PROTOCOLO PARA EL ANALISIS Y LA INTERPRETACION DEL QUIMERISMO EN EL TPH 1. Tablas de resumen Definiciones Quimera completa (QC): 100% de celularidad de donante Quimera mixta (QM): <95% de células de donante Quimera splits (QS): células de R en un tipo celular y de D en otro Muestras Receptor: 5 ml en tubo EDTA de sp pre TPH Donante adulto: 5 ml tubo EDTA SCU: microvial, muestra cordón descongelado Recomendaciones NMDP/IBMTR 2001 Técnica: sensibilidad < 1%: STR/VNTR/FISH Muestra: S.P. es más útil que la MO En TPH no mieloablativo: subpoblaciones celulares (LT) c/2-4 semanas hasta QC, o si modificación en IS, o ILD En TPH mieloablativo estándar: 1, 3, 6, 12 meses en celularidad total SP/MO. Tras alcanzar QC: suspender controles Interpretación Valoración del injerto < 20% células D: fallo de injerto SCU día +14: <50-60% de células de D: fallo de injerto Inmunomodulación TPH no mieloablativo QC LT día +30: alto riesgo EICH QM LT + no EICH: ↓ IS / ILD hasta QC QM progresiva: riesgo recaída Seguimiento EMR Sólo demostrada utilidad para detección precoz de recaída en patología mieloide crónica 1 2. Definiciones: Los análisis de quimerismo se utilizan para determinar el origen genotípico de la hematopoyesis pos trasplante en el receptor. El término “quimera” designa a un organismo en el que coexisten poblaciones celulares que derivan de individuos diferentes. En el caso de trasplante alogénico, definiremos las siguientes situaciones pos trasplante: 1. Quimerismo completo (QC): 100% de las células detectadas son del donante 2. Quimerismo mixto (QM): se detectan al menos un 5% de células del receptor: y por tanto, < 95% de células del donante. Dentro del quimerismo mixto podemos distinguir: a. Quimerismo mixto transitorio: en los 6 primeros meses posTPH: es frecuente detectar células del receptor en una proporción inferior al 10%, las cuales revierten en las siguientes determinaciones a quimerismo completo. b. Quimerismo mixto estable: persisten a lo largo del tiempo un proporción entre 1-20% de células del receptor c. Quimera mixta progresiva: las células del receptor aumentan > 10% en las siguientes determinaciones. 3. Quimerismo “ split”: se detectan células del receptor en algún subtipo celular. Ej: 100% de células mieloides del donante pero 100% de LT del receptor 3. Indicaciones del estudio de quimerismo La determinación del quimerismo postrasplante puede ofrecernos información relevante para: 1. Valoración del injerto pos trasplante: útil en cualquier tipo de TPH alogénico, como confirmación del implante de las células del donante o para diagnóstico de fallo de injerto 2. Inmunomodulación: determinación de quimerismo en subpoblaciones de LT de SP en trasplante no mieloablativo para ajustar inmunosupresión o valorar infusión de linfocitos de donante( ILD) 3. Seguimiento de EMR y posible detección precoz de recaídas: especialmente útil en enfermedades de crecimiento lento que no dispongan de otro marcador genético de seguimiento. 4. Muestras Para poder realizar las determinaciones, es necesario enviar previo a trasplante; 1.- Muestra de SP del receptor ( R ):5 ml EDTA (otros tipos celulares del R, por ejemplo, raspado de mucosa oral ofrecen un rendimiento muy bajo) 2.- Una muestra del donante (D): a) Donante adulto: 5 ml EDTA de sp. b) Cordón umbilical: un criovial o también puede utilizarse un segmento adyacente al cordón o una mini-muestra del propio cordón descongelado. Cuando se realice trasplante de doble unidad de cordón umbilical, deberá enviarse una muestra debidamente identificada de cada uno de los cordones a trasplantar. 2 Tras la realización del trasplante, a intervalos regulares de tiempo, se enviarán muestras del receptor (SP/MO). Si SP: 5-10 ml EDTA en función de las subpoblaciones a analizar Si MO: 0.5-1 ml en tubo EDTA. La frecuencia y el tipo de muestra y análisis solicitado dependerán de la enfermedad de base (maligna o no maligna, neoplasia mieloide o linfoide, alta o baja agresividad), del tipo de acondicionamiento (mieloablativo o no mieloablativo), del tiempo desde el trasplante y del resultado de determinaciones anteriores. 