C U L T IV O in vitro A n th u riu m an d rean u m
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JUAN MANUEL SALGADO MEJIA CULTIVO in vitro Anthurium andreanum INTRODUCCIÓN Junto con las orquídeas son el principal producto comercial en el sector de la floricultura mundial (Buldewo, 2002). Presente en los Andes Suramericanos. Plantas originarias del trópico americano. Anthurium andreanum • Es uno de los principales productos agrícolas en naciones (Adelheid et al., 1992; Pérez, 1997) como Holanda (25 millones), Venezuela, Jamaica, Estados Unidos (11 millones) y Las Islas Mauricio (10.2 millones). Su principal uso se centra en la parte ornamental (García, 1992). • En el año 2000, el 95% de las flores exportadas constituían Anthurium, (Puchooa, 2003). Según Puchooa,(2003) el método para la producción in vitro de Plántulas de Anthurium andreanum fue desarrollado en principio por Pierik e al.,(1974). Anthurium andreanum Prakash, (2005) considera que son producidas para satisfacer las mayores preferencias del mercado en cuanto a color, forma y tamaño. Esta industria esta compuesta por cerca de 600 compañías en el mundo con una producción superior a los 500 millones de unidades por año (Pérez, 1997). Anthurium andreanum Biota Dominio Eukaryota Reino Plantae Subreino Viridaeplantae PhylumTracheophyta Subphylum Spermatophytina Infraphylum Angiospermae Clase Liliopsida Subclase Aridae Superorden Aranae Orden Arales Familia Araceae Subfamilia Photoideae Género Anthurium Especie Anthurium andreanum CLASIFICACION TAXONÓMICA DE Anthurium andreanum FAMILIA ARACEAE GENERO Typhonium NIVEL DE CLASIFICACIÓN HO HO OH O OH O O OH 2’’-O-glucosilvitexina OH HO O HO OH OH COOCH3 13-Feniltridecanoato de metilo ESTRUCTURA Franke et al., (2005) Choo et al., (2004) REFERENCIA MARCADORES QUIMIOTAXONÓMICOS DENTRO DE LA FAMILIA ARACEAE ESPECIE Homalomena occulta ESPECIE Pinellia ternata FAMILIA ARACEAE HO HO HO HO OH O O OH O O OH OH OH HO O O OH O O O O OH OMe OH OMe HO OH O O CH2OH pinellosido 1 OH Henderagenina HOOC HN O O HO HOOC 6’-Sinapoyl-2’’-O-glucosilvitexina HOHO OH HO OH OH O O CO Elbandy et al., (2004) Chen et al., (2003) Franke et al., (2005) MORFOLOGÍA Vascularidad central Vascularidades secundarias Sistema radical fibroso Raíces adventicias Forma de corazón HOJA RAÍZ Espádice Espata Hoja desdiferenciada FLOR Modelo de desarrollo en forma de espiral 300 flores verdaderas Inflorescencia ESPÁDICE Alberga una o varias semillas Forma de baya Ubicados en la base del espádice FRUTOS MADUROS JUSTIFICACIÓN • El cultivo in vitro es más rápido que los procedimientos tradicionales conocidos. El ciclo de reproducción se reduce considerablemente, obteniendo mas plantas en menos tiempo. • El cultivo de tejidos es importante como herramienta para la propagación masiva de vegetales, debido a que se disminuyen los costos y el porcentaje de regeneración es bastante alto. • La innovación del sistema de propagación para esta especie es muy importante para una aplicación comercial dadas las condiciones climáticas del eje cafetero donde es común encontrar esta especie. • La asepsia en esta técnica permite eliminar virus y enfermedades, además se explotan cualidades importantes en las especies. • El establecimiento de un banco de germoplasma con las principales variedades colombianas constituye una ventaja tanto comparativa como competitiva frente a los demás países productores de Anthurium andreanum, proporcionando material vegetal de gran calidad y bajos costos a los productores. • El panorama alrededor del cultivo in vitro de esta especie en un país biodiverso y en vías de desarrollo, hace necesaria la implementación de las tecnologías disponibles para la producción de flores. • Existe evidencia con soporte farmacológico acerca de la potente actividad biológica de sus extractos vegetales. OBJETIVOS • Proyectar una propuesta de negocio relacionada con la propagación in vitro masiva de plántulas de Anthurium andreanum. • Considerar la importancia de los metabolitos secundarios producidos por Anthurium andreanum en condiciones de cultivo in vitro. • Definir una metodología del cultivo in vitro de Anthurium andreanum para su micropropagación a gran escala. METODOLOGÍA BANCO DE GERMOPLASMA CULTIVO in vitro SIEMBRA ESTERILIZACIÓN ORIGEN DEL EXPLANTE CULTIVO in situ SELECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL PRECIO DISPONIBILIDAD in situ TOTIPOTENCIA BANCO DE GERMOPLASMA ORIGEN PLANTA ÉLITE SELECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL ÁPICE RADICAL RAÍZ TRANSFORMADA RAÍZ HOJA ESPÁDICE FLOR VERDADERA AISLAMIENTO FRUTO EXPLANTE ESPATA SEMILLA ORIGEN DEL EXPLANTE Chen, (1997) Chen, (1997) Raíz Adelheid et al., (1992) Espádice Espata Chen, (1997) Te-Chato et al., (2006); Adelheid et al., (1992) Semillas Yemas Chen, (1997); Aldelheid, (1992) Musa, (1997) Embriones somáticos derivados de cortes de explante de hojas cultivadas in vitro Plántulas cultivadas in vitro Puchooa, (2003); Adelheid et al., (1991) Adelheid et al., (1992); Geier, (1986) Musa, (1997); Geier, (1986); Aldelheid, (1992) Te-Chato et al., (2006); Chen, (1997) Vargas et al., (2004); Aldelheid, (1992) Te-Chato et al., (2006) Adelheid et al., (1992) Referencia Cultivo de callos embriogénicos desde peciolos Hojas Brotes adventicios Brotes axilares Explante ANTECEDENTES EN Anthurium andreanum y A. spp. EL OPERADOR EL AIRE EL MEDIO Hipoclorito de sodio Etanol Tween-20 5 6 AGENTE 2 1 0.01-0.1 70-90 1-3 CONCENTRACION (%) AGENTES ESTERILIZANTES DE NATURALEZA QUÍMICA EMPLEADOS EN Anthurium andreanum LA PLANTA FUENTES DE INFECCION ASEPSIA Posteriormente; es necesaria otra esterilización de corta duración durante la disección, puede ser seguida por abundantes lavados durante este procedimiento (Reinert, 1977) Lavar con agua destilada estéril, primero un baño rápido y luego agitando durante 5 minutos Usar blanqueador comercial diluido al 10% (v/v) como esterilizante principal sumergiéndolo de 3 a 15 minutos Sumergir en etanol al 70% Remover el suelo, el tejido muerto o enfermo PROCEDIMIENTO PARA ESTERILIZACION DE EXPLANTES DE Anthurium MEDIOS DE CULTIVO CABINA DE FLUJO LAMINAR INOCULACION OPERADOR ASEPSIA PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO SIEMBRA MATERIAL DE TRABAJO Musa, (1997) Te-Chato et al., (2006) Acido naftalenacético (ANA) Acido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) Thidiazuron (TDZ) 2 3 4 5 Linz, (2005); Vargas et al., (2004) Adelheid, (1992); Musa, (1997) Kinetina 1 Adelheid, (1992); Chen, (1997); Linz (2005); Vargas et al., (2004) Referencia Benciladenina (BA) N° Regulador de Crecimiento REGULADORES DE CRECIMIENTO --------------------- Reguladores Embriones transferir Explantes de raíz MS para 0.8 ppm 0.2 ppm 6-benciladenina Embriones somáticos 1.0 – 4.0 ppm 2,4-D secundarios sin la intervención de callos 0.33–1.0 ppm Kinetina sobre la superficie de embriones primarios Brotes y callos Tejido MS ½MS MS Medio de cultivo --------------------- 2.5 % sacarosa 2.0 % sacarosa 1.0 % glucosa --------------------- Otros componentes Norman (1994) Referencia Chen (1997) Adelheid (1992) Adelheid (1992) CULTIVO in vitro DE Anthurium andreanum MEDIOS DE CULTIVO Embriones somáticos convertidos en plantas completas Callos Callos Callos ½MS NN WPM hojas MS de Explantes jóvenes Tejido MM Medio de cultivo 2.0 % sacarosa 2.0 % sacarosa 3.0 % sacarosa 3.0 % sacarosa 3.0 % sacarosa 4.0 ppm 2,4-D 0.1 ppm Kinetina 0.5 ppm TDZ 0.5 ppm BA 0.5 ppm TDZ 0.5 ppm BA 0.5 ppm TDZ 0.5 ppm BA Reguladores Otros componentes Te-chato et al., (2006) Te-chato et al., (2006) Te-chato et al., (2006) Musa (1997) Musa (1997) Referencia Chen, (1997) Matsumoto, (1998) Embriones somáticos secundarios Plantas completas resistentes a kanamicina Embriones zigóticos Embriones somáticos primarios Cortes de raíz trasformada con A. tumefaciens transmitiendo el vector binario pCa2Att Semillas maduras completas Adelhied, (1992) Chen, (1997) Regeneración de plantas completas Raíz REFERENCIA RESULTADO TIPOS DE EXPLANTE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES Anthurium andreanum RESPUESTA OBTENIDA Adelheid et al., (1992) Pierik, (1990) Adelhied et al., (1992) Embriones Regeneración directa Callos organogénicos Callos embriogénicos Callos Hojas Callos y brotes Te-Chato et al., (2006) Callos Brotes adventicios Geier, (1986) Adelheid et al., (1992) Te-Chato et al., (2006) Adelhied, (1997) Protoplastos Embriones zigóticos Vargas et al., (2004) Callos Semillas germinadas Protoplastos Embriones somáticos Callos embriogénicos Planta completa Protocormos, brotes y yemas adventicias, hojas, raíces, esquejes de tallo (En Anthurium) Callos organogénicos Callos Desdiferenciación celular Explante Embriones somáticos Callos friables Protoplastos Células individuales Agregados celulares DIAGRAMA DE REGENERACIÓN INDIRECTA EN Anthurium andreanum y A. spp. CALLO JOVEN EMBRIOGÉNICO CALLO ADULTO ORGANOGÉNICO CALLO ADULTO CALLO JOVEN TIPO DE CALLO Aparecen embriones somáticos sobre la superficie del mismo. Aparecen sobre su superficie grupos celulares diferenciados (órganos bizarros) como los que conforman la espata (color rojo en la superficie) Bicolor o multicolor sin brillantes. Se desagrega fácilmente en células individuales dándole características de callo friable. Coloración clara, unicolor y brillantes superficial. Se muestra resistente a daños mecánicos. CARACTERISTICAS CULTIVO DE CALLOS • Así mismo, el intercambio gaseoso cambia por lo que se recomienda un cambio progresivo en el tamaño de la atmósfera circundante. • Se debe realizar un cambio progresivo en las condiciones de cultivo debido al cambio drástico de la fuente de carbono (azucares → CO2) CULTIVO in situ • La grava volcánica mezclada con compostaje y astillas de madera esterilizados han mostrado ser útiles para el establecimiento in situ de Anthurium andreanum • El clima calido y húmedo con un promedio anual de temperatura entre 24-26°C, precipitación anual de 2800 mm, radiación fotosintética entre 27-41 mol/m2/día es optimo para el cultivo. • El cambio en el sustrato o soporte sólido afecta la respiración y el intercambio de nutrientes, por lo que se recomienda iniciar el cambio progresivo cuando el sistema radical se encuentre en un estado avanzado de desarrollo. • La humedad in vitro es mayor, por lo que se debe asegurar un buen suministro de agua luego del cambio de cultivo. CONCLUSIONES • El aporte que se puede hacer al cultivo in vitro desde el punto de vista de la micropropagación de monocotiledóneas puede ser muy importante. • La vistosidad y accesibilidad del Anthurium andreanum lo convierte en un protagonista en el cultivo in vitro de nuestro país. • El estado del arte permite el establecimiento de un sistema de producción para el comercio colombiano de flores de Anthurium; una biofábrica para la explotación comercial de esta especie. • El cultivo in vitro es una estrategia viable para la producción y comercialización de especies ornamentales. PERSPECTIVAS • El presente trabajo puede contribuir de una manera muy importante al comercio regional y a los pequeños productores para que puedan rotar cultivos o simplemente para variar la reducción como una alternativa para ingresos adicionales; además permite proveerles material vegetal valioso y mejorar las variedades existentes. • En comparación con las orquídeas que son la familia de mayor comercio en el mundo, las flores de corte de Anthurium las superan en cuanto a tiempo de vida proyectándolas como material vegetal valioso para el comercio internacional. • El aporte que se puede hacer a la física desde el punto de vista de la termodinámica clásica (transferencia de masa y transformación de las diferentes formas de energía) tomando los medios de cultivo como modelos diferenciales para establecer las leyes de la conservación de la masa y la energía. A la escuela de Tecnología Química por albergarme en su seno durante este corto periodo de mi vida. A Adriana por iniciarme en la senda práctica de esta ciencia química física tan apasionante. Agradezco al profesor Jaime por soportar mi estado de animo intermitente durante el proceso de realización de la monografía. Doy gracias a mi familia y a todas las personas que indirectamente aportaron al desarrollo de esta monografía. AGRADECIMIENTOS Adelheid, R K; Fure-Chyi Chen; Nellie Sugii (1992). Somatic embryogenesis and plant regeneration in Anthurium andraeanum hybrids. Plant Cell Reports. 11: 438-442. Chen, F; Adelheid R. K; Nellie S. (1997). Anthurium roots for micropropagation and Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 49. Chen, J.H.; Cui, G.Y.; Tan, R.X. (2003). Pinelloside, an antimicrobial cerebroside from Pinellia ternata. Phytochemistry 64: 903-906. Dufour, L; Guérin, V. (2005). Nutrient Solution Effects on the Develoment and Yield of Anthurium andreanum Lind. in Tropical Soilless Conditions. Scientia Horticulturae 105: 269-282. Musa H; Abdul G; Abdul K; Pierre D. (1997). Somatic embryogenesis and plant regeneration in Anthurium scherzerianum. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 48: 189-193. Geier, T. (1986). Factors affecting plant regeneration from leaf segments of Anthurium scherzerianum Schott (Araceae) cultured in vitro. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 6: 115125. Linz, R; Scorza, R. (2005). Internacional Symposium of Biotechnology of temperate Fruit Crops and Tropical Species. Program and Abstract Book. University of Florida. October 10-14, Daytona Beach, FL, USA. Matsumoto, T R; Adelheidr, K; Webb, D T. (1998). Zigotic Embriogénesis in Anthurium (Araceae). American Journal of Botany 85: 1560-1568. • • • • • • • • BIBLIOGRAFÍA Okoli, C O; Akah, P A. (2004). Mechanisms of the anti-inflamatory activity of the leaf extracs of Culcasia scandens P. Beauv (Araceae). Pharmacology, Biochemistry and Behavior 79: 473481. Paull, R B; Chantrachit, T. (2000). Benciladenine and de Base Life of Tropical Ornamentals. PostHarvest Biology and Technology 21: 303-310. Pierik, R.M.L. (1990). Cultivo in vitro de las Plantas Superiores. Barcelona, España. 200 paginas. Puchooa, D; Sookun, D. (2003). Induced Mutation and in vitro Culture of Anthurium andreanum. AMAS. Food and agricultural Research Council, Reduit, Mauritius. 1-12 p. Reinert, J; Bajaj, Y.P.S. (1977). Applied and Fundamental Aspects of Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. Springer-Verlag. N York. USA. 803 p. Roger, J V; Barabe, D. (2001). Application of Two Mathematical Models to Araceae, a Family of Plants With Enigmatic Phyllotaxis. Annals of Botany 88: 173-186. Te-Chato, S.; Susanon, T. Sontikun, Y. (2006). Cultivar, Explant Type and Culture Medium Influencing Embryogenesis and Organogenesis in Anthurium spp. Journal of Science Technology 28: 717-722. Vargas, T.E; Mejías, A; Oropeza, M; García, E. (2004). Plant Regeneration of Anthurium andreanum cv. Rubrun. Electronic Journal of Biotechnology 7: 1-5. • • • • • • • • Cultivo in vitro Anthurium andreanum CULTIVO in vitro de Anthurium andreanum MONOGRAFIA PRESENTADO POR: JUAN MANUEL SALGADO MEJÍA CODIGO: 9865300 DIRECTOR JAIME NIÑO OSORIO GRUPO DE INVESTIGACION BIOTECNOLOGÍA PRODUCTOS NATURALES i Cultivo in vitro Anthurium andreanum UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE PEREIRA FACULTAD DE TECNOLOGÍA ESCUELA DE TECNOLOGÍA QUÍMICA JULIO 11 DE 2007 “Dedico esta monografía a todas las mujeres de mi tierra que como las de mi familia han luchado por educar a sus hijos y nietos dejando a un lado sus propios sueños, enriqueciendo cada vez más nuestra formación. Han hecho de mi vida un paraíso sin igual.” A todas ellas… Gracias desde lo más profundo de mi corazón. ii Cultivo in vitro Anthurium andreanum TABLA DE CONTENIDO LISTA DE TABLAS ................................................................................................... ivi LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. vii INTRODUCCION......................................................................................................... 1 JUSTIFICACION ......................................................................................................... 3 OBJETIVOS ................................................................................................................. 5 OBJETIVO GENERAL .....................................................................................5 OBJETIVOS ESPECIFICOS ............................................................................5 MARCO REFERENCIAL ............................................................................................ 6 CAPITULO I. DESCRIPCION ................................................................................... 7 1. 2. 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5. 3. 4. Clasificacion taxonómica ....................................................................7 Morfológia ..........................................................................................9 Arales .................................................................................................9 Araceae ..............................................................................................9 Aroideas ...........................................................................................10 Anthurium .........................................................................................11 Anthurium andreanum ......................................................................12 Marcadores quimiotaxonómicos .......................................................14 Distribución geográfica .....................................................................17 CAPITULO II. CULTIVO in vitro Anthurium andreanum ..................................... 