtración a través de papel Whatman GF/B (previamente empapado con 1 % polietilenimina en solución
acuosa) y lavado con Tris 50mM pH 7,4 enfriado con hielo usando un colector Brandel de células. Se
secaron los filtros y se contó la radioactividad en micro placas de 24 pozos en presencia de 500 ml de
centelleante por pozo. Se midió la radioactividad usando un contador Microbeta Wallac 1450.
Se determinaron las Ki para los diferentes compuestos a partir de IC50 según la ecuación de Cheng y
Prusoff. Los resultados del ensayo de unión se sumarizan en la tabla 1.
Se determinó la actividad de los compuestos peptı́dicos en receptores µ mediante el ensayo de ı́leo de
cobaya (GPI) (preparación de músculo longitudinal) según los procedimientos descritos en Schiller et al.,
Biophys. Res. Commun., 85, p.1322 (1975). Los resultados de actividad se sumarizan en la tabla 1.
40
Ejemplo 4
Ensayo de placa caliente (medida de la actividad analgésica) realizado a 55◦ C
45
Para este ensayo, se usaron ratones macho CD #1 que pesaban entre 20 y 25 g. Se pesaron los ratones,
se marcaron y se dividieron en grupos de 10.
Se trataron los ratones mediante inyección subcutánea del compuesto (o el standard o el medio) en
un volumen de inyección equivalente a 0,1 ml/10g p.c. (10 ml/Kg).
50
55
60
Se evaluaron los ratones individualmente para su tiempo de reacción en la placa caliente. La temperatura de la placa caliente (Sorel, modelo DS37) se fijó a 55◦ C. Se observaron los signos de incomodidad de
los ratones tales como lamedura o agitación de las patas, intento de escapar (saltando fuera de la placa)
o temblor. El tiempo de reacción se contó cuando uno de estos signos aparecı́a y se tomó en “segundos”.
Se observó cada ratón por un periodo máximo de 30 segundos a fin de evitar daño al tejido de las patas.
Para cada lectura de tiempo, se multiplicó la media del tiempo de reacción del grupo control por
1,5. Se comparó el tiempo de reacción de cada ratón tratado con el “media control x 1,5”. Si el tiempo
de reacción era inferior al de “media control x 1,5”, se consideró que el ratón no habı́a tenido efecto
analgésico. Si el tiempo de reacción era superior al de “media control x 1,5”, se consideró que el ratón
habı́a tenido efecto analgésico. El número de ratones analgésicos en un grupo determinó el porcentaje
analgésico del compuesto para esta lectura. Si el porcentaje analgésico era inferior a 30 %, el compuesto
se consideró inactivo.
7
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Los resultados se muestran en figuras 1 a 3.
Ejemplo 5
5
Ensayo de contracciones abdominales
10
15
La prueba se realizó en ratones macho CD #1 que pesaban entre 18 y 22 g. Se pesaron los ratones
y se marcaron. Se inyectaron, por vı́a intra-peritoneal, con 0,3 ml/20 g de peso con una solución de
fenilquinona a 0,02 %. Se contaron las contorsiones que aparecieron durante un periodo de tiempo de 15
minutos después de la inyección. Se inyectó la fenilquinona a intervalos de tiempo de 5, 20, o 60 minutos
después de la administración del compuesto (o medio o estándar) por vı́a subcutánea.
La solución de fenilquinona∗∗ 0,02 % fue preparada de la siguiente manera. Se disolvieron 20 mg de
fenilquinona en 5 ml de etanol 90 % (sigma, reactivo, alcohol).
La fenilquinona disuelta se añadió lentamente a 95 ml de agua destilada agitada continuamente y precalentada (no hervida). La solución de fenilquinona se dejó 2 horas antes de su uso, y siempre, protegida
de la luz. Cada dı́a se preparó solución nueva para la prueba.
20
25
Los resultados de los ensayos están sumarizados en la tabla 1. Se puede apreciar que los compuestos
peptı́dicos de la invención en los que uno o ambos R3 y R4 son Phe(p-F) exhiben mayor selectividad
para el receptor opioide µ comparado con el correspondiente compuesto sin Phe(p-F) ası́ como también
mayor transducción del receptor según se determina en el ensayo GPI. Además, los compuestos de la
invención exhiben mayor actividad analgésica periférica según se determina en el ensayo de contracciones
abdominales.