5. Métodos de detección del quimerismo 1. Análisis FISH para la detección de cromosomas X e Y en pacientes transplantados de donante de distinto sexo: es una técnica sensible (1%) y permite la cuantificación. Se realiza en MO/SP utilizando sondas fluorescentes que hibridan sobre los centrómeros de los cromosomas X e Y. 2. Análisis de ADN: los métodos basados en PCR son los más sensibles (VNTR y STR), en general su sensibilidad varía entre un 0.1% y un 5% dependiendo del alelo que está siendo medido y el método de detección (radiactivo o fluorescente). Son métodos semicuantitativos, aunque el grado de cuantificación alcanzado se incrementa al usar una PCR multiplex. Se considera que la técnica gold-standar para estudio del quimerismo es el análisis de STR con detección de fluorescencia. En el laboratorio de la FPGMX se realiza análisis de FISH siempre que D y R sean de distinto sexo y un método de PCR multiplex comercial: PowerPlex® 16 HS System que permite coamplificar 16 loci: 15 SRTs y Amilogenina (marcador de cromosomas sexuales). La sensibilidad teórica del método es del 1%, variando entre el 0.8% y el 6.2% dependiendo de la informatividad de las muestras. En cada análisis se amplifican simultáneamente la muestra pretransplante y postransplante del receptor y la muestra donante. En los casos de seguimiento también se amplifica la muestra postransplante previa, guardando la correspondencia médula ósea/médula ósea o sangre periférica/sangre periférica. La fluorescencia del producto amplificado se detecta mediante electroforesis capilar en un ABI 3730 (Applied Biosystems) y el porcentaje del origen celular se realiza según el cálculo del área bajo la curva (Sufliarska S et al) Disponemos de columnas inmunomagnéticas con Ac monoclonal antiCD3 para realización de análisis de quimerismo en subpoblación de LT en SP. La quimera mieloide se analiza con celularidad total de MO o si se requiere con separación de granulocitos por sedimentación en SP. 6. Recomendaciones de NMDP y IBMTR ( Biol BMT 2001, 7: 473-485) Utilizar técnicas de sensibilidad adecuada ( al menos < 1%): STR/VNTR/ FISH en trasplantes de diferente género. La sangre periférica, es de forma general, más útil que MO. El quimerismo de células totales en MO documenta la quimera de células mieloides, pero se correlaciona pobremente con la quimera de células T y de otros linajes. 3 El análisis de quimerismo en subpoblaciones celulares debería ser de elección en el trasplante con acondicionamiento no mieloablativo. Los análisis de quimerismo en el trasplante mieloablativo no manipulado utilizando profilaxis frente a EICH estándar no son imprescindibles y su realización puede ser opcional. Sería suficiente obtenerlo a 1, 3, 6 y 12 meses. Una vez alcanzado el quimerismo completo, es innecesario repetirlo, a no ser que haya un cambio en la clínica del paciente que lo recomiende. Si se utiliza un régimen de profilaxis de EICH no estándar o manipulación del injerto ( ej: depleción T), sí sería recomendable realizar estos estudios. En los TPH no mieloablativos el patrón de quimerismo puede ser predictivo de EICH ( aumento de quimera de LT) o fallo de injerto ( pérdida de un 20% de quimera en LT). Cuando se planificación la inmunomodulación con ILDs: se deben realizar análisis en sp c/ 2-4 semanas hasta la primera administración de ILDs: a) Iniciar ILD si: 1) Disminuye la quimera de LT (pero al menos un 20% pertenece al donante), 2) Quimera mixta estable de > 2 semanas 3) Enfermedad persistente o progresiva. b) Una vez iniciada la ILDs: realizar quimerismo en LT c/ 2-4 semanas c) Si el paciente presenta EICH y no es candidato a ILDs o si presenta quimera completa: realizar c/ 3-6 meses Para anemia aplásica: se recomienda análisis de quimerismo a 1, 3, 6 y 12 meses en SP no fraccionada Para enfermedades no malignas distintas de anemia aplásica: 1, 2 y 3 meses pos TPH Si la proporción de células del donante disminuye: aumentar la frecuencia de las determinaciones: c/ 4 semanas En algunas enfermedades puede ser necesario quimerismo en determinadas subpoblaciones ej: en determinadas inmunodeficiencias, sorting para seleccionar población CD132 o CD127 (no disponibles actualmente en el laboratorio de la PMXPG) 6.- BASADOS EN ESTAS RECOMENDACIONES PROPONEMOS: Tipo de muestra y subpoblación a estudiar: 1.- Celularidad total en SP o MO en trasplante mieloablativo 2.- LT en SP en trasplante no mieloablativo 2.- Neutrófilos en SP (o celularidad total en MO) en patología mieloide Frecuencia de las determinaciones: a) Trasplante de donante adulto con acondicionamiento mieloablativo: buscaremos la valoración del injerto y el seguimiento de EMR i. Determinación en población total de MO/SP a día +30, +100, +180, + 1 año. Puede interrumpirse tras alcanzar QC ii. Otras determinaciones en función de la situación clínica del paciente. 