19 5. 6. 7. 8. 9. 9.1. 9.2. 10. 10.1. 10.2. 10.3. 10.4. Reseña histórica ..............................................................................19 Generalidades ..................................................................................19 Material vegetal ................................................................................23 Explantes .........................................................................................24 Regeneración directa .......................................................................25 Cultivo de esquejes ..........................................................................26 Cultivo de embriones zigóticos.........................................................26 Regeneración indirecta ....................................................................27 Cultivo de callos ...........................................................................28 Cultivo de yemas ..........................................................................32 Cultivo de embriones somáticos ...................................................32 Cultivo de tejidos transformados ..................................................35 CAPITULO III. ASEPSIA Y ESTERILIZACIÓN .................................................... 36 iii Cultivo in vitro Anthurium andreanum 11. Tipos de microorganismos a combatir .............................................38 11.1. Microorganismos endógenos .......................................................39 11.2. Gusanos microscópicos exógenos ...............................................40 CAPITULO IV. MEDIOS DE CULTIVO .................................................................. 42 12. 13. 14. 15. 15.1. 15.2. 15.3. 15.4. 15.5. 15.6. Medio Murashige & Skoog (MS) ......................................................44 Medio Nitsch & Nitsch (NN)..............................................................44 Regulación del crecimiento ..............................................................46 Condiciones de cultivo .....................................................................47 Fotoperiodo ..................................................................................48 Temperatura .................................................................................49 Subcultivo .....................................................................................50 Establecimiento en campo ...........................................................50 Cuidados post-cosecha ................................................................50 Conservación de la calidad de la flor ............................................51 PROYECTO DE NEGOCIO..................................................................................... 53 CAPITULO V. CONSIDERACIONES..................................................................... 54 16. 17. 18. 18.1. 18.2. 18.3. 18.4. 19. 19.1. Importancia de la especie ................................................................54 Antecedentes ...................................................................................55 Industria mundial ..............................................................................55 Países productores.......................................................................55 Oferta ...........................................................................................56 Demanda ......................................................................................56 Calidad .........................................................................................56 Requisitos para entrar a competir ....................................................57 Saber Como .................................................................................57 CAPITULO VI. METODOLOGÍA ............................................................................. 61 20. Desarrollo del cultivo in vitro. ...........................................................61 CAPITULO VII. PROTOCOLOS DEL LABORATORIO. ..................................... 65 CONCLUSIONES ...................................................................................................... 68 PERSPECTIVAS ....................................................................................................... 69 BIBLIOGRAFIA .......................................................................................................... 70 ANEXOS 75 Anexo 1. Propiedades medicinales importantes de la familia araceae..........76 Anexo 2. Aspectos botánicos de la familia araceae .......................................78 iv Cultivo in vitro Anthurium andreanum Anexo 3. Medio de cultivo MS (1962) .............................................................78 Anexo 4. Medio de Cultivo SH (1972) ............................................................78 Anexo 5. Medio de cultivo NN (1956). ............................................................79 Anexo 6. Medios nutritivos usados en Spirodela polyrhiza. (Appenroth, 2003) .......................................................................................................................79 Anexo 7. Medio para la inducción de yemas de Anthurium desde explantes de raíz por Chen et al., (1997).............................................................................80 Anexo 8. Coloraciones presentadas por las diferentes variedades de Anthurium andreanum en cultivos Holandeses (Reinert, 1977) .....................80 Anexo 9. Componentes solucion micronutrientes MS (mg/ 200mL) .............80 Anexo 10. Componentes solucion de vitaminas MS (mg/200mL) ..................80 Anexo 11. Componentes solucion de Fe-EDTA MS (mg/200mL) ..................80 Anexo 12. Materiales ......................................................................................81 Anexo 13. Reactivos .....................................................................................82 v Cultivo in vitro Anthurium andreanum LISTA DE TABLAS Tabla 1. Cultivo tradicional de Anthurium. ................................................... 19 Tabla 2. Origen de los explantes y respuesta obtenida en el cultivo in vitro. 24 Tabla 3. Tipos de Regeneración directa e indirecta desde diferentes tipos de explantes. ................................................................................. 25 Tabla 4. Efecto del tipo de explante y genotipo de Anthurium andreanum sobre la formación de callos en medio ½MS suplementado con TDZ y 0.5 mg/L de BA después de 8 semanas de cultivo (TeChato et al., 2006) ......................................................................... 30 Tabla 5. Agentes esterilizantes más comunes............................................. 37 Tabla 6. Resultados y parámetros importantes en la obtención de tejidos vegetales in vitro en Anthurium andreanum .................................. 45 Tabla 7. Efecto del medio de cultivo sobre la formación de callos a partir de explantes de hojas y segmentos nodales de Anthurium.. ....... 46 Tabla 8. Reguladores de crecimiento empleados en el cultivo in vitro de Anthurium. ..................................................................................... 47 Tabla 9. Resultados del tratamiento con BA (Paull, 2000) .......................... 51 Tabla 10. Concentración más rentable para alargar el tiempo de vida de los Anthurium en la flor de corte significativamente. .......................... 52 Tabla 11. Composición de la solución nutriente (mmol/L) ............................. 62 vi Cultivo in vitro Anthurium andreanum LISTA DE FIGURAS Figura 1. Representación en forma de pirámide de la clasificación taxonómica de Anthurium andreanum. ............................................ 8 Figura 2. Inflorescencia Anthurium acutibacca (A) (Mora et al., 2003); Espádices típicos del género en el caso de Dracontium (B) (Roger y Barabe, 2001); inflorescencia de Anthurium obtusilobum (C) (Mora et al., 2003). .............................................. 10 Figura 3. Planta completa de Anthurium andreanum..................................... 12 Figura 4.Diferentes órganos de Anthurium andreanum: hoja -A-, espádice B- y flor completa -C- respectivamente. ......................................... 13 Figura 5. Flavonoides de la familia Araceae. ................................................. 15 Figura 6. Estructura del pinellosido 1 [1-O-β-D-glucopiranosil(2S,3R,4E,11E) - 2 - (20R - hydroxyhexadecenoilamino) - 4,11octadecadiene-1,3-diol]. ................................................................ 15 Figura 7. Sitosterol (Sustancia CCS-1) presente en las hojas de Culcasia scandens P. Beauv ........................................................................ 15 Figura 8. Saponina triterpénica Henderagenina aislada de Homalomena occulta (Lour.) Schott. .................................................................... 16 Figura 9. 13-Feniltridecanoato de metilo aislado de T. flagelliforme .............. 16 Figura 10. Diagrama de los procesos in vitro organizados y desorganizados. ............................................................................ 20 Figura 11. Esquema de un proceso in vitro mixto o medianamente organizado.. ................................................................................... 22 Figura 12. Diagrama de Regeneración directa (organogénesis) (Reinert, 1977 y Pierik, 1990). ...................................................................... 26 Figura 13. Diagrama de regeneración indirecta.. ........................................... 28 Figura 14. Inducción de callos sobre explantes de hojas luego de los tratamientos de irradiación............................................................. 29 Figura 15. Callos formados en los explantes de hoja de cada uno de los fenotipos luego de 8 semanas de cultivo en medio ½MS suplementado con TDZ y BA. ........................................................ 30 vii Cultivo in vitro Anthurium andreanum Figura 16. Callos formados desde el nodo de la variedad Sonat empleando el medio ½MS y WPM con TDZ y BA después de 6 semanas de cultivo. (Te-Chato et al., 2006). ...................................................... 31 Figura 17. Posición de los callos formados sobre un explante de hoja sano (A) y otro en el que se realizaron heridas (B) en la variedad de Anthurium Valantino luego de 6-7 semanas de cultivo(Te-Chato et al., 2006). ................................................................................... 31 Figura 18. Embriones irradiados después de dos meses de cultivo. Brotes formados después de la irradiación (Puchooa, 2003). ................... 34 Figura 19. Principales fuentes de infección. .................................................. 36 Figura 20. Imagen de una planta atacada por nematodos. ........................... 41 Figura 21. Desarrollo de las raíces cuando intentan evadir la presencia del nematodo (1). Fotomicrografía de un nematodo (2); las letras A, B y C representan la cabeza y el estileto, la válvula o apertura para poner los huevos y la cola respectivamente. Fotomicrogafía de un huevo de Nematodo (3). ............................. 41 Figura 22. Cambio progresivo en el tamaño del recipiente de cultivo Anthurium durante el establecimiento ex vitro ............................... 48 Figura 23. Planos de un laboratorio de micropropagación a gran escala. .... 59 Figura 24. Esquema para la propagación de plantas usado en los laboratorios Twyford Ltda (Reinert, 1977). .................................... 61 Figura 25. Esquema de posibles rutas in vitro a seguir para la obtención de plántulas completas de Anthurium andreanum (Dufour, 2005). ..... 63 Figura 26. Preparación general de un litro de medio de cultivo (MS) (Niño., 2003). ............................................................................................ 65 Figura 27. Solución de macronutrientes medio MS (1962). STOCK 1 ........... 66 Figura 28. Solución micronutrientes medio MS (1962). STOCK 2 ................. 66 Figura 29. Solución vitaminas MS (1962). STOCK 3 ..................................... 67 Figura 30. Solucion de Fe-EDTA medio MS (1962). STOCK 4 ..................... 67 viii Cultivo in vitro Anthurium andreanum INTRODUCCION El Anthurium andreanum es una angiosperma (Hesse, 2006) clasificada dentro de las monocotiledóneas (Appenroth, 2003), igualmente perteneciente a la familia Araceae (Te Chato et al., 2006). Los hábitat vegetativos de esta familia son muy variados, encontrándose especies epifitas, litófitas e hidrófilas (Stergios and Dorr, 2004; Álvarez et al., 2006; Nie et al., 2006). Los integrantes del género Anthurium presentan una filotaxis muy característica, tanto en hojas, inflorescencias así como raíces y tallos (Roger y Barabe, 2001). Sus hojas son acorazonadas (Álvarez, 2006) y mantiene el patrón del sistema vascular típico del género, raíces aéreas (Williams et al., 1980) y tallos herbáceos (Álvarez, 2006). Algunas especies como el Anthurium andreanum presentan una flor muy particular que esta constituida por un espádice y una espata. El primero corresponde a la inflorescencia, con forma de bastón y compuesta por 300 flores verdaderas diminutas; mientras que la segunda corresponde a una hoja modificada o desdiferenciada. La espata presenta coloraciones vistosas, superficial brillantes y con un tiempo de vida muy razonable con respecto a otras especies (García, 1992; Roger y Barabe, 2001). Las anteriores cualidades hacen que la especie tenga una demanda mundial muy pronunciada y haga de ella uno de los principales productos agrícolas en determinadas naciones (Adelheid et al., 1992; Pérez, 1997). Holanda, Venezuela, Jamaica, Estados Unidos, Las Islas Mauricio, son algunos ejemplos de países productores de Anthurium andreanum. Su principal uso se centra en la parte ornamental (García, 1992). Integrantes de la familia e incluso del mismo género han presentado actividad biológica notable (Okoli, 2004). Enfermedades como el cáncer (Choo et al., 2005; Manpreet et al., 2006; Kaur et al., 2006) y respuestas fisiológicas como la inflamación (Chen et al., 2003), muestran unas de las tantas aplicaciones que tienen los diferentes tipos de extractos vegetales. Adicionalmente existen especies empleadas en actividades artesanales (Plowden et al., 2003). Los sistemas de producción no varían de los convencionales, es decir, manejan las mismas variables climáticas y genéticas, donde la diferencia la hace el tipo de tecnología empleada para el desarrollo de la producción vegetal. Los países con menores recursos económicos y tecnológicos, 1 Cultivo in vitro Anthurium andreanum recurren a las técnicas de cultivo manual en campo también denominado in situ (Reinert, 1977). Los más desarrollados tecnológicamente, realizan una mezcla de producción de invernadero para obtener clones, híbridos, mutantes; en fin, especímenes con valor agregado (Puchooa, 2003). De esta manera pueden controlar los diferentes factores biológicos, logrando el crecimiento y desarrollo de especies vegetales (Teixeira, 2005). Estos factores están constituidos por variables físicas como la luz, humedad, altura sobre el nivel del mar (Pierik, 1990; Pataky, 2001; Buldewo, 2002) y variables químicas como los nutrientes y los reguladores (Adelheid et al., 1992; Vargas et al., 2004). Además se presentan necesidades biológicas de la planta que el cultivador tiene que manejar, como la reproducción y conservación de la especie. De esta manera aparece el cultivo in vitro de tejidos vegetales como una tecnología en cuanto al desarrollo científico e investigativo, encaminado al conocimiento del reino vegetal (Reinert, 1977). La manipulación de los factores climáticos y recursos genéticos permiten, mejorar cuidadosamente las especies o modificarlas de tal manera que puedan suplir nuestras necesidades (Barz et al., 1976). La contaminación microbiana se convierte en la principal falla del sistema (Reinert, 1977). Cualquier microorganismo desplazará el tejido apoderándose del medio (Roca, 1993; Norman, 1994; Uchida et al., 2003). Otro motivo de fracaso es la ausencia de totipotencia del tejido vegetal escogido para sembrar. La totipotencia es una de los requisitos de esta técnica y se define como la capacidad que presentan los organismos vegetales para tener disponible la información genética necesaria para desarrollar otro individuo de las mismas características y su mejor representación es el fenómeno de génesis denominado embriogénesis somática. Cada célula somática, es decir, que no tiene ninguna relación con las reproductoras, esta en la capacidad de convertirse en una plántula completa (Adelhied, 1992; Pérez, 1998). El presente documento pretende referenciar y combinar en lo más posible los diferentes eventos relacionados con la técnica del cultivo de tejidos vegetales, haciendo hincapié en el establecimiento de un protocolo de producción de forma teórica. Asimismo se tabula y reseña información muy valiosa sobre experiencias en el cultivo de esta especie y sobre el comportamiento de la familia. 