TABLA 1
Ejemplo
30
Ensayo de unión
Contracción
abdominal
GPI
KµI (nM)
Kδi (nM)
Kδi /Kµi
ED50 (mg/kg)
IC50 (nM)
1A
1,53
625,8
409
1,4
3
1B
0,2
199,6
998
0,2
0,12
1C
0,36
201,2
559
0,5
2A
0,68
1652,6
2430
0,5
2B
0,22
> 1000
2C
0,57
952,5
35
40
45
50
6,7
0,3
1671
0,3
1,52
Ejemplo 6
Ensayo de placa caliente (medida de la actividad analgésica) realizado a 58◦ C
55
Para este ensayo, se usaron ratones macho NMR1 que pesaban entre 20 y 25 g. Se pesaron los ratones,
se marcaron y se dividieron en grupos de 6.
Se trataron los ratones mediante inyección subcutánea del compuesto (o el estándar o el medio) en
un volumen de inyección equivalente a 0,1 ml/10 g p.c. (10 ml/Kg).
60
Se evaluaron los ratones individualmente para su tiempo de reacción en la placa caliente. La temperatura de la placa caliente (IITC, Inc; Modelo 35-0) se fijó a 58◦C. Se observaron los signos de incomodidad
∗∗ 2-fenil-1,4-benzoquinona
(Sigma)
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de los ratones tales como lamedura o agitación de las patas, intento de escapar (saltando fuera de la placa)
o temblor. El tiempo de reacción se contó cuando uno de estos signos aparecı́a y se tomó en “segundos”.
Se observó cada ratón durante un periodo máximo de 20 segundos a fin de evitar daño al tejido de las
patas.
5
El compuesto se consideró analgésico si el tiempo de reacción era significativamente diferente (p<0,05;
ANOVA de dos factores, “sigma slot”) respecto al grupo control.
Los resultados se muestran en la figura 4.
10
Ejemplo 7
Ensayo de retirada de cola
15
Para este ensayo se usaron ratones macho NMRI que pesaban entre 20 y 25 g. Se pesaron los ratones,
se marcaron y se dividieron en grupos de 6.
20
Se trataron los ratones mediante inyección subcutánea de los compuestos (o el estándar o el medio)
en un volumen de inyección equivalente a 0,1 ml/10 g p.c. (10 ml/Kg). Se evaluaron los ratones individualmente para el tiempo de reacción en la prueba de retirada de cola. La latencia a la retirada de la
cola se midió cuando un haz luminoso controlado por reóstato se dirigió a la punta de la cola (IITC Inc.
Modelo 33). Se observó cada ratón durante un periodo máximo de 10 segundos a fin de evitar daños al
tejido.
25
El compuesto se consideró analgésico si el tiempo de reacción era significativamente diferente (p<0,05;
ANOVA de dos factores, “sigma slot”) respecto al grupo control.
Los resultados se muestran en la figura 5.
30
35
40
45
50
55
60
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REIVINDICACIONES
1. Compuesto de fórmula (1):
Z
5
/
X—R1 —R2 —R3—R4 —N
\
Y
10
y sales del mismo
en la que,
15
R1 es Tyr o 2’,6’-dimetiltirosina;
R2 es D-Ala o D-Arg;
R3 es Phe(p-F);
20
R4 es Phe o Phe(p-F);
X es H o C1−6 alquilo; y
Y y Z son independientemente H, o C1−6 alquilo.
25
2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que R2 es D-Ala.
3. Compuesto según la reivindicación 1, en el que R2 es D-Arg.
4. Compuesto según la reivindicación 1, en el que R4 es Phe.
30
5. Compuesto según la reivindicación 4, en el que R2 es D-Ala.
6. Compuesto según la reivindicación 4, en el que R2 es D-Arg.
35
7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que X es H, y tanto Y como Z son
H.
8. Compuesto según la reivindicación 1, seleccionado a partir de:
40
H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH2 ;
y
H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH2 .
45
9. Compuesto H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH2 , y las sales del mismo.
10. Compuesto según la reivindicación 1, seleccionado a partir de:
H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH2 ;
50
y
H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe-NH2 .
11. Compuesto H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe-NH2 , y las sales del mismo.
55
12. Compuesto H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH2 clorhidrato.
13. Composición farmacéutica que comprende un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones
1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 y 12, mezclada con un vehı́culo farmacéuticamente aceptable.
60
14. Composición farmacéutica que comprende un compuesto según la reivindicación 7, mezclada con
un vehı́culo farmacéuticamente aceptable.
10
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15. Uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, y 12
para la preparación de una formulación efectiva para el tratamiento del dolor.
5
16. Uso de un compuesto según la reivindicación 7 para la preparación de una formulación efectiva
para el tratamiento del dolor.
17. Método para la preparación de un compuesto según la reivindicación 1 usando sı́ntesis en fase
sólida.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
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