4 b) Trasplante de donante adulto con acondicionamiento no mieloablativo: especial atención a la inmunomodulación. i. Determinación de subpoblación de LT en sp desde el día +30 c/ 2-4 semanas hasta QC ii. Determinaciones c/ 2 semanas en LT en SP si se están realizado disminución de inmunosupresión o ILD iii. Determinaciones en población total de MO día +30, +100 +180 y al año, sobre todo si patología mieloide/mieloma para valorar EMR. Otra opción es realizar análisis en subpoblación no linfoide en SP c) Trasplante de cordón umbilical: especial atención a la valoración del injerto. Determinación precoz a día+14 como factor que predice el fallo de injerto. i. Determinación de quimerismo en LT de SP a día +14, +28 y c/ 2-4 semanas hasta QC. ii. Otras determinaciones en función de la situación clínica del paciente 7.- Interpretación de los resultados: aspectos prácticos En trasplantes de cordón umbilical resulta de utilidad la realización de una determinación de quimerismo en MO y/o LT de SP a día +14. Datos de algunos centros sugieren que un niveles de bajos de hematopoyesis del cordón en el día +14 (¿ < 64%?) se correlacionan con fallo de injerto. Esta información puede ser de utilidad para preparar un segundo trasplante. En TPH con donante adulto, la existencia de < 20% de células del donante en cualquier momento pos TPH se correlaciona con fracaso de injerto El quimerismo completo en LT a día +30 en TPH no mieloablativo se correlaciona con alto riesgo de EICH y la quimera mixta estable precoz en LT con bajo riesgo de EICH En ausencia de EICH; debemos de tratar de convertir las quimeras mixtas en quimeras completas para reducir el riesgo de recaída, especialmente en casos de quimeras mixtas progresivas. Ello se logra disminuyendo la inmunosupresión y realizando infusiones periódicas de ILDs Debido a la sensibilidad de las diferentes técnicas, el quimerismo no puede ser considerado de elección para seguimiento de EMR en las enfermedades que dispongan de otro marcador (ej : BCR-ABL en LMC o LAL Ph+) En enfermedades de crecimiento rápido la recaída clínica suele producirse muy pronto tras la quimera mixta y no da oportunidad de maniobras terapéuticas Existen pacientes con quimeras mixtas linfoides estables de larga duración, en los que no se produce recaída clínica de su enfermedad y cuyo estado de quimerismo mixto les protege de EICH severa. 5 BIBLIOGRAFIA SELECCIONADA: J H Antin et al. Establishment of complete and MIxed Donor Chimerism After Allogeneic Lymphohematopoietic Transplantation: Recomendations Form a Workshop at the 2001 TAmdem Meetings. Biology of Blood and Marrow Transplant, 2001; 7: 473-485 (2001) Shaun R McCann et al. Hematopoietic chimerism following stem cell transplantation. Transfusion and apheresis science 2005; 32: 55-61 P. Bader et al. How and when should we monitor chimerism after allogeneic stem cell transplantation?. Bone marrow Transplant 2005; 35:107-119 F Khan et al. Significance of chimerism in hematopoietic stem cell transplantation: new variations on an old theme. Bone marrow Transplant, 2004; 34, 1-12 JL Liesveld et al. Mixed chimerism in SCT: conflict or peaceful coexistence?. Bone Marrow Transplant, 2008; 42, 297-310 D. Kristt et al.Quantitative monitoring of multidonor chimerism: a systematic, validated framework for routine analysis. Bone Marrow Transplant 2009 doi: 10.1038/bmt.2009.120 T Lion. Detection of impending graft rejection and relapse by lineage specific chimerism analysis. Methods Mol Med 2007; 134: 197-216 Sufliarska S et al. Establishing the method of chimerism monitoring after allogeneic stem cell transplantation using multiplex polymerase chain reaction amplification of short tandem repeat markers and Amilogenin. Neoplasma 2007. 54,5: 424-430. -------------------------------------------------------------------------------------------------------Manual de diagnóstico genético y seguimiento de las neoplasias hematológicas. Editado por el Grupo para el Estudio de las Hemopatías Malignas de Galicia (GEHMA) de la Asociación Gallega de Hematología y Hemoterapia (AGHH) Capítulo: Determinación de quimerismo en alotrasplante hematopoyético. Autores: Carmen Albo y Sonia González. Complexo Hospitalario Xeral Cies- Vigo y H. Clínico Universitario de Santiago (CHUS.) Revisión por Teresa González y Celsa Quinteiro. Fundación Pública de Medicina Xenómica (FPMX) de Galicia. Actualizado a 28/02/10. 6