2 Cultivo in vitro Anthurium andreanum JUSTIFICACION El conocimiento de las plantas y su funcionamiento, adquiere cada vez mayor importancia. En último término, la supervivencia del género humano depende, y probablemente dependerá siempre, de la abundancia de los vegetales. Las plantas constituyen el único medio de cual disponen los organismos vivos. Para estudiar las plantas se emplean métodos experimentales tan precisos como los usados en la física; a fin de comprender las interrelaciones que son la esencia de su vida, hay que enfocarse en un nivel y de una manera característica de las ciencias biológicas (Barceló et al., 1984). La diversidad en los hábitos de los vegetales hace difícil el empleo sistemas de clasificación basados en características morfológicas y anatómicas (Williams et al., 1980); además, existe evidencia con soporte farmacológico acerca de la potente actividad antiinflamatoria en algunas de estas plantas medicinales estimulando el desarrollo de nuevas investigaciones sobre sus extractos vegetales. Se ignora la naturaleza química de los núcleos activos de las sustancias químicas desconocidas las cuales son responsables de la actividad biológica que presentan los perfiles de los extractos de hoja u otros tejidos vegetales (Okoli, 2004). Un ejemplo son las lectinas. Su aplicación más importante tiene que ver con las investigaciones en cáncer. La actividad antiinsecticida de muchas lectinas vegetales ha sido documentada en ensayos in vitro y estudios con plantas transgénicas. Esto puede ser de gran potencial económico en el control de plagas debido a que las lectinas son producto del metabolismo primario, sus genes son buenos candidatos para conferir resistencia a los insectos en alimentos transgénicos (Manpreet et al., 2006). Además, el cultivo de tejidos se ha incrementado de una manera importante como una herramienta para la propagación masiva de vegetales, la recuperación de plantas libres de enfermedades específicas y la producción de híbridos somáticos (Barz et al., 1976). La aplicación de esta técnica está concentrada en los cultivos de Orquídeas, Anthurium andreanum y Anthurium scherzerianum, Lily, Pelargonium, varios tipos de Begonias, Freesia y algunos alimentos producidos de bulbos, tallos subterráneos o tubérculos (Reinert, 1977). El sector privado esta involucrado en un grado muy limitado en la propagación comercial de plantas importantes para el mercado ornamental (tradicional) pero esta mas comprometido en la propagación masiva de tejidos de plántulas de Anthurium (MRC, 2001). Es así como la innovación del sistema de propagación para esta especie puede ser 3 Cultivo in vitro Anthurium andreanum importante para una aplicación comercial (Vargas et al., 2004). La aplicación mas extensa y visible para el cultivo de tejidos vegetales hasta ahora ha sido la propagación clonal rápida. Los cultivadores ornamentales identifican esta práctica como micropropagación o simplemente cultivo de tejidos. El propósito de la propagación clonal es la obtención de plantas con cualidades uniformes y alta calidad. El cultivo de tejidos es más rápido que los procedimientos tradicionales generalmente conocidos. La selección de líneas celulares, la críopreservación, los bancos de germoplasma y la obtención de metabolitos secundarios para la farmacología mediante el cultivo de tejidos vegetales in vitro se ha convertido en uno de los soportes tecnológicos de la ingeniería genética y la biotecnología. En el campo de la investigación aplicada el cultivos in vitro debe convertirse en una alternativa a los métodos tradicionales de propagación y mejoramiento vegetal ya que presentan ventajas en lo que respecta a: ahorro de tiempo, ya que muchos procesos pueden ser acelerados en el laboratorio; economía de espacio y mano de obra, pues se trabaja en áreas pequeñas y relativamente con poco personal dando como resultado una disminución considerable de los costos que implica el trabajar directamente en el campo en condiciones naturales. Los cultivos in vitro que hace unos 20 años era muy complicado montarlos, hoy en día están a nuestro alcance y existe el personal calificado para trabajar en este campo; si a esto se le agrega la gran capacidad de los investigadores, solo resta esperar que las instituciones privadas y oficiales apoyen de manera efectiva a los grupos de trabajo para que se puedan implementar programas que permitan la utilización de nuestros recursos humanos y naturales en beneficio de nuestro país (Pacheco et al., 1987). 4 Cultivo in vitro Anthurium andreanum OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL • Establecer una metodología para la micropropagación in vitro de Anthurium andreanum documentando el estado del arte del cultivo in vitro. OBJETIVOS ESPECIFICOS • Definir una metodología del cultivo in vitro de Anthurium andreanum para su micropropagación a gran escala. • Considerar la importancia de los metabolitos secundarios producidos por Anthurium en condiciones de cultivo in vitro. • Proyectar una propuesta de negocio sobre la propagación in vitro masiva de Anthurium andreanum. 5 Cultivo in vitro Anthurium andreanum MARCO REFERENCIAL 6 Cultivo in vitro Anthurium andreanum CAPITULO I. DESCRIPCION 1. CLASIFICACION TAXONÓMICA Biota Dominio Eukaryota Reino Plantae Subreino Viridaeplantae Phylum Tracheophyta Subphylum Spermatophytina Infraphylum Angiospermae Clase Liliopsida Subclase Aridae Superorden Aranae Orden Arales Familia Araceae Subfamilia Photoideae Género Anthurium Especie Anthurium andreanum VARIEDADES: Linden ex André (Adelheid, 1992); Schott (Werbrouck, 1996); Tropical, Avoclaudia, Avonette, Avanti Casino, Lunette, Avoanneke, Limbo, Scorpion, Acrópolis, Fantasia, Cuba, Merengue, Uranus, Paradise, Champion (Murguia, 1996); Alii (Chen, 1997); New Pahoa Red, Marian Seefurth, Tatsata Pink, Kalapana, Oshiro Red, Lavender Lady, Mickey Mouse, Oshiro White, Tropic Mist, Rainbow, Blush Oishi, Kozohara, Blush Bride, Nitta, Ozaki, Red Obake, Bettina (Paull, 2000); Sarah (Landrum,2005); Plew Thien Phuket, Valantino, Sonat (Te Chato et al., 2006). 7 Cultivo in vitro Anthurium andreanum En la figura 1 se puede observar los diferentes niveles desde lo general hasta lo particular) de la clasificación taxonómica de las variedades de Anthurium andreanum. Eukaryota Plantae Angiospermas Monocotiledoneas Arales Araceae Aroideas, Pothoideae Anthurium Anthurium andreanum Acrópolis Alii Avanti Casino Avoanneke Avoclaudia Avonette Bettina Blush Bride Blush Oishi Champion Cuba Fantasia Kalapana Kozohara Lavender Lady Linden ex André Limbo Lunette Merengue Marian Seefurth Mickey Mouse New Pahoa Red Nitta Oshiro Red Oshiro White Ozaki Paradise Plew Thien Phuket Rainbow Red Obake Sarah Schott Scorpion Sonat Tatsata Pink Tropic Mist Tropical Uranus Valantino Figura 1. Representación en forma de pirámide de la clasificación taxonómica de Anthurium andreanum. Constituye una propuesta propia de este trabajo para posteriores representaciones. 8 Cultivo in vitro Anthurium andreanum 2. MORFOLÓGICA 2.1. Arales Arales es un orden de plantas angiospermas (Jiři and Herman, 2004; Hesse, 2006; Nie et al., 2006) y monocotiledóneas (Murguía, 1996; Adelheid et al., 1992), que esta comprendido por las familias Araceae y Lemnaceae. El orden incluye finas hierbas, matorrales trepadores (Nie et al., 2006; García, 1992), plantas de pantano como el género Symplocarpus (Nie et al., 2006) y formas acuáticas flotantes como la Spirodela polyrhiza (Appenroth, 2003) y las del género Pistia, muchas de las cuales habitan en el trópico. 2.2. Araceae La familia Araceae está constituida por un número cercano a los 115 géneros; Álvarez, (2006) reduce el número a 100, estimando alrededor de 2000 especies, nativas principalmente del trópico americano y el oeste de la India, mientras que Williams et al., (1980) reportaron 110 géneros y el mismo número de especies en la familia. Jiři and Herman, (2004); Hesse, (2006); Nie et al., (2006) la consideran una de las familias más grandes de las angiospermas y aumentan a 3300 el número de especies de hierbas y enredaderas dentro de 105 géneros propuestos. Según la descripción de García, (1992) la familia Araceae comprende un número de plantas trepadoras epífitas caulescentes con rizomas o tubérculos; hojas pecioladas, enteras, lobuladas o partidas; inflorescencias simples o espadiciformes envueltas en la base por lo menos por una espata. Esta familia es reconocida por varias especies silvestres y muchas especies de invernadero y follajes ornamentales. La diversidad de hábitos vegetativos de la familia Araceae hace difícil la clasificación de sus especies mediante sistemas de observación de los caracteres anatómicos y morfológicos (Williams et al., 1980). Según Hesse, (2006), existen posibilidades de clasificación morfológica mediante la observación de la distribución sistemática de los caracteres del polen. La inflorescencia esta constituida por un bastón central adaptado para la polinización empleando como vehículo los insectos. Esta formada por una espiga simple o espádice, uno por cada flor, sobre los cuales se encuentran dispuestas numerosas y diminutas flores. En algunas ocasiones, la estructura 9 Cultivo in vitro Anthurium andreanum completa del espádice se encuentra envuelta por una hoja floral o mejor llamada espata que se extiende por debajo del mismo. Las flores son hermafroditas o por el contrario unisexual, con frecuencia están reducidas a los órganos sexuales. En este último caso las flores femeninas suelen estar en la parte inferior del espádice y las masculinas por encima de ellas. Presentan un ovario usualmente entero con uno o varios lóculos, fruto en forma de baya con una o varias semillas (García, 1992). El fruto puede ser una baya de color brillante (muchas veces encerrada en el espádice), raramente esta seca y asemeja la textura del cuero. Esta se rompe para poner en libertad la semilla. Estas bayas son globulosas y de color amarillo o rojo; con 0.5 cm de longitud y contienen entre una y dos semillas de 0.03 cm y de color rojo (Murguía, 1996). A B C Figura 2. Inflorescencia Anthurium acutibacca (A) (Mora et al., 2003); Espádices típicos del género en el caso de Dracontium (B) (Roger y Barabe, 2001); inflorescencia de Anthurium obtusilobum (C) (Mora et al., 2003). 2.3. Aroideas Las Aroideas son una de las subfamilias mejor conocidas de las que presentan diferencias con respecto al polen de las angiospermas, donde se ha observado un desarrollo poco común de las formas y estructuras (Hesse, 2006). Las subfamilias (Gymnostachydoideae, Orontioideae, Pothoideae, Monsteroideae, Lasioideae, Calloideae así como la nueva subfamilia Zamioculcas y Gonatopus) comparten el síndrome estructural con desarrollo común característico para casi todos los pólenes de angiospermas (Jiři and Herman, 2004; Hesse, 2006). Los estudios morfológicos tradicionales han precisado un vínculo cerrado entre las Aroideas flotantes tales como la Pistia y los patos enlutados (Spirodela polyrhiza) (Rothwell et al., 2004). 10 Cultivo in vitro Anthurium andreanum 2.4. Anthurium El género mas grande de la familia Araceae es el Anthurium (600-1000); seguido de Philodendron (275 especies); Arisaema (150 especies), los cuales se creé son polinizados por caracoles; Homalomena (140 especies); Rhaphidophora (100 especies); Amorphophallus (100 especies) [algunas especies producen inflorescencias por encima de 1 m de altura]; Pothos (75 especies); Alocasia (70 especies). Los Anthurium son perennes y por esta razón permanecen vivas durante el invierno (Murguía, 1996; Álvarez, 2006; Buldewo, 2002), presentan una vida productiva de varios años (Murguía, 1996), son herbáceas epífitas (Murguía, 1996; Álvarez, 2006), monocotiledóneas (Murguía, 1996) y de hábitat trepador (Álvarez, 2006). Las especies descritas como plantas de follaje de Anthurium, Dieffenbachia, Philodendron y Syngonium (Buldewo, 2002), Xanthosoma, Spathiphyllum, Epipremnum, Aglaonema (Álvarez, 2006) son cultivadas popularmente en los interiores de las casas, oficinas y jardines alrededor del mundo por su inflorescencia llamativa, larga y duradera (Pataky, 2001; Buldewo, 2002). Los géneros han sido agrupados diferentemente dentro de un número de subfamilias o tribus. En los estudios realizados por Williams et al., (1980), las clasificaciones fueron ordenadas de acuerdo con las modificaciones del sistema clásico de Engler’s, en el cual son reconocidas 8 subfamilias y 31 tribus. Estas especies pueden ser terrestres, acuáticas o epífitas. Algunas de ellas son herbáceas o maderables, con pocas hojas, que en forma de flecha ascienden desde su origen en la raíz. Las trepadoras, se aferran con sus raíces aéreas al tronco de los árboles, mientras que otras tienen soportes verticales y despliegues muy largos en los cuales se encuentran hojas alternadas alrededor del tallo, secas en algunas ocasiones y que son sostenidas temporalmente; con vainas semicoloreadas ubicadas en la base del pecíolo. El género Anthurium es posiblemente uno de los mas complejos en la familia Araceae (Prakash, 2005; Te-Chato et al., 2006). A él pertenecen plantas tropicales americanas y comprende alrededor de unas 600 especies que, según Matsumoto, (1998) asciende a 1000. Prakash, (2005) confirma este último número. Asimismo, Stergios y Dorr, (2004) aumentan el número de especies a 1100; mientras que Álvarez, (2006) considera 1500 especies todas ellas de la familia Araceae; de las cuales mas de 600 tuvieron sus origenes en el trópico americano (Stergios y Dorr, 2004), siendo plantas de follaje muy populares. Es también uno de los géneros más importantes en la horticultura mundial (Vargas et al., 2004), considerados como flores especiales junto con las orquídeas, aves del paraíso y heliconias (Murguía, 1996). 11 Cultivo in vitro Anthurium andreanum 2.5. Anthurium andreanum Figura 3. Planta completa de Anthurium andreanum por Uchida et al., (2003). El sistema radical se encuentra bastante desarrollado y junto con la flor evidencian el estado adulto de la planta. Según la descripción morfológica de Murguía, (1996) la raíz es fibrosa y cilíndrica de consistencia carnosa, no se profundiza mucho en la tierra, es blanca y produce varias raíces adventicias. El tallo es monopódico, simple, herbáceo cuando la planta esta joven y semileñoso cuando es adulto, llegando a crecer hasta 1.5 m. Esta planta crece en promedio hasta 60 cm de altura (Álvarez, 2006). Las hojas son grandes y anuales, de 30 cm de longitud por 20 cm de ancho, de pecíolo largo y color verde brillante, ápice agudo y base en forma de cono: el borde es liso, con una disposición alternada en el tallo. De acuerdo con Paull, (2000) las floras tropicales tienen frecuentemente inflorescencias, flores insconspicuas y las brácteas; son pintorescas y de gran colorido haciendo la flor muy atractiva. García, (1992) se refiere a ellas como espadiciformes envueltas en la base por lo menos por una espata. Se describe el Flamingo Lily o Anthurium andreanum, como una especie que crece alrededor de 60 cm de altura, epifito en estado natural (Buldewo, 2002) y que florece todo el año (Murguía, 1996). Tiene un aro constituido por espata de color rojo salmón en forma de corazón de alrededor de 5-8 cm de longitud y un espádice de aproximadamente 9.5 cm de longitud. La espata se considera como una hoja modificada. Sus híbridos producen espatas coloreadas que van desde el blanco, verde, rosado, rojo salmón, rojos y vinotinto (Murguía, 1996; Paull, 2000). Numerosos cultivos presentan esta lujosa vestimenta coloreada de rojo, naranja (Álvarez, 2006), rosado, 12 Cultivo in vitro Anthurium andreanum coral y blanco, que corresponden o se clasifican en tres categorías: estándar (coloreada y en forma de corazón simple), el obaki (bicoloreadas de verde con algún otro color en su mayoría producido por antocianinas) el tipo tulipán (Prakash, 2005). Su textura va de lisa hasta rugosa (Buldewo, 2002). Se dice que los híbridos las producen de colores variables y su tamaño varía entre 5 y 8 cm de longitud. El espádice presenta coloraciones amarillas, blancas, verdes y rojizas, soportando 300 flores verdaderas en cada uno (Buldewo, 2002; Murguía, 1996; Álvarez, 2006). Las flores son unisexuales, con frecuencia están reducidas a los órganos reproductivos. Las flores femeninas verdaderas suelen estar en la parte inferior del espádice y las masculinas por encima de ellas; presentan un ovario usualmente entero con uno o varios lóculos, fruto en forma de baya con una o varias semillas (García, 1992). Tanto las flores machos y hembras florecen a destiempo; en la hembra ocurre primero, seguido después por los machos al día siguiente. Por lo tanto el polen madura el tercer día, es mas efímero y de vida muy corta (Hesse, 2006). Las hojas tienen forma de corazón con una vena o vascularidad central principal y muchas laterales que se encuentran adheridas a los pecíolos largos; subtallos mediante los cuales están adheridas las hojas al tallo (Álvarez, 2006). A B C Figura 4. Diferentes órganos de Anthurium andreanum: (A) hoja, (B) espádice y (C) flor completa respectivamente. Murguía, (1996) propone una forma de flecha que ascienden desde su origen en la frontera entre raíz y tallo principal. La planta produce de 3 a 8 hojas por año dependiendo de su nutrición, ambiente y variedad (Murguía, 1996). La secuencia de hoja, flor y nueva hoja, se mantiene a través de toda la vida de la planta, y el intervalo entre cada nacimiento de una nueva hoja se acorta o alarga dependiendo de los cambios en las condiciones ambientales (Murguía, 1996). La identificación de todos estos cultivos ha llegado ha ser el mayor punto de duda de sus similitudes en la morfología de la planta. Debido a esto, los 13 Cultivo in vitro Anthurium andreanum cultivadores han tenido que identificarlos principalmente basándose en el color de la espata, la cual rara vez esta disponible en los estados juveniles del desarrollo de la planta (Prakash, 2005). 3. Marcadores quimiotaxonómicos Las investigaciones fitoquímicas basadas en información etnofarmacológica son consideradas generalmente como un enfoque efectivo en el descubrimiento de agentes antiinfecciosos a partir de plantas superiores (Williams et al., 1980). La mayoría son producto del metabolismo secundario; el hecho de que la presencia de estos compuestos químicos sea común en determinadas especies, establece que pertenezcan a la misma filogenia. Meija and Soukup, (2004) consideran los ácidos como posibles marcadores quimiotaxonómicos al estudiar las relaciones filogenéticas mediante la determinación de los ácidos de lípidos presentes en las semillas de varios géneros de la subfamilia Aroidea, los cuales contenían como componente mayoritario (5-16%) acido 13-feniltridecanoico del total de los ácidos de la semilla. Además se considera que más de la mitad de los géneros en la subfamilia contienen ácidos ω-fenilalcanoicos y ω-fenilalquenoicos en los lípidos de sus semillas. Según Choo et al., (2005); el extracto acuoso crudo fue capaz de reducir el crecimiento in vitro de células linfoidales de Typhonium flagelliforme. La planta ha sido recomendada para el uso en terapias contra el cáncer. Asimismo, los tubérculos comestibles propios de los géneros representan una importancia económica; debida a la diversidad de usos dentro de las diferentes culturas de los trópicos y que hasta el momento no se ha estudiado profundamente la constitución química de sus principios activos (Williams et al., 1980). El interés no es solo medicinal; también puede servir con fines quimiotaxonómicos puesto que la presencia de los metabolitos secundarios puede permitir diferenciar o emparentar las diferentes especies de Araceae. Fue así como 8 especies del género Cryptocoryne (trompetas de agua), pertenecientes a la familia Araceae se investigaron fitoquímicamente (Franke et al., 2005). De esta manera, el estudio realizado por William et al., (1981) móstró que los flavonoides C-glucósidos son los constituyentes mas característicos de la familia Araceae. De acuerdo con los resultados, los flavonoides puede ser marcadores quimiotaxonómicos confiables (Franke et al., 2005). 14 Cultivo in vitro Anthurium andreanum HO OH OH OH O OH O HO HO OMe HO OH O OH O OH HO OH HOHO OMe OH O OH HO O OH 2’’-O-glucosilvitexina O O O OH O 6’-Sinapoyl-2’’-O-glucosilvitexina Figura 5. Flavonoides de la familia Araceae. Entre los fitocompuestos de Pinellia ternata (Thumb) Breit que han sido caracterizados se incluyen alcaloides, aceites volátiles y polisacáridos; que muestran una actividad pronunciada en bioensayos preliminares. Tambien se logró el aislamiento de un nuevo cerebrósido antimicrobiano denominado pinellosido 1 (Chen et al., 2003). O HN OH O HO HO O OH OH Figura 6. Estructura del pinellosido 1 [1-O-β-D-glucopiranosil- (2S,3R,4E,11E) - 2 - (20R - hydroxyhexadecenoilamino) - 4,11-octadecadiene-1,3-diol] (Chen et al., 2003). CH3 H3C CH3 CH3 CH3 CH3 HO Figura 7. Sitosterol (Sustancia CCS-1) presente en las hojas de Culcasia scandens P. Beauv (Okoli, 2004). Se realizaron estudios mediante TLC de rizomas de Homalomena occulta (Lour.) Schott. Se encontró una saponina que no se había reportado en otros géneros de Aráceas y que por esta razón debería considerársele como un marcador quimiotaxonómico (Elbandy et al., 2004). 15 Cultivo in vitro Anthurium andreanum OH HO HOOC O HO OH O O HO OH CO O HOOC CH2OH O O HO O OH Figura 8. Saponina triterpénica Henderagenina aislada de Homalomena occulta (Lour.) Schott. Un ejemplo de la variedad de funciones celulares dentro de la familia son los idioblastos cristalinos; células especializadas que acumulan grandes cantidades de calcio en la forma de oxalato de calcio cristalino en especies como Pistia stratiotes (Nakata, 2003). Las especies del género Dieffenbachya son reconocidas por su causticidad (atacan los tejidos orgánicos) y se caracterizan químicamente por la presencia de células numerosas e inusuales (los idioblastos) en las hojas, pecíolos y tallos (Castro et al., 2004). La fracción polar de Typhonium flagelliforme presenta actividad citotóxica baja, el extracto acuoso crudo fue capaz de reducir in vitro el crecimiento de células linfoidales. Aunque el efecto sobre el crecimiento celular fue bajo, la planta ha sido recomendada para el uso en terapias contra el cáncer. Entre los compuestos identificados se encuentra el 13-feniltridecanoato de metilo (Choo et al., 2001). COOCH3 Figura 9. 13-Feniltridecanoato de metilo aislado de T. flagelliforme Así mismo, los frutos de malva de los miembros de la familia Araceae pueden tener antocianinas tales como cianidina y perlagonidina-3-rutinosido que se presentan en la espata de especies como el Anthurium andreanum, posiblemente empleada por la planta como coloración atractiva con el fin de lograr la dispersión de sus semillas (Williams et al., 1980). El mecanismo de acción de estos pigmentos es evidente en la espata y espádice de los miembros de la familia; induciendo la visita de polinizadores, principalmente moscas (Williams et al., 1980; Murguía, 1996) y escarabajos (Williams et al., 1980); esencialmente por los olores nauseabundos producidos por la inflorescencia que los atrapa por unos instantes hasta que logran escapar y 16 Cultivo in vitro Anthurium andreanum contribuyen a la polinización de otras plantas (Williams et al., 1980; Murguía, 1996). El pigmento presenta una coloración roja hasta el púrpura oscuro también en el pecíolo de las hojas de muchas especies y eventualmente, en la epidermis de la hoja. La selección natural logró entrar al canal de comunicación visual y emitir mensajes debido a las antocianinas de tipo cianidina presentes en la espata (Williams et al., 1980). Los estudios realizados por Alencar et al., (2005); Bainz et al., (2005) y Manpreet et al., (2006), describen otro tipo de marcador quimiotaxonómico denominado lectinas, las cuales son capaces de inducir la proliferación in vitro de linfocitos con la producción de interferón y oxido nítrico in vivo e in vitro e inducción de la apoptosis. Las lectinas están ampliamente distribuidas en la naturaleza (los 3 reinos) sirviendo como mediador en una variedad de eventos con importancia biológica reconocida. De hecho deben ser una pieza clave como referencia para la clasificación debido a que su relación filogenética con los demás organismos vivos debe ser muy antigua. Su empleo más importante se debe al potencial anticancerígeno que posee (ver anexo 1). 4. Distribución geográfica Las especies de esta familia presentan gran variedad de hábitos vegetativos, en especial las de latitudes altas, las cuales son hierbas no maderables con tubérculos o rizomas bajo tierra, mientras que en el trópico y subtrópicos la familia esta representada en algunas ocasiones por especies trepadoras y epífitas, mientras que las especies epifitas, litofitas y acuáticas también pueden estar presentes (Williams et al., 1980; Buldewo, 2002; Reid, 2004; Vargas et al., 2004; Castro et al., 2004; Alvarez, 2006). El eje de diversidad o hábitat nativo incluye áreas muy elevadas de América central, Colombia, Venezuela, Ecuador en especial en la zona Norte de los Andes (Álvarez, 2006; Stergios y Dorr, 2004) y Perú. Las temperaturas bajas hacen que estas especies estén ampliamente distribuidas, especialmente en los hábitat húmedos (Álvarez, 2006). Muy pocas taxas se encuentran en zonas templadas. Symplocarpus, Lysichiton y Orontium son 3 de los géneros de Araceae que se ubican en la zona templada Norte (Nie et al., 2006). Asimismo, Arisarum vulgare (Araceae) es una planta tóxica que se extiende a lo largo de la costa del mediterráneo (Lamkadem et a., 2003). En Venezuela han sido registradas alrededor de 70 especies, es fácil encontrarlas en las cuestas húmedas de los Andes a diferentes elevaciones. Las representaciones del género se incrementan en la montaña y en la zona forestal nublada con respecto a la 17 Cultivo in vitro Anthurium andreanum abundancia y riqueza en especies (Stergios y Dorr, 2004). Inicialmente, Pataky, (2001); Álvarez, (2006), los ubican como nativos del Trópico Ecuatorial Suramericano; considera que fueron transportados por el hombre hasta climas fríos como el de Londres y luego reconquistaron el trópico, esta vez llegando a Hawaii (Murguía, 1996; Álvarez, 2006) y las islas Mauricio que se perfila como el tercer productor de Anthurium del planeta. Así mismo Murguía, (1996) describió algunas variedades Holandesas de Anthurium, demostrando la capacidad de adaptación y variabilidad de estas especies en climas fríos. En el parque Nacional Guaramacal ubicado en los Andes Venezolanos, El Anthurium es el género más abundante con 5 especies colectadas hasta la fecha. La presencia de Anthurium angustatum colectada por Humboldt y Bonpland en la parte superior de la región del Orinoco en la Amazonia Venezolana, no pudo ser confirmada (Stergios y Dorr, 2004). En estado natural, el Anthurium andreanum puede ser encontrado en zonas selváticas de montaña en alturas por encima de los 1000 m según Stergios y Dorr, (2004); alrededor de 2400 m de acuerdo con Buldewo, (2002). Esta es la especie mejor conocida de la familia. Según Álvarez, (2006) fue descubierto por Eduard André en 1870 durante su viaje entre Colombia y Ecuador. Las variedades de Anthurium andreanum nativos de Colombia empleados comercialmente como flores de corte (Murguía, 1996; Pataky, 2001), fueron introducidos en Hawaii procedentes de Londres en 1889. De acuerdo con Murguía, (1996) en las islas se empezaron a cultivar y después de muchas hibridaciones a partir de tonalidades rosa, se obtuvo una amplia gama de colores. Álvarez, (2006) propone que la introducción en Hawaii fue hecha por S.M. Damon, quien en su descripción dijo que tenía una espata con un casquillo color rosado. Las plantas fueron cultivadas en los estados de Damon, Moanalua y desde entonces han sido distribuidas paulatinamente entre los cultivadores mediante propagación vegetativa desde finales de 1930 y comienzos de 1940. Los cultivadores en Hawaii aprendieron como propagar los Anthurium a partir de semillas, generando un incremento en el cultivo y en la variación genética. 18 Cultivo in vitro Anthurium andreanum CAPITULO II. CULTIVO in vitro Anthurium andreanum 5. Reseña histórica Según Pacheco et al., (1987) la técnica de cultivo in vitro de tejidos vegetales se inicio hacia 1939 con los trabajos de Phillip White, Roger Gautheret y Pierre Novecourt quienes lograron mantener viables, por tiempo indefinido algunas estructuras vegetales. Los primeros trabajos se enfocaron a la estandarización de técnicas de aislamiento de tejidos, al estudio de sus procesos fisiológicos y bioquímicos y a la determinación de medios de cultivo artificiales para mantener la viabilidad celular. La propagación mediante cultivo de tejidos en la horticultura comenzó con Morel y Martin’s en 1952, demostrando la eliminación del virus de Dalia empleando el cultivo de brotes de ápice. Según Puchooa, (2003) el método para la producción in vitro de plántulas de Anthurium andreanum fue desarrollado en principio por Pierik et al., (1974). 6. Generalidades Las referencias citas son de alguna técnica de cultivo in vitro en las que consideran el empleo de diferentes órganos provenientes de plantas adultas tal como se muestra en la tabla 1. Tabla 1. Cultivo tradicional de Anthurium. 1 2 3 4 5 Tipo de órgano utilizado Germinación de semilla Segmentos de tallo División de brotes secundarios que aparecen en la base del tallo Segmentos nodulares Esquejes, estolones yemas y vástagos Referencia Vargas et al., (2004) Te-Chato et al., (2006) Te-Chato et al., (2006) Adelheid et al., (1992) Adelheid et al., (1992) Pierik, (1990) La industria de los Anthurium mantiene una amenaza latente del suministro continuo que los enfrenta a retos en búsqueda de alta tecnología por medio 19 Cultivo in vitro Anthurium andreanum de estudios sobre reproducción de plantas y cultivos (Puchooa, 2003). Los resultados de las investigaciones los encamina hacia métodos de propagación masiva y subsecuentemente estudios de mercado inteligente. El establecimiento e implementación de procedimientos de micropropagación (Te-Chato et al., 2006) y de nuevas técnicas son necesarias para mejorar las variedades cosechadas (Puchooa, 2003) apartándose de la reproducción vegetal tradicional mediante el uso del cultivo in vitro (Te-Chato et al., 2006). En las figuras 10 y 11 se presentan gráficamente las tres (3) rutas de regeneración de plántulas con respecto a la organización celular y denominadas: organizado, desorganizado y mezcla de ambos (organizado/desorganizado). El cultivo in vitro desorganizado se caracteriza por el fenómeno de desdiferenciación celular que resulta en la formación del callo como representación del desarrollo celular desorganizado. CULTIVO in vitro ORGANIZADO DESORGANIZADO Explante Explante Protocormo Desdiferenciación Celular Hojas Callos Hojas, rizoides Raíces Planta idéntica a la descendencia (Planta élite) Agregados celulares Células Estabilidad genética muy baja Figura 10. Diagrama de los procesos in vitro organizados y desorganizados. Adaptado de Pierik, (1990). Adelantos biotecnológicos tales como la ingeniería genética y las mutaciones inducidas por irradiación puede llegar a ser parte clave de la investigación, esperando obtener nuevas características en la producción de Anthurium (MRC, 2001); la “reproducción de mutantes”, es por lo tanto prometedora como medio para la creación de variaciones adicionales. Lo que ocurre es que los agentes mutagénicos comúnmente usados, en realidad solamente 20 Cultivo in vitro Anthurium andreanum pueden alterar los genes presentes en el genotipo tratado o sea que modifican los mecanismos de expresión existentes. Esta puede ser una de las grandes ayudas en micropropagación y en un futuro trabajo in vitro de búsqueda para desarrollar variedades resistentes (Puchooa, 2003). Muchos cultivos de Anthurium son propagados asexualmente por medio de clones derivados de híbridos (Matsumoto, 1998). Se emplean mutágenos físicos como radiación ionizante (rayos X, rayos gamma y neutrones) y luz UV, y también una serie de agentes químicos son ejemplos comunes de técnicas de mutagénesis que tienen una alta eficiencia generando mutación en plantas, animales así como en bacterias. Adicionalmente, las consecuencias de estos tratamientos pueden ser predichas con mínima extensión (Puchooa, 2003). Los agentes mutagénicos han sido usados para inducir variaciones genotípicas útiles en las plantas durante 70 años (Pierik, 1990). A partir del nuevo material obtenido, en términos de variedad de cultivos, serán introducidos en la industria, a partir de experimentos para determinar los protocolos mas apropiados de propagación in vitro (MRC, 2001). La mezcla entre cultivo organizado y no organizado, que también puede denominarse mixto, se consigue desde explantes de tejido diferenciados tales como tejidos, órganos e incluso células, los cuales sufren una desdiferenciación celular (característica del cultivo no organizado). Luego de un periodo de acondicionamiento a las condiciones in vitro, se reinicia la expresión genética en cuanto a la formación de órganos como por ejemplo raíces adventicias sobre la superficie de un callo representado en la figura 11. Los procesos que implican una desdiferenciacion celular son mucho más dispendiosos debido a la variación en las condiciones de cultivo (medio de cultivo, regulación, factores físicos, etc.) y el incremento en los pasos intermedios de la propagación. El proceso organizado representado en la figura 10 es óptimo para trabajar con material de vidrio ordinario y en condiciones de propagación con fines comerciales. Los procesos desorganizado y mixto (figura 10 y 11) donde la estabilidad genética es muy baja y la descendencia no es completamente idéntica a las plantas élite, deben manejar protocolos muy bien establecidos y con materiales de alta calidad como el vidrio Pirex para evitar la influencia de factores externos sobre estados vulnerables como la desdiferenciación celular. 21 Cultivo in vitro Anthurium andreanum Raíz Hoja Tallo Semilla Callo Callo embriogénico Callo organogénico Embrión Planta completa Figura 11. Esquema de un proceso in vitro organizado/desorganizado. Adaptado de Pierik, (1990). 22 Cultivo in vitro Anthurium andreanum La entropía del sistema debe ser controlada mediante la operación de factores externos de una manera muy cuidadosa. Esto es necesario debido a la expresión genética de los tejidos, para reconocer los factores fisicoquímicos que sobre ella actúan y así reproducir los resultados. 7. Material vegetal Las plantas aceptadas para la propagación deben ser examinadas en cuanto a infecciones con hongos, bacterias y virus. La carencia de síntomas en algunas plantas no es necesariamente un indicativo de bajos niveles de infección por microorganismos pero puede indicar cierta resistencia a un patógeno infectivo (Reinert, 1977). Además, entre el material vegetal empleado para originar cultivos de tejidos vegetales de Anthurium andreanum se encuentran las plantas élite cultivadas in vitro (Adelhied, 1992; Chen, 1997). En todos los trabajos se ha encontrado que hay una gran variación en los requerimientos de los diferentes genotipos. Los métodos para muchas otras variedades estan siendo trabajadas por establecimientos comerciales pero no están disponibles para uso general (Puchooa, 2003). Ejemplos de esto se pueden referenciar con el trabajo de Geier, (1986) quien concluyó que la edad de la planta élite y el fenotipo influye en la regeneración de la planta de Anthurium andreanum (Vargas et al., 2004). Existe un vástago o retoño tierno y escamoso como el de los espárragos que constituye un órgano especializado denominado turión similar a los zarcillos de la uva (Vitis vinifera) con las cuales la planta se soporta o sostiene a otras estructuras. Puede estar constituido por una serie de hojas modificadas, segmentos de hoja, hojas pequeñas, ápices de hoja o estípulas de hoja; todas provenientes de ramificaciones del tallo. Adelheid et al., (1992) empleo cuatro (4) variedades diferentes obtenidas previamente mediante el cultivo de yemas axilares in situ. El precultivo fue necesario, puesto que sin este paso se observa la formación del turión inducida por el estrés a menudo teniendo resultados irregulares. Dos de las tres colonias de precultivo fueron empleadas como material de inicio para los experimentos (Appenroth, 2003). El incremento frecuente en la edad del cultivo sugiere fuertemente el uso de cultivos jóvenes para propósitos de propagación para obtener florecimientos uniformes y plantas completas (Reinert, 1977). 23 Cultivo in vitro Anthurium andreanum 8. Explantes El explante usado generalmente se relaciona de alguna manera con yemas o brotes axilares o terminales (Reinert, 1977). El inoculo podrá consistir de un domo apical además de algún primordio de hoja, o pequeños segmentos de hoja (Reinert, 1977). La micropropagación de Anthurium ha sido llevada a cabo con varios tejidos incluyendo los explantes que se resumen en la tabla 2. Tabla 2. Origen de los explantes y respuesta obtenida en el cultivo in vitro TIPOS DE EXPLANTE Raíz Embriones somáticos primarios Cortes de raíz trasformada con A. tumefaciens transmitiendo el vector binario pCa2Att Semillas maduras completas Semillas germinadas Embriones zigóticos Brotes adventicios Callos RESULTADO Regeneración de plantas completas Embriones somáticos secundarios Plantas completas resistentes a kanamicina Embriones zigóticos Callos Protoplastos Callos Embriones Regeneración directa Callos organogénicos Hojas Callos embriogénicos Callos y brotes REFERENCIA Chen, (1997) Adelhied, (1992) Chen, (1997) Matsumoto, (1998) Vargas et al., (2004) Adelhied, (1997) Te-Chato et al., (2006) Adelheid et al., (1992) Te-Chato et al., (2006) Adelheid et al., (1992) Pierik, (1990) Adelhied et al., (1992) Geier, (1986) La regeneración directa e indirecta depende de la obtención de plántulas desde un órgano sin pasar por el estadio de callo, o por el contrario desdiferenciandose en este tejido de carácter cicatrizal. En la figura 11 están expuestas las diferentes rutas posibles de regeneración indirecta, mientras que la tabla 3 recopila los diferentes tipos de explantes desde los cuales se ha logrado la obtención de plántulas completas. Este tipo de proceso es común con los resultados de diferentes estudios in vitro realizados por un gran número de investigadores alrededor del mundo. Los explantes de hoja son el punto de convergencia de muchos de los investigadores, es decir, con ellos se ha corroborado en mayor número la producción de plántulas completas. 24 Cultivo in vitro Anthurium andreanum Tabla 3. Tipos de Regeneración directa e indirecta desde diferentes tipos de explantes. Explante Brotes axilares Brotes adventicios Hojas Cultivo de callos embriogénicos desde peciolos Embriones somáticos derivados de cortes de explante de hojas cultivadas in vitro Plántulas cultivadas in vitro Yemas Nudos e internudos Tallos Semillas Espádice Espata Raíz Referencia Te-Chato et al., (2006) Adelheid et al., (1992) Vargas et al., (2004); Aldelheid, (1992) Musa, (1997); Geier, (1986); Aldelheid, (1992) Te-Chato et al., (2006); Chen, (1997) Puchooa, (2003); Adelheid et al., (1991) Adelheid et al., (1992); Geier, (1986) Musa, (1997) Chen, (1997); Aldelheid, (1992) Te-Chato et al., (2006); Adelheid et al., (1992) Te-Chato et al., (2006) Te-Chato et al., (2006) Chen, (1997) Adelheid et al., (1992) Chen, (1997) Chen, (1997) 9. Regeneración directa Este tipo de regeneración es muy similar a la propagación vegetativa in vivo, se producen plantas completas o casi completas (embriones, semillas) y su descendencia es idéntica al material vegetal inicial (Pierik, 1990). Aunque es posible un incremento en el rango de plantas con regeneración regular y repetida, es deficiente un entendimiento completo del balance nutricional y hormonal (Reinert, 1977). En la figura 12 se observa de forma general las rutas o secuencia de los procesos para lograr la regeneración directa. Queda claro que se puede incluir la formación del sistema radical y posteriormente la formación de tallos y hojas o viceversa. Excluye cualquier tipo de desdiferenciación celular, es decir, no se observa en ningún momento del proceso la formación de callo. Además, la regeneración es más rápida de esta forma, sobre todo cuando el material es altamente totipotente 25 Cultivo in vitro Anthurium andreanum Explante Organogénesis Caulogénesis Rizogénesis Planta Completa Figura 12. Diagrama de Regeneración directa (organogénesis) (Reinert, 1977 y Pierik, 1990). Fue así como Te Chato et al., (2006) para establecer un sistema de regeneración para Anthurium andreanum cv. Rubrun, germinaron las semillas sobre un medio suplementado con 0.8 mg/L de benciladenina (BA). Después de 2 semanas el 74% de las semillas germinaron y 4 semanas después microcortes de estas fueron subcultivados, sobre un medio que contenía 1.6 mg/L de BA y 0.01 mg/L de ácido naftalenacético (ANA). 9.1. Cultivo de esquejes Aunque las técnicas de propagación vegetativa tales como los cortes de tallos y brotes secundarios, los cuales son tediosos y poco prácticos cuando se llevan a cabo a gran escala, se muestra promisorio el empleo de esta técnica in vitro. Los métodos de propagación vegetativa aplicados a estas plantas no muestran buenos resultados y las técnicas de cultivo de tejidos aparecen como una alternativa para incrementar la producción (Vargas et al., 2004). 9.2. Cultivo de embriones zigóticos Por medio del estudio realizado por Matsumoto, (1998) se logró la obtención de conocimientos nuevos y detallados de la embriogénesis in vivo; ambos son fundamentales y de aplicación valiosa, especialmente durante el estudio del género Anthurium en más de 100 años. De esta manera las semillas maduras completas originan embriones zigóticos bajo condiciones in vitro. 26 Cultivo in vitro Anthurium andreanum Su investigación tomó un camino que condujo a la ilustración de los estadios del desarrollo de Anthurium Scandens ssp con el empleo de un exámen de carencia de citoquininas con el fin de documentar los eventos claves en la maduración del embrión y el endospermo. Fue así como se documentó la mayoría de los eventos anatómicos en el desarrollo del embrión y el endospermo con el seguimiento de la polinización controlada en flores de Anthurium andreanum, usando un examen histoquímico para registrar los cambios fisiológicos durante la génesis, sobre todo para correlacionar la maduración del embrión con la habilidad para producir plantas desde los óvulos o por el cultivo de embriones (Matsumoto, 1998) 10. Regeneración indirecta La regeneración indirecta tiene como características el crecimiento y desarrollo desorganizado y la posterior formación del callo. La estabilidad genética del cultivo es muy baja debido a que se emplean concentraciones muy altas de auxina y citoquininas para la obtención de la regeneracion indirecta (Pierik, 1990). La regeneración de plántulas de Anthurium andreanum se realiza mediante la formación de callos a partir de brotes adventicios y regeneración directa desde explantes de hoja (Vargas et al., 2004). Las plántulas fueron obtenidas con facilidad desde callos pero la regeneración desde embriones somáticos no pudo ser demostrada (Pierik, 1990). La figura 13 representa 3 rutas a partir de la desdiferenciacion para obtener plántulas mediante regeneración indirecta (recuadros oscuros). Dos de los procesos relacionan embriones somáticos desde fuentes diferentes: células y callos embriogénicos. La última ruta recurre con los procesos de organogénesis núcleo de la figura 12. Este tipo de proceso de regeneración se emplea para la obtención de protoplastos, los cuales son muy importantes en los estudios de transformación genética; transgénesis y mutación genética. Esto implica que la estabilidad genética sea muy baja y se puedan obtener resultados inesperados como nuevas variedades debido a cambios en la expresión genética, de tal manera que los genes que se expresan no son los mismos que en las plantas cultivadas in situ o por regeneración directa. 27 Cultivo in vitro Anthurium andreanum Explante Desdiferenciacion celular Callos embriogénicos Callos Callos friables Callos organogénicos Embriones somáticos Protocormos, brotes y yemas adventicias, hojas, raíces, esquejes de tallo (En Anthurium) Agregados celulares Células individuales Embriones somáticos Planta completa Protoplastos Protoplastos Figura 13. Diagrama de regeneración indirecta (Te-Chato et al., 2006; Chen, 1997; Adelheid et al., 1992). En las variedades de Anthurium; Iris, Secale y Zingiber, las hojas, fueron usadas como material inicial, y las plantas fueron regeneradas indirectamente por medio de callos embriogénicos (Lin et al., 1997). Adelheid et al., (1992) afirmaron que la obtención de plántulas desde embriones formados en el cultivo de explantes provenientes del espádice (tabla 3) y partiendo de la transformación de callos mediante la inserción del plásmido de Agrobacterium tumefaciens y el de Agrobacterium rhizogenes son dos sistemas de transferencia genética que muestran ser promisorios en el cultivo in vitro para la obtención de plántulas Anthurium andreanum. 10.1. Cultivo de callos Te-Chato et al., (2006) utilizó explantes constituidos por: nudos, tallos, hojas y además de brotes de 2 semanas de edad para la inducción de callos. Después de 8 semanas de cultivo en la oscuridad se formaron callos en cada explante de los tres (3) genotipos de Anthurium spp utilizados (Te-Chato et al., 2006). También se observa formación de callos en los explantes cultivados e irradiados por Puchooa, (2003). 28 Cultivo in vitro Anthurium andreanum Kuehnle, (1991) estableció un sistema de regeneración de hojas y pecíolos de variedades Hawaiianas de Anthurium andreanum mediante cultivo de callos (Vargas et al., 2004). Figura 14. Inducción de callos sobre explantes de hojas luego de los tratamientos de irradiación con rayos gamma alrededor de toda la superficie de corte (Puchooa, 2003). La proliferación de callos friable y la regeneración subsiguiente de plántulas en estudios sobre transformación genética y desarrollo de plantas transgénicas abren nuevas perspectivas en este cultivo. La innovación del sistema de propagación para esta especie puede ser importante para una aplicación comercial. Vargas et al., (2004) describieron los resultados preliminares para el establecimiento de un método alternativo para la regeneración de plantas de Anthurium andreanum cv. Rubrun a partir del cultivo de callos organogénicos. Te-Chato et al., (2006) realizaron cortes a manera de laceraciones en los explantes de tallo de tres variedades de Anthurium spp. Los explantes con cortes (heridas) y sin ellos fueron cultivados sobre medio Murashige & Skook (MS) a la mitad de la concentración (½MS) suplementado con 3% de sacarosa, 0.5 mg/L Thidiazuron (TDZ) y 0.5 mg/L de Benciladenina (BA). La formación de callos sobre los explantes con y sin laceraciones fue registrada y analizada estadísticamente. Entre todas las variedades estudiadas, Valantino tuvo la mas alta inducción de callos (83.73%) con diferencias significativas frente la variedad Sonat (78.67%) y la Plew Thien Phuket (45.60%); aunque el porcentaje es bajo tal vez pueda considerarse como una opcion. Las diferencias se pueden deber al metabolismo de la planta el cual afecta la división celular y diferenciación. También se ha reportado que el genotipo afecta la formación de callos en Anthurium (NMC, 2003). El tipo de callo obtenido de cada variedad también fue diferente en el estudio. Los callos de la variedad Sonat fueron de color amarillo claro mostrando estructuras embriogénicas mientras que las otras dos variedades produjeron callos meristemáticos nodulares (Te-Chato et al., 2006). 29 Cultivo in vitro Anthurium andreanum Laceraciones sobre las hojas promueven la formación de callos en un 58.86%, mientras que en las no laceradas fue del 44.03%. Sin embargo, no se obtuvieron diferencias significativas (Te-Chato et al., 2006). En la figura 15 se muestran 3 detalles de los callos inducidos con TDZ y BA. Las figuras 15, 16 y 17 representan ejemplos de los resultados obtenidos mediante la aplicación del proceso de regeneración indirecta donde es fundamental la formación de callos. Existen evidencias y antecedentes claros de los fenómenos de diferenciación y desdiferenciación celular. Incluso se presentan características organogénicas en algunos de ellos. Tabla 4. Efecto del tipo de explante y genotipo de Anthurium andreanum sobre la formación de callos en medio MS a la mitad de concentración de macronutrientes (½MS) suplementado con 0.5 mg/L de TDZ y 0.5 mg/L de BA después de 8 semanas de cultivo (Te-Chato et al., 2006) EXPLANTE Y EFECTOS DEL GENOTIPO SOBRE LA FORMACIÓN DE CALLOS CON TDZ Y BA Variedades Formación de Callos Promedio Color del Callo Hoja Internudo Nudo (Variedad) Plew T. P. 45.3 50.3 41.2 45.6 Amarillo Sonat 77.6 83.6 74.8 78.7 Amarillo Claro Valantino 82.8 84.0 84.4 83.7 Amarillo Oscuro Promedio 68.6 72.6 66.8 (explantes) La figura 15.A muestra la formación de callo en los nudos de las hojas. La sección B muestra un callo con cierto grado de diferenciación celular debido a la coloración verde que evidencia los procesos de fotosíntesis incluso se proyectan brotes desde la superficie de los mismos, mientras que los callos amarillos de la sección C muestran un estado desdiferenciado reciente sobre la vascularidad principal de la hoja. Figura 15. Callos formados en los explantes de hoja de cada uno de los fenotipos de Anthurium spp luego de 8 semanas de cultivo en medio ½MS suplementado con TDZ y BA. 30 Cultivo in vitro Anthurium andreanum La figura 16 permite observar la apariencia de los callos luego de un periodo de cultivo in vitro mas extenso. Se observan claramente las características embriogénicas (ver figura 11). Además su tiempo in vitro es muy extenso debido al alto grado de diferenciación que se presenta en la superficie de los callos (coloraciones, organogénesis). Como se observa en la apariencia de los callos formados sobre explantes de hoja en la figura 17 (Te-Chato et al., 2006). Figura 16. Callos formados desde el nodo de la variedad Sonat empleando el medio ½MS y WPM con TDZ y BA después de 6 semanas de cultivo (Te-Chato et al., 2006). La figura 17 muestra las características de la formación de callos en los diferentes cortes realizados. Es evidente que los cortes de la sección nodal producen mas callo que los cortes realizados en la vascularidad central. Además, se puede afirmar que los callos muestran actividad fotosintética y clorofílica (coloracion verde) (Te-Chato et al., 2006). Figura 17. Posición de los callos formados sobre un explante de hoja sano (A) y otro en el que se realizaron heridas (B) en la variedad de Anthurium Valantino luego de 6-7 semanas de cultivo (Te-Chato et al., 2006). 31 Cultivo in vitro Anthurium andreanum En cuanto a la influencia de la textura de los medios de cultivo sobre la organogénesis, Pierik, (1990) determinó que si los callos de Anthurium andreanum se cultivan en medio líquido, solo se forman raíces adventicias en contraste con su cultivo en medio sólido donde se observan fenómenos de organogénesis (ver figura 16). 10.2. Cultivo de yemas Según Pacheco et al., (1987), lograda la multiplicación celular surgen dos alternativas 1. Conservación de líneas celulares por tiempo indefinido y/o 2. Inducción de procesos morfogenéticos para regenerar plantas completas. Te-Chato et al., (2006) establecieron la micropropagación utilizando yemas adventicias. Las fases del cultivo de yemas son relativamente lentas o su promedio de multiplicación no es confiable presentando eventualmente variaciones somaclonales como el cultivo de callos En promedio se obtuvieron 3.6 yemas por explante. Las plántulas de 4 semanas de edad provenientes de semillas germinadas y las plántulas obtenidas de los microcortes fueron subcultivadas sobre un medio suplementado con 3.2 mg/L de BA y 0.5 mg/L de ácido naftalenacético (ANA). Después de 6 semanas de cultivo, se obtuvieron alrededor de 43.8 plántulas por cm2 de callo. Los estudios anatómicos mostraron la naturaleza embriogénica de estos callos (Vargas et al., 2004; Linz, 2005). En el anexo 7 se presenta la composición de un medio basal para la inducción de yemas a partir de explantes de raíz (Chen et al., 1997). 10.3. Cultivo de embriones somáticos La embriogénesis somática (ES) es un fenómeno de regeneración de plántulas completas desde la expresión de la información genética. Es el mejor ejemplo de la totipotencia celular debido a que el individuo no es el resultado de la fusión de dos gametos masculino y femenino presentes en células cuya función esta restringida a la reproducción sexual; en cambio, la regeneración aparece como resultado de una desdiferenciacion celular. 32 Cultivo in vitro Anthurium andreanum Actualmente, alrededor de mil especies de plantas han sido regeneradas in vitro vía embriogénesis somática. La embriogénesis somática está entre los procedimientos más notables en la micropropagación vegetal (Te-Chato et al., 2006). Este procedimiento es afectado notablemente por factores físicos, fisiológicos y genéticos. La embriogénesis somática es un método alternativo de micropropagación el cual demuestra una tasa alta de multiplicación. Tiene distintas ventajas sobre la organogénesis. (Te-Chato et al., 2006) Adelhied, (1992) cultivó explantes de hoja de Anthurium andreanum durante un mes en la oscuridad obteniendo embriones somáticos y luego, subcultivados y puestos a la luz hasta su conversión en plántulas. Explantes de raíz bajo una semana de luz regeneraron plántulas completas del híbrido ínterespecífico UH 1060 (Chen, 1997). Explantes derivados de hojas completas produjeron callos embriogénicos traslucidos y embriones somáticos secundarios los cuales se formaron frecuentemente sin la intervención de callos, sobre los embriones somáticos primarios (Aldelheid, 1992). Según Musa, (1997), estos explantes de hojas, pueden llegar a convertirse en plántulas completas. El principio biológico sobre el cual se basa esta técnica es la totipotencia celular propuesto por Haberlandt a comienzos del siglo pasado, según el cual “toda célula contiene la información genética necesaria para regenerar individuos semejantes a aquel del cual proviene y el éxito en su desarrollo comienza al poder inducir la multiplicación celular en condiciones artificiales” (Pacheco et al., 1987). Su representación es la embriogénesis somática, la cual ha sido reportada en la familia Araceae. A partir de segmentos de hojas se han obtenido embriones somáticos en: 1. Anthurium scherzerianum (Geier, 1986). 2. Anthurium andreanum (Musa, 1997). Cuando se logra la embriogénesis somática, el hecho de que se produzca gran cantidad de plántulas lo convierte en un excelente medio de propagación vegetativa. Por este procedimiento se eluden las barreras de “incompatibilidad sexual” y se pueden obtener híbridos ínterespecíficos, íntergenéricos e interfamiliares, creándose así nuevas fuentes de variabilidad genética (Pacheco et al., 1987). La regeneración desde segmentos de hoja de Anthurium scherzerianum se encontró que era altamente dependiente del genotipo y de la edad de la hoja (Geier, 1986). En esta familia, la micropropagación es difícil y continuamente se encuentran problemas. Los obstáculos prezigóticos posiblemente no se superen; además, los caracteres postzigóticos aparecen a nivel de la formación del embrión. Por esta razón, la fusión somática es considerada como una alternativa para la recombinación sexual (Eeckhaut et al., 2005). 33 Cultivo in vitro Anthurium andreanum En la figura 18 se muestran dos estados del desarrollo de los embriones. En la sección 18.A se observan 4 embriones que fueron irradiados con rayos gamma. El embrión 1 se puede observar completamente desarrollado y totipotente; en la sección 18.B se aprecia claramente la influencia de las radiaciones sobre el crecimiento de los tejidos, mostrando gran desarrollo y consecución de la regeneración. A B Figura 18. (A) Embriones después de dos meses de cultivo. (B) Brotes formados después de la irradiación (Puchooa, 2003). El desarrollo de un sistema embriogénico con regeneración posterior de plántulas facilitaría la micropropagación y sería un paso valioso para la ingeniería genética. De esta manera se examinaron 19 medios de cultivo diferentes con el fin de dar inicio a la embriogénesis somática de Anthurium andreanum, todos ellos con una composición basal ½MS suplementado con 100 ppm de mioinositol y 25 ppm de NaFeEDTA y 0.4 ppm de tiamina. El medio para la conversión de los embriones somáticos y para el desarrollo continuo de las plántulas fue el mismo usado previamente para la regeneración de plántulas desde yemas y callos (2% sacarosa, 0.2 ppm BA, 0.18% de Gelrite y pH 5.8 antes del autoclavado). Los cultivos que dieron origen a embriones lo hicieron en la oscuridad a 23°C. Fue registrado el número de explantes de hoja capaces de formar un embrión somático luego de tres (3) semanas de cultivo (cajas de Petri con entre 15 y 20 explantes). Durante el primer mes de cultivo en la oscuridad se observaron los callos embriogénicos a lo largo de la superficie resultado del corte al extraer los explantes. El desarrollo de estos embriones se da en forma simple o en forma de agregados. La embriogénesis directa se observó en los explantes de hoja. La embriogénesis somática primaria se observó en los explantes de hoja. La embriogénesis somática secundaria se llevó a cabo frecuentemente y de forma directa sobre la superficie de embriones somáticos primarios o desde masas alargadas de proembriones derivados directa o indirectamente desde el explante. El número de embriones somáticos formados por explante usualmente fue menor a 5. Este valor puede ser tan alto como bajo dependiendo de la cantidad inicial de embriones primarios formados. La 34 Cultivo in vitro Anthurium andreanum producción de embriones somáticos desde explantes del pecíolo de las especies examinadas fue inferior en comparación con los explantes de hoja. La naturaleza y concentración de los azúcares ha demostrado ser importante en la formación de embriones somáticos. El agente solidificante Gelrite es mucho mejor que el agar (Adelheid et al., 1992). 10.4. Cultivo de tejidos transformados El Agrobacterium tumefaciens, una bacteria del suelo causante de la enfermedad denominada cresta de gallo en gran variedad de dicotiledóneas, también es usada como vehículo para la transferencia genética en plantas. Los genes transferidos son integrados establemente dentro del genoma de la planta transgénica que es transmitido a la descendencia como rasgo distintivo dominante mendeliano. De esta manera plantas intactas, explantes vegetales de origen múltiple y protoplastos pueden ser inoculados con Agrobacterium (Pollard, 1990). Anthurium andreanum es receptivo a la infección con Agrobacterium tumefaciens pidiéndose recuperar plantas transformadas desde callos luego del bombardeo con microproyectiles pero con una eficiencia baja (Adelheid et al., 1992). Al internarse en los tejidos y producir un daño mecánico sobre las células, los microproyectiles dejan expuesto al medio todo el contenido celular incluyendo el material genético; existe la probabilidad (dado el gran número de células) de que ocurra una recombinación genética (Pollard, 1990). Es así, como los explantes de raíz provenientes del hibrido ínter especifico UH 1060 cuyas raíces fueron transformadas con Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 permitieron la regeneración de plántulas completas (Chen, 1997). 35 Cultivo in vitro Anthurium andreanum CAPITULO III. ASEPSIA Y ESTERILIZACIÓN El procedimiento de esterilización del material vegetal o explante debe determinarse empíricamente, es decir, los métodos de esterilización no están generalizados, esto hace que la etapa de esterilización sea objeto de estudio o para ser más claro: de ensayo y error. La elección del método de esterilización del medio de cultivo es determinante a la hora de medir el progreso del cultivo (Roca, 2003). El explante o material vegetal contiene sobre su superficie una cantidad abundante de microflora y microfauna, la cual debe ser eliminada antes de realizar el corte del tejido u órgano que se utilice como inóculo (ver figura 19). Asimismo el operador y el medio de cultivo pueden ser fuentes, mientras que el aire se encarga de transportar los agentes infecciosos. La planta El operario Fuentes de infección El aire El medio Figura 19. Principales fuentes de infección. La esterilización se realiza con agentes desinfectantes. El agente desinfectante ideal, así como su concentración se determinan empíricamente para el material vegetal con el cual se trabaja. Las sustancias mas empleadas para esterilizar los explantes se presentan en la tabla 5. 36 Cultivo in vitro Anthurium andreanum Tabla 5. Agentes usados para esterilizar los explantes más comunes. AGENTES ESTERILIZANTES DE NATURALEZA QUÍMICA 1 AGENTE CONCENTRACION (%) 2 Hipoclorito de sodio 1-3 3 Hipoclorito de calcio 3.5-10 4 Cloruro mercúrico 0.01-0.05 0.1-1.5 5 Etanol 70-90 6 Tween-20 0.01-0.1 En los dos primeros el agente desinfectante activo es el cloro en concentraciones que se encuentran entre (0,1-2%) y (2-10%) actúa superficialmente como germicida y agente oxidante. Si la planta es sensible al NaOCl se puede usar el Ca(OCl)2 debido a que penetra con mas lentitud en los tejidos vegetales (Pierik, 1990). El bicloruro de mercurio es altamente tóxico y debe usarse entre 3-10 minutos. Para permitir una mejor penetración del agente desinfectante es muy recomendado sumergir el material vegetal o explante en una solución de etanol al 70% por periodos cortos, permitiendo eliminar el contenido graso de las hojas. El exceso de desinfectante se elimina mediante varios lavados con agua destilada y esterilizada (Roca, 2003). La preparación adecuada y la esterilización superficial del tejido vegetal son esenciales para el éxito en la asepsia de esta técnica. Las plantas clonadas usadas en los laboratorios comerciales frecuentemente son de alto valor y escasas. Un juzgamiento preciso de la extensión de la microflora superficial, junto con experiencias anteriores de esterilización de tejidos similares, es deseable antes de tomar una decisión sobre el procedimiento de esterilización. En términos generales la secuencia a seguir ha sido exitosa para aislar yemas o bulbos, así: 1. Remover el suelo, el tejido muerto o enfermo. 2. Sumergir en etanol al 70%. 3. Usar blanqueador comercial diluido al 10% (v/v) como esterilizante principal sumergiéndolo de 3 a 15 minutos. 4. Lavar con agua destilada estéril, primero un baño rápido y luego agitando durante 5 minutos. 5. Posteriormente; es necesaria otra esterilización de corta duracion durante la disección, puede ser seguida por abundantes lavados durante este procedimiento (Reinert, 1977). De acuerdo con Reinert, (1977) los frutos se separan de los espádices y esterilizados durante 15 minutos en hipoclorito al 3%, luego enjuagados por triplicado con agua destilada estéril, siguiendo el protocolo establecido por Pierik et al., (1974), con los siguientes cambios: cien semillas fueron aisladas y esterilizadas durante 20 minutos en hipoclorito al 1%, después fueron enjuagadas en dos ocasiones con agua destilada estéril durante 30 minutos. 37 Cultivo in vitro Anthurium andreanum Plantas élite libres de virus también pueden ser obtenidas siguiendo tratamientos de calor alrededor de 35-40°C durante un periodo de 2 semanas hasta varios meses. Inmediatamente después de este tratamiento, los meristemos apicales o brotes apicales son sembrados dentro en los medios de cultivo; algunos pueden sobrevivir libres de virus (Reinert, 1977). Según Pierik, (1990) existen tres (3) tipos básicos de esterilización: destrucción física (aire seco caliente, vapor, irradiación UV y gamma), destrucción química (compuestos esterilizantes) y eliminación mecánica por filtración. Así mismo considera que ciertas sustancias se descomponen bajo el procedimiento de esterilización en autoclave (compuestos termolábiles); por ejemplo, la sacarosa se hidroliza en glucosa y fructosa, la Colchicina, la zeatina, el ácido giberelico (pierden el 90% de su reactividad), vitamina B1 (se descompone en pirimidina y tiazol), vitamina B12, ácido pantoténico, vitamina C, antibióticos, extractos vegetales (pierden su actividad), enzimas, etc. Asimismo el mismo autor considera que luego del procedimiento de autoclavado se pueden presentar algunos de los siguientes fenómenos en el medio: el pH disminuye entre 0.3-0.5 unidades, caramelización de los azucares debido a las altas temperaturas haciéndolos tóxicos, sales precipitadas que despolimerizan el agar, destrucción de sustancias volátiles. 11. Tipos de microorganismos a combatir A menos que las esporas y las bacterias hayan entrado en el brote durante el lavado normal de la planta donante en el invernadero, generalmente están libre de bacterias u hongos y no se deben experimentan problemas de contaminación cuando se estable el cultivo convenientemente. Si bien, se asume básicamente que las colonias de hongos y bacterias están presentes, es útil conocer cuales son. Esta es tal vez la etapa de mayor importancia en el establecimiento de un cultivo in vitro de Anthurium andreanum, dado que la presencia de cualquier microorganismo reprime por completo la expresión y desarrollo del tejido cultivado. Una vez que todos los contaminantes de la superficie han sido removidos y el tejido ha sido lavado en varias ocasiones con agua destilada, se hace la selección inicial para cultivo, de tejido libre de contaminantes sistémicos (Reinert, 1977). 38 Cultivo in vitro Anthurium andreanum 11.1. Microorganismos endógenos Los contaminantes que se encuentran dentro de los tejidos son difíciles de eliminar. En este último caso puede ser útil la inclusión de fungistáticos o bacteriostáticos en el medio de cultivo: el sulfato de gentamicina, la penicilina (1 mg/L) y el sulfato de estreptomicina (10 a 50 mg/L) son algunos de los productos de alto espectro que se pueden usar. También es efectivo para la obtención de segmentos de tejidos libres de bacterias y hongos sistémicos (Roca, 1993). El cultivo de tejidos incrementa en gran escala el promedio de multiplicación normal de las plantas y puede considerarse como una fuente de material limpio con el cual se puede llegar a ser cada vez mas importante por estar libre de bacterias y otras enfermedades como la antracnosis, decadencia, mancha de la hoja, nudo de raíz (Puchooa, 2003). Entre los obstáculos que se encuentran comúnmente en la asepsia total de un explante estéril se encuentra la presencia de microorganismos en el interior de las estructuras vegetativas, lo cual tiene como consecuencia una serie de problemas durante el cultivo, pues no pueden ser eliminados por la desinfección superficial del tejido. Un método sencillo para controlar el crecimiento de los microorganismos indeseables comprende la adición de antibióticos (penicilina y estreptomicina 1.0 mg/L cada uno) durante dos horas después del tratamiento con hipoclorito. Es eficaz en ciertas ocasiones, pero con resultados variables (Roca, 1993). Para obtener plantas libres de virus se puede depender frecuentemente de ciertas particularidades de la distribución del virus dentro de la planta; por ejemplo, el virus del mosaico pepino que raramente invade la superficie del bulbo y mediante el cultivo de explantes de esta región, se logra el aislamiento de muchas plantas libres de virus. Sustancias químicas tales como el acido-2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y el tiouracilo pueden interferir con el metabolismo de los ácidos nucléicos y han sido empleados para la eliminación de virus. Sin embargo, no son muchos los partidarios de esta técnica debido a que la dosis requerida no esta propiamente determinada, y puede atacar igualmente al ADN y ARN de la planta huesped con la probabilidad de afectar adversamente el genoma (Reinert, 1977). Al parecer, en la especie estudiada, las infecciones en algunos casos son latentes (característica de microorganismos endógenos); es decir, parecen eliminadas hasta cuando se hacen evidentes nuevamente después de un lapso considerable de tiempo. Un ejemplo es el patógeno Xanthomonas campestris pv. Dieffenbachie, quien sobrevive en los callos alrededor de 4 meses sin producir síntomas u otras evidencias de su presencia como la turbidez en el medio de cultivo. El patógeno sobrevive por más de un año en el estadio II del brote sin producir ningún síntoma. La adición del 39 Cultivo in vitro Anthurium andreanum endospermo de coco incrementa el crecimiento bacteriano y repercute en la turbidez del medio de cultivo. En conclusión, cuando la infección es latente, es de esperarse que se de nuevamente luego de periodos de tiempo indefinidos apareciendo como un repunte de la enfermedad (Norman, 1994). El tratamiento por calentamiento puede presentar desventajas tales como la variabilidad presentada por las plantas derivadas de las yemas axiliares desde plantas élite, observándose incluso resistencia de la especie a los tratamientos con calor (Reinert, 1977). Fungicidas derivados del imidazol (imazasil, prochloraz, triflumizole y triazole) y retardantes de crecimiento como el paclobutrazol promueven la inducción de brotes similar a la acción de las citoquininas exógenas en Araceae, tales como Sphatiphylum floribundum Schott y Anthurium andreanum Schott; el su mecanismo de acción puede estar basado parcialmente en la inhibición de la síntesis del ácido giberélico (GA), porque la administración de GA3 inhiben completamente el fenómeno en S. floribundum. El metabolismo del BA no fue alterado significativamente por la adición de imazalil en el medio de propagación de S. floribundum (Werbrouck et al., 1996). 11.2. Gusanos microscópicos exógenos Uchida et al., (2003) describieron los síntomas claves (agujeros) para determinar presencia de nemátodos en Anthurium. La putrefacción de las raíces y el tallo causada por Radopholus similis es de color café y café oscuro. El desarrollo de la putrefacción es relativamente corto. Inicialmente, aunque las raíces viejas son infectadas, se producen nuevas raíces y la planta puede continuar con su buen desarrollo. En la figura 20 se puede observar la apariencia de las raíces afectadas por nemátodos. La presencia de nematodos induce la formación de callos, deteniéndose el crecimiento. Cuando esto ocurre, una raíz nueva lateral aparece cerca a la punta de la raíz infectada, y se prolonga hasta contaminarse también. Este ciclo resulta en una raíz aérea corta con muchos brotes adventicios voluminosos como en la parte A de la figura 21-1 (Uchida et al., 2003). La presencia de nemátodos también se hace evidente cuando se observa una coloración amarilla que comienza a colonizar la hoja desde los márgenes hasta llegar paulatinamente al sistema vascular principal ubicado en el centro de la hoja (figura 20). Como mecanismo de defensa las raíces muestran un comportamiento evasivo ante la presencia de los nematodos. De esta manera los meritemos y ápices radicales cambian el curso o dirección del crecimiento, convirtiéndolas en raíces aéreas y adventicias. Es así como 40 Cultivo in vitro Anthurium andreanum evitan el contacto con el suelo contaminado de nemátodos, buscando un nuevo sustrato sólido para soportarse (ver la figura 21-1). Figura 20. Imagen de una planta atacada por nemátodos. Las raíces se muestran oscuras y las hojas amarillentas por Uchida et al., (2003). En las figuras 21-2 y 21-3 se puede observar la morfología y partes de un nemátodo y de su descendencia. 1 2 3 Figura 21. (1) Desarrollo de las raíces cuando intentan evadir la presencia de nemátodo. (2) Fotomicrografía de un nemátodo; las letras A, B y C representan la cabeza, el estileto (la válvula o apertura para poner los huevos) y la cola respectivamente. (3) Fotomicrogafía de un huevo de nemátodo (Uchida et al., 2003). 41 Cultivo in vitro Anthurium andreanum CAPITULO IV. MEDIOS DE CULTIVO El medio de cultivo esta formado por agua, agar, azúcares, elementos minerales, eventualmente una mezcla de vitaminas y sustancias orgánicas y, finalmente reguladores de crecimiento. El éxito que se tenga en un cultivo de tejidos depende del uso de los nutrientes adecuados. La gran dificultad en la elección del medio de cultivo reside en que es prácticamente imposible porque entran en juego dos variables: el número de componentes de la mezcla y la concentración de cada uno de ellos. El número de posibles medios es definitivamente infinito (Vargas et al., 2004). La selección entre medio líquido o sólido puede depender de la fuente del explante y el objetivo del cultivo (Reinert, 1977). El éxito del cultivo de tejidos vegetales depende sustancialmente del medio de cultivo empleado. Para establecer un sistema de cultivo de tejidos, se elabora primero un medio de cultivo óptimo que se ajuste a los principales requerimientos nutricionales de la especie vegetal, al tipo de explante, y al sistema de cultivo (Roca, 1993). Hay suficiente evidencia para demostrar que las plántulas producto del cultivo de tejidos pueden mostrar un grado aceptable de uniformidad para el cultivador comercial, aunque esto manifiesta la necesidad de variar el medio de cultivo de acuerdo con el género, la especie, la variedad y clones regulares para suministrar material vegetal uniforme (Reinert, 1977). La elección del medio se hace empíricamente, recurriendo nuevamente al ensayo y error para seleccionar la mejor combinación. Para ganar tiempo, se puede partir de un medio ya utilizado en investigaciones anteriores en el mismo material vegetal o de ejemplos que puedan resultar comparables e irlos mejorando puntualmente. Cada planta e incluso cada órgano debe considerarse como un caso particular (Vargas et al., 2004). Si bien, puede ser empleado un medio de cultivo relativamente simple para propósitos de propagación, es necesario que los nutrientes no esenciales, orgánicos o inorgánicos, deben estar ausentes. Los medios extremadamente complejos son usualmente innecesarios para la propagación vegetal en general (Reinert, 1977). La relaciones entre la morfología de la planta élite pueden también ser discutidas considerando la nutrición y química de la regulación del 42 Cultivo in vitro Anthurium andreanum crecimiento. Por ejemplo, el ambiente químico, la composición del medio de cultivo, es tal vez el aspecto más estudiado en el cultivo de tejidos y la micropropagación. Muchos tratan de concebir un medio conteniendo las cantidades precisas de macro y micronutrientes, constituyentes orgánicos y reguladores de crecimiento, sin un protocolo uniforme aceptado por el micropropagador hasta la fecha. Teng (1997), encontró que en cultivos líquidos o flotantes, se generaban mas brotes adventicios sencillos o en pequeños agregados, lo cual es una ventaja en comparación con los medios sólidos (Vargas et al., 2004). Fue así como Appenroth, (2003) cultivó in vitro 8 clones diferentes en dos medios diferentes; bajo condiciones axénicas (libres de parásitos y de simbiontes), durante 28 días y fueron subcultivados semanalmente. De forma paralela otro grupo de plantas fue cultivado durante 50 días. El rango inicial de crecimiento fue medido en condiciones de luz continua. Varios factores del medio fueron examinados, entre ellos la concentración del nitrato de amonio tuvo el efecto más significativo sobre el callo y la formación de brotes a partir de tejidos de hoja. Una concentración baja de nitrato amonio NH4NO3 (200 mg/L) demostró ser benéfica en la inducción o regeneración en todos los genotipos investigados. Como comparación en la inducción, la multiplicación de callos y brotes en los subcultivos fue poco susceptible a la acción de varios factores del medio. Después del aislamiento a partir del callo, los brotes formaron fácilmente raíces en la ausencia de reguladores de crecimiento. Altas concentraciones de nitrato de amonio NH4NO3 (720 MG/L) aceleraron fuertemente la formación de raíces. La habilidad para el enraizamiento disminuyó progresivamente como consecuencia de la multiplicación repetida de brotes en la presencia de benciladenina (BA) como único regulador de crecimiento (Geier, 1986). Variaciones del medio desarrollado por Knudson (1922), Murashige and Skoog (MS) (1962), o White (1963) son generalmente efectivos tanto para los niveles de macro como micro nutrientes con sacarosa como fuente de carbono (Reinert, 1977). Muchos investigadores han demostrado que la adición de carbón activado frecuentemente tiene un efecto estimulador en el crecimiento y la organogénesis de las especies además de estabilizar el pH (Pierik, 1990). 43 Cultivo in vitro Anthurium andreanum 12. Medio Murashige & Skoog (MS) Los cultivos in-vitro han tenido un gran desarrollo en cuanto a la micropropagación de especies de interés gracias a la optimización de los medios de cultivo. Durante aproximadamente medio siglo los investigadores en este campo han procurado establecer metodologías de cultivo a partir del medio MS. Este medio presenta la combinación adecuada de elementos (sales inorgánicas y material inerte de soporte). El medio MS, esta caracterizado por un contenido muy fuerte de nitrógeno (60 meq/L aprox.) del cual 1/3 esta presente en forma reducida (NH4+) y por una concentración igualmente elevada de potasio. Además, su contenido en algunos iones supera el óptimo en determinados casos. Diversos investigadores emplean la solución del medio MS (macroelementos) diluido a la mitad (½MS), lo que por otra parte no modifica la relación NH4+/N total. El medio MS fue empleado por Norman (1994), Adelhied (1992), Fure-Chyin, (1997) logrando la obtención en todos ellos de diferentes tipos de tejidos in vitro (callos, brotes, embriones somáticos primarios, embriones somáticos secundarios y plantas completas de Anthurium). De esta manera, se demuestra la factibilidad de iniciar el cultivo con este medio. La semilla tiene también control hormonal sobre la germinación, la semilla entra en dormancia y puede romperse al cambiar la ecuación de equilibrio entre el inhibidor y el promotor. Muchas veces algunas faltas en la germinación de semillas se deben exclusivamente a que el inhibidor esta presente y los tratamientos que se dan no han sido capaces de eliminarlo (Pacheco et al., 1987). 13. Medio Nitsch & Nitsch (NN) El medio NN es esencialmente una modificación de la solución de Knop, una de las primeras soluciones en el cultivo hidropónico (cerca de 1865). Este medio fue útil en el cultivo de partes de flores de tomate; la concentración de sacarosa utilizada era de 5% en lugar de 2% ó 3% utilizado en muchos otros medios (Roca, 1993). Fueron usados cuatro medios de cultivo Murashige y Skoog a la mitad y completa concentración de macronutrientes (½MS y MS), el medio para plantas maderables (WPM) y NN (ver composición en anexo 5) para cultivar tres tipos de explante de tallo, hoja y nudos de Anthurium de la variedad Sonat. Todos los medios fueron suplementados con 3% de sacarosa, 0.5 44 Cultivo in vitro Anthurium andreanum mg/L TDZ y 0.5 mg/L de BA. Este medio también fue solidificado con 0.75% de agar y pH a 5.7 antes del autoclavado. Después de 2 semanas de cultivo en la oscuridad, se registró el porcentaje de formación de callos en los explantes El medio basal MS y el ½MS (mitad de la concentración de macro y micronutrientes excepto el complejo de hierro) presentaron una alta formación de callo (86.6%) desde explantes de hoja, seguido por el medio WPM (66.67%) y el medio NN (40%). En el caso de los explantes nodales, el medio ½MS presentó la formación de callos más alta (100%). Los callos sobre medio NN y ½MS mostraron ser de tipo NMC (callos meristematicos nodulares) mientras que los medios MS y WPM promovieron la formación de estructuras embriogénicas (Te-Chato et al., 2006). Se ha reportado la inducción a partir de hojas de embriones somáticos, sobre medio ½MS. Esta situación induce células meristemáticas las cuales experimentan NMC, especialmente bajo la adición de sulfato de adenina. Una alta concentración de NH4NO3 en los medios WPM y MS favorece la formación de estructuras embriogénicas. En la tabla 6 se resumen varios de los medios de cultivo, explantes y fitohormonas usadas en el cultivo de tejidos de Anthurium andreanum. Tabla 6. Resultados y parámetros importantes en el establecimiento in vitro de Anthurium andreanum Medio de cultivo MS ½MS MS MS MM* MS ½MS Tejido Brotes y callos Embriones somáticos secundarios sin la intervención de callos sobre la superficie de embriones primarios Embriones para transferir Explantes de raíz Explantes de hojas jóvenes Embriones somáticos convertidos en plantas completas Callos NN Callos WPM Callos Reguladores Otros componentes Referencia --------------------1.0 – 4.0 ppm 2,4-D 0.33–1.0 ppm Kinetina --------------------- Norman (1994) 0.2 ppm 6-benciladenina 0.8 ppm 4.0 ppm 2,4-D 2.5 % sacarosa Adelheid (1992) --------------------2.0 % sacarosa Fure-Chyi (1997) Musa (1997) 0.1 ppm Kinetina 2.0 % sacarosa Musa (1997) 0.5 ppm TDZ 0.5 ppm BA 0.5 ppm TDZ 0.5 ppm BA 0.5 ppm TDZ 0.5 ppm BA 3.0 % sacarosa Te-chato et al., (2006) Te-chato et al., (2006) Te-chato et al., (2006) 2.0 % sacarosa Adelheid (1992) 1.0 % glucosa 3.0 % sacarosa 3.0 % sacarosa (*) Medio desarrollado por Musa (1997) diluido a la mitad. 45 Cultivo in vitro Anthurium andreanum Además la concentración del ión potasio y Fe-EDTA ha mostrado ser esencial para la embriogénesis somática (Te-Chato et al., 2006). Tabla 7. Efecto del medio de cultivo sobre la formación de callos a partir de explantes de hojas y segmentos nodulares de Anthurium. Todos los medios fueron suplementados con 3% de sacarosa, 0.5 mg/L de TDZ y 0.5 mg/L de BA y cultivados durante 8 semanas. Medio ½MS MS WPM NN Número de Explantes Cultivados Hojas Nudos 15 15 15 15 10 10 10 10 Formación de Callos (%) Tipo de Callo Hojas Nudos 86.60 86.60 66.67 40.00 100 70 60 20 Callos nodulares amarillos Estructuras embriogénicas Estructuras embriogénicas Callos nodulares rojo-amarillo 14. Regulación del crecimiento La regulación del crecimiento se puede comparar análogamente con un control que manipula la expresión genética de los tejidos cultivados, es decir, con la variación de la concentración y el tipo de regulador se obtienen diferentes respuestas. Recientemente Te Chato et al., (2006) reportaron callos con características embriogénicas de Anthurium andreanum cultivados sobre medio MS suplementado con 2,4-D y BA y la otra mitad suplementados con 2,4-D y kinetina (Te-Chato et al., 2006) en medio MS solidificado con agar con 3% de sacarosa, suplementados con los reguladores en las siguientes concentraciones: 0.5mg/L de BA y 0.5mg/L de Thidiazuron (TDZ). Se pueden adicionar cuidadosamente sustancias promotoras del crecimiento sobre el medio de cultivo. Debe ser omitidas sustancias con las cuales es posible causar variaciones en los niveles del ácido nucleico (Reinert, 1977). Es posible que las variaciones observadas en las plantas producidas mediante el cultivo de tejidos en sistemas nutritivos tengan origen en la regulación; resultan tener rangos de división celular más rápidos o si contienen 2,4-D (Reinert, 1977). La presencia de citoquininas en un rango de concentraciones entre 0,5 a 10 mg/L, dependiendo del tejido; pueden producir el tipo de crecimiento mas satisfactorio para la propagación vegetativa. Según Reinert, (1977).la proporción de citoquinina y auxina es importante durante el proceso de organogénesis. 46 Cultivo in vitro Anthurium andreanum Frecuentemente es difícil reproducir las condiciones para que crezcan callos con promedios óptimos de crecimiento. Por el contrario, estos tejidos desdiferenciados pueden mostrar una rápida división celular ocurriendo replicaciones incompletas del genoma;debido a esto se pueden presentar serias aberraciones cromosomales (Reinert, 1977). Las referencias consultadas hasta el momento sugieren el empleo de 5 reguladores de crecimiento en esta especie para diferentes propósitos (ver Tabla 8). Tabla 8. Reguladores de crecimiento empleados en el cultivo in vitro de Anthurium. N° 1 Regulador de Crecimiento Benciladenina (BA) Referencia Adelheid, (1992); Fure-Chyi, (1997); Linz (2005); Vargas et al., (2004) 2 Kinetina Adelheid, (1992); Musa, (1997) 3 Acido naftalenacético (ANA) Acido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) Thidiazuron (TDZ) Linz, (2005); Vargas et al., (2004) 4 5 Musa, (1997) Te-Chato et al., (2006) Con ellos se logra la expresión del explante en callos embriogénicos, desarrollándose hasta embriones primarios y secundarios, la evolución de los mismos hasta plántulas; por esta vía se pueden obtener plántulas regeneradas y de estas últimas, germinar semillas para posteriormente rescatar el embrión. En estudios de post-cosecha de Anthurium andreanum realizados por Paull, (2000), la benciladenina demostró ser muy importante dado que incrementa el tiempo de vida de la flor cortada en un factor que va desde 1 tiempo de vida hasta el doble de lo normal. 15. Condiciones de cultivo Los efectos de la temperatura de cultivo, gases y condiciones físicas del ambiente, influyen en conjunto sobre el éxito del cultivo in vitro. La figura 22 muestra un aumento progresivo en el tamaño del recipiente de cultivo y el número de plántulas establecidas en cada uno. 47 Cultivo in vitro Anthurium andreanum Figura 22. Cambio progresivo en el tamaño del recipiente de cultivo Anthurium durante el establecimiento ex vitro En este estudio se tuvieron en cuenta tres factores de la eficiencia del sistema de micropropagación: 1. La capacidad para inducir la organogénesis regeneración. 2. La eficiencia en cuanto a la aclimatación. 3. Los costos. y su posterior Pasaron del medio basal y frascos de vidrio a sistemas de mayor capacidad tanto para el medio como para la atmósfera circundante. En la figura 22 se puede apreciar cada etapa; incluso, se estudió el desarrollo de los tejidos en diferentes sustratos sólidos y al aire libre (Teixeira, 2005). 15.1. Fotoperiodo De acuerdo con Pataky, (2001) la manipulación del ambiente físico tiene efectos dramáticos sobre la respuesta del explante in vitro. Uno de los factores más importantes es la luz. La cantidad e intensidad de luz afectan la fotosíntesis de los cultivos con abundante follaje y tiene un impacto sobre otros procesos fisiológicos por ejemplo los niveles endógenos de hormonas, los cuales influyen sobre cambios en el desempeño del explante cultivado in vitro. La respuesta al fotoperiodo demuestra un promedio de anticipación a la temporada de ambiente adverso. Tanto la reproducción sexual (florecimiento) como la reproducción vegetativa (formación de rizomas, raíz, tallo, brotes escamosos, etc.) frecuentemente dependen de la duración del día (Appenroth, 2003). Los Anthurium pueden recibir un mínimo de 150 pies/candela (ft/c) en los interiores, pero son producidos bajo 1500 a 2500 (ft/c) (Pataky, 2001). 48 Cultivo in vitro Anthurium andreanum La calidad de la luz, especialmente la roja y la roja intensa también afectan los procesos hormonales y consecuentemente los resultados in vitro. El fotoperido afecta la morfología en el linaje de la planta el cual es relativo a las respuestas del explante durante los cultivos subsecuentes. Vargas et al., (2004), examinó en dos medios diferentes la influencia de las luz y de la oscuridad. La conversión y regeneración de embriones somáticos se presentó bajo 16 horas de fotoperiodo a 25°C (54 µm olm-2seg-1) (Adelheid, 1992). 15.2. Temperatura En cuanto a la familia se reportan cultivos de Spirodela polyrhiza donde la temperatura fue fijada en 25.0 ± 0.1 C ° en todos lo s experimentos (Appenroth, 2003). Aunque los Anthurium son sensibles a bajas temperaturas como lo afirma Reid, (2004); entre 19 y 21°C el res ultado es un crecimiento y enrizamiento pobre de los 4 tipos de variedades estudiadas por Pataky, (2001) quien consideró que tienen un tiempo de vida razonable cuando son manejados apropiadamente. Según Pierik, (1990) los Anthurium requieren una temperatura calida y una humedad alta, lo que permite que sean cultivadas usualmente bajo condiciones de invernadero. La temperatura bajo la cual la planta élite es cultivada puede afectar el desempeño del explante. Numerosos ejemplos sobre la influencia de la luz incluyendo exclusión de la luz, diferentes cantidades de luz (intensidad, fotoperiodo) y la manipulación de la calidad de la luz proporcionan datos sobre el comportamiento y desarrollo del explante. Hay estudios que demuestran los efectos de la calidad y cantidad de la luz sobre el desempeño del explante in vitro. 49 Cultivo in vitro Anthurium andreanum 15.3. Subcultivo A los dos o tres meses de iniciación del cultivo, los embriones fueron subcultivados (Adelheid, 1992). 20 segmentos de aproximadamente 1cm2 del callo fueron subcultivados sobre la misma variante del medio MS (sin hormonas) durante 3 meses. Después, las plantas de 7 meses de edad fueron removidas de los recipientes de cultivo (Vargas et al., 2004). Los brotes enraizados con dos (2) o mas hojas fueron transferidos a un medio construido con tres (3) fibras diferentes con alrededor de 15 plántulas por recipiente (Adelheid, 1992). 15.4. Establecimiento en campo De acuerdo con Pataky, (2001) los Anthurium son tolerantes a condiciones de humedad baja y pueden ser fácilmente cultivados en un medio de textura ligera, buen drenaje pero húmedo y enriquecido. Musa et al., (1997) transfirieron las plantas a condiciones de invernadero para realizar una evaluación de la uniformidad de las mismas. Las plántulas regeneradas por organogénesis fueron transferidas a masetas y se logró una tasa de aclimatización del 80% (Vargas et al., 2004; Linz, 2005). 15.5. Cuidados post-cosecha Una vez cortada la flor, queda condenada a muerte; es decir, lo único que se puede hacer es alargar su tiempo de vida. Más aún, cuando se trata con procesos de exportación en los cuales son sometidas a condiciones fisicoquímicas ajenas a las condiciones in situ. Simulaciones de este proceso son comunes en los estudios como los realizados por Whittaker, (1993) y Shirakawa et al., (1964) quienes usaron una secuencia de manejo postcosecha correspondiente a: cosecha-empacado-transporte y desempacado. El tiempo de vida de los Anthurium después de cosechados puede variar significativamente dependiendo incluso de las estaciones, desde 8 hasta 69 días. 50 Cultivo in vitro Anthurium andreanum Reid, (2004) argumentó que el tiempo de vida de la flor llega a su fin usualmente como resultado de la inhabilidad para obtener agua de un florero, asociado a la pérdida de sus brillantes colores y el añil de su espata. Gran parte del agua perdida por la flor se evapora por el espádice. Igualmente recomienda la aplicación de cera que puede prevenir esta perdida de agua y mantener la aplicación de nitrato de plata para mejorar las relaciones entre el agua y la flor; extendiendo su tiempo de vida considerablemente. Los nuevos cultivos proveen un amplio rango de colores y formas y su tiempo de vida puede ser bastante largo, comenta Reid, (2004); en promedio de 14 a 28 días considera Buldewo, (2002). 15.6. Conservación de la calidad de la flor El patrón de respuesta a la concentración de benciladenina (BA) de las diferentes especies es significativamente variable. Para una concentración de 200 ppm, el tiempo de vida se amplia hasta un maximo de 51 días, un valor muy considerable a la hora de calificar la flor de corte como duradera. En la tabla 9 se muestran los resultados de diferentes variedades estudiadas. Tabla 9. Resultados del tratamiento con BA para la conservación de la flor de corte (Paull, 2000) Efecto de la inmersión en BA [200ppm] sobre el tiempo de vida post-cosecha. Temperatura de 22 C ° Variedades Tiempo de vida post-cosecha (Días) Factor de Sin BA Con BA (σ) incremento 1 New Pahoa Red (***) 3.2 16 51 2 Marian Seefurth (**) 2.5 19 46 3 Tatsata Pink 2.4 17 41 4 Kalapana 2.3 14 32 5 Oshiro Red 2.2 18 40 6 Lavender Lady 2.0 15 30 7 Mickey Mouse 2.0 20 40 8 Oshiro White 2.0 19 37 9 Tropic Mist 1.6 27 43 10 Rainbow 1.6 27 43 11 Blush Oishi 1.5 26 40 12 Kozohara 1.5 29 42 13 Blush Bride (*) 1.5 31 44 14 Nitta (***) 1.5 34 51 15 Ozaki 0.8 24 19 La convención (*) Indica los tiempos de vida largos. Entre mayor sea el número de (*) mas tiempo de vida tiene la flor. 51 Cultivo in vitro Anthurium andreanum Para cuestiones de reducción de costos, los resultados obtenidos con una concentración menor son muy similares y mucho mas rentables dados los costos comerciales tan altos del BA. En la tabla 10 se presentan los resultados obtenidos con una concentración de 100 ppm de BA. De esta manera se pueden obtener resultados igualmente importantes sobre el tiempo de vida de los Anthurium con menores costos y mayor rendimiento de la producción. Tabla 10. Concentración de BA más rentable para alargar el tiempo de vida de los Anthurium en la flor de corte significativamente. Efectos de la inmersión en solución 100 ppm de BA sobre el tiempo de vida de las flores de 5 variedades de Anthurium. (Paull. 2000) Variedad Tiempo de vida post-cosecha (días) 1 Leilani 52 2 Blusa Oishi 51 3 Marian Seefurth 35 4 Purple arcs 32 5 Ozaki 25 52 Cultivo in vitro Anthurium andreanum PROYECTO DE NEGOCIO 53 Cultivo in vitro Anthurium andreanum CAPITULO V. CONSIDERACIONES 16. Importancia de la especie Los Anthurium entre las flores tropicales tienen la segunda importancia comercial después de las orquídeas (Buldewo, 2002). La demanda de material propagado y nuevas especies es muy fuerte (Adelheid et al., 1992). Prakash, (2005) considera que numerosas especies son producidas y comercializadas internacionalmente como flores de corte, plantas completas y plantas ornamentales florecidas. Muchas de las flores de corte de Anthurium son reconocidas por ser híbridos de Anthurium andreanum Linden ex André con muchas especies relacionadas comprendidas en la sección Calomystrium y han sido referenciadas como Anthurium andreanum Hort. son consideradas como flores de gran valor (Buldewo, 2002). Las variedades que han sido obtenidas por hibridación, se clasifican de acuerdo con el color, las dimensiones y la forma de la espata, la longitud y color del espádice, características de producción agronómica de la planta. La propagación in vitro de híbridos de Anthurium tiene un uso comercialmente amplio con algunos defectos pero relativamente bajos como el cultivo de yemas o variación somaclonal ocasional desconfiable como en el cultivo de callos. La embriogénesis somática es un método alternativo de micropropagación (Adelheid et al., 1992). Comprender su biología y composición química es de gran ayuda para nuestra supervivencia. De esta manera, los modelos de desarrollo determinados para órganos como el espádice, que antes se creían sin ninguna lógica, ahora se muestran como modelos promisorios de desarrollo de tipo naturalista para procesos administrativos y de desarrollo. Los resultados no pueden ser mejores pues su sistema reproductivo es el responsable de que la planta disemine el linaje (Anónimo., 2007). 54 Cultivo in vitro Anthurium andreanum 17. Antecedentes De acuerdo con Álvarez, (2006) esta industria se desarrolló principalmente como un pasatiempo en una parte de los jardines de los cultivadores quienes cambiaron las flores de tienda durante la década de 1940. Las operaciones comerciales para la producción de Anthurium en 1959 incluyeron 266 granjas en Hawaii, 88 en Oahu, 7 en Kauai y 4 en Maui. Según él, los incrementos en la demanda mundial en cuanto a flores de Anthurium cortadas en la década de 1970 promovieron las ventas e incrementaron el área de producción de 40 acres hasta 400 acres en 1979. La industria llegó hasta su máximo en 1980, suministró en el mercado local, nacional e internacional con un aumento de 232.000 docenas de flores por mes. En el caso del genero Anthurium los terrenos de cultivo medidos en acres han incrementado dramáticamente; las plantas son derivadas de semillas con variaciones substanciales en los aspectos mas importantes del color, calidad, producción anual y tiempo para el primer florecimiento (Reinert, 1977). Hay una demanda fuerte para la producción vegetativa de plantas élites que la importación convencional no puede satisfacer (Reinert, 1977). Recientemente la micropropagación de Anthurium es una práctica común comercialmente (Te-Chato et al., 2006). 18. Industria mundial A partir de los avances alcanzados en la regeneración de plantulas in vitro se ha desarrollado toda una industria de micropropagación, que se inició en los países desarrollados de Europa y Estados Unidos y que en la actualidad se ha extendido al resto del mundo incluyendo a los países de América Latina, Asia y África. Esta industria esta compuesta por cerca de 600 compañías en el mundo con una producción con mas de 500 millones de unidades por año (Pérez, 1997). 18.1. Países productores En la actualidad Hawaii y Holanda son los mayores productores de los híbridos y nuevas variedades de Anthurium (Murguía, 1996). Holanda mantiene una producción anual de 25 millones mientras que Hawaii produce 55 Cultivo in vitro Anthurium andreanum 11 millones (Buldewo, 2002). La isla Mauricio es la tercera nación con mayor producción de flores de corte de Anthurium andreanum en el mundo y suministra alrededor de 10.2 millones de flores anualmente (Prakash, 2005; Buldewo, 2002). 18.2. Oferta Aunque la producción fue de 2.5 millones de docenas de flores en 1980, el suplemento fue insuficiente para hacer frente a la demanda. Muchos de los Anthurium cultivados en la actualidad son denominados Anthurium andreanum pero difieren en apariencia de las especies nativas. Prakash, (2005) considera que las tres categorías estandar, obaky y tulipán son producidas en disposición para satisfacer las mayores preferencias del mercado en cuanto a color, forma y tamaño. 18.3. Demanda Los Anthurium tienen gran demanda en el mercado nacional e internacional por la vistosidad atractiva con que adornan los arreglos; las flores rojas son las de mayor demanda y las más cultivadas, pero las rosadas, blancas y bicolores son también muy apreciadas (Murguía, 1996). Especies dentro del género Anthurium (Araceae), están altamente cotizadas por sus flores exóticas y su follaje lo cual hace que la demanda de nuevas variedades de material propagado sea muy alta. En el año 2000, el 95% de las flores exportadas estaban constituidas por Anthurium, mostrando su importancia significativa en la industria de la horticultura (Puchooa, 2003). Este consumo se ha incrementado en los años recientes en países de Asia, tales como Japón, pero su nivel de consumo ha permanecido igual en Europa (Buldewo, 2002). 18.4. Calidad La aplicación del cultivo de tejidos vegetales o in vitro puede posibilitar al cultivador el suministrar flores de corte de Anthurium cultivado con la selección clonal para mejorar los cultivos, la calidad y resistir el incremento 56 Cultivo in vitro Anthurium andreanum continuo de costos en labores, combustible y materiales (Reinert, 1977). Los nuevos cultivos proveen un amplio rango de colores y formas, su tiempo de vida puede ser bastante largo (Reid, 2004). 19. Requisitos para entrar a competir 19.1. Saber Como El cultivo in vitro de tejidos vegetales comprende una gran variedad de procedimientos técnicos enfocados a la manipulación de material vegetal en el laboratorio, bajo condiciones artificiales de cultivo y factores físicos modificados (Pacheco et al., 1987). El cultivo de tejidos solamente será una herramienta valiosa en la creación de plantas élite sanas y en la multiplicación inicial si el tamaño y la forma de las plantas que se entregan a los cultivadores son aceptables y a buen precio. El potencial del cultivo de tejidos vegetales para algunos de los nuevos cultivos es mejor evaluado por los cultivadores que por las estadísticas oficiales. En el presente muchos cultivadores desean usar el cultivo de tejidos y aunque la aplicación de los nuevos desarrollos presentan algunas preocupaciones con respecto a los promedios de supervivencia y la uniformidad eventual producida, hay una combinación del “Saber como” científico y la habilidad de los cultivadores para adaptar sus técnicas agrícolas y derrotar los problemas de cultivo (Reinert, 1977). Existen tres puntos clave a tener en cuenta para el éxito en el establecimiento de un cultivo. El ambiente: 1. Bajo el cual la planta élite es cultivada. 2. Las condiciones bajo las cuales el explante es cultivado. 3. Mediante el cual las plantas micropropagadas son climatizadas Es suficiente decir que una especie particular puede favorablemente a un conjunto de condiciones mientras que otras hacerlo; por consiguiente, la tarea de decidir las condiciones adecuadas puede requerir, en algunos casos, una decisión por el ensayo y error (Roca, 1993). reaccionar no pueden de cultivo método de Muchos factores pueden tener influencia sobre el desempeño de una empresa de horticultura, y es así, como la micropropagación se convierte en una aptitud directiva bastante exitosa dado que es el profesional, quien puede controlar las condiciones. Esta discusión se puede centrar en los factores bióticos que son influenciados por la planta élite que da origen a los 57 Cultivo in vitro Anthurium andreanum explantes y que tienen incidencia sobre el desempeño del cultivo in vitro. Por lo tanto, debemos entender que la única opción disponible para el desarrollo conveniente de los métodos de cultivo o la modificación de los existentes es el cultivo in vitro (Puchooa, 2003). Para el buen desempeño de la industria de micropropagación se deben destinar espacios necesarios para las diferentes actividades. De esta manera se hace necesario el diseño de un laboratorio a las exigencias y necesidades del micropropagador. Teniendo en cuenta estos factores se plantea la siguiente infraestructura y distribución física (ver figura 23): 1. 2. 3. 4. 5. 6. Dirección general. Secretaría general. Información, recepción, biblioteca y sistemas. Archivo general. Mantenimiento. Laboratorio procedimientos químicos, preparación y esterilización de medios. 7. Cambio ropas sucias. 8. Ducha y asepsia de operadores. 9. Intercambiador ropas procedimientos in vitro. 10. Salón intermedio (con esterilización por radiaciones UV, rayos X, gamma, etc.). 11. Sala de siembra subcultivos y repique (inoculaciones). 12. Sala de cultivo en observación. 13. Sala de cultivo general y banco de germoplasma. 14. Almacén general de materiales y reactivos. 15. Baños 16. Sala de esterilización. 17. Tratamiento de desechos sólidos y clasificación de las basuras 18. Planta eléctrica y aire acondicionado. La distribución no es al azar y tiene una lógica pensada para evitar al máximoque se produzca la contaminación cruzada. Existe un área para las labores administrativas (1,2,3,4 y 5), otra para los diferentes procedimientos in vitro (6,7,8,9,10,11,12 y 13), así como una zona de almacenamiento de desecho, mantenimiento y limpieza (14, 15, 16, 17, y 18). De igual manera, existen consideraciones con respecto a la movilización en la zona in vitro. Para evitar la contaminación cruzada, los procedimientos deben ser programados para evitar el transito por las zonas adyacentes, de tal manera que el material para propagación, medios de cultivo y el material metálico y de vidrio sufran el efecto esterilizante de las radiaciones en la zona 10. El personal de micropropagación debe ingresar a esta zona cuando se encuentre estéril y lo debe hacer pasando por las zonas 7, 8 y 9 donde podrá 58 Cultivo in vitro Anthurium andreanum realizarse una asepsia rigurosa. Cuando se encuentre en la sala de siembra, solo podrá regresar a 10 para acomodar el material contaminado y los diferentes desechos. El material in vitro será dispuesto en la sala de cultivo en observación (12) para evitar contaminación del banco de germoplasma (13). Cabe aclarar que el cumplimiento de las direcciones de desplazamiento permite controlar mucho mejor los casos de contaminación cruzada. A la zona 13 solo llega el material con calidad de totipotente. Figura 23. Planos de un laboratorio de micropropagación a gran escala propuesto para este trabajo teniendo en cuenta los requerimientos del cultivo in vitro. Adaptado de Montoya, (1991). 59 Cultivo in vitro Anthurium andreanum Las consideraciones con respecto al invernadero pueden variar dependiendo de la topografía que se tenga. La sala de cultivo en observación y general requiere de grandes ventanas y la mayor cantidad de radiaciones solares. También es necesaria una cámara oscura para proporcionar oscuridad cuando sea necesario (se puede instalar en la sala de observación ya que es algo pasajero en la mayoría de los casos). 60 Cultivo in vitro Anthurium andreanum CAPITULO VI. METODOLOGÍA Según Reinert, (1977) el esquema general para la micropropagación empleado puede tener tres (3) puntos de partida diferentes. Es así como podemos iniciar el cultivo desde material vegetal de un mutante que muestre estabilidad genética, o clones de las variedades existentes y especimenes seleccionados por un programa de cultivo mediante el mejoramiento selectivo. Este esquema se centra en la regeneración indirecta debido al paso por el estado intermedio de callo. En la figura 24 se registran los pasos principales en esta forma de micropropagación. Mutante estable Seleccionadas desde un programa de cultivo Clones seleccionados desde las variedades existentes Planta Plántula u órgano libre de enfermedades Tipo general de organogénesis desde callo Callos producidos desde explantes del meristemo apical del tejido de tallo Plántulas de Anthurium Figura 24. Esquema para la propagación de plantas usado en los laboratorios Twyford Ltda (Reinert, 1977). 20. Desarrollo del cultivo in vitro. La mayoría de las plantas estudiadas han sido dicotiledóneas y el trabajo sobre monocotiledóneas ha sido considerado por algún tiempo por muchos 61 Cultivo in vitro Anthurium andreanum más difícil, pero hay evidencia amplia de que los callos obtenidos desde monocotiledóneas pueden producirse sin dificultad. Las revisiones establecen que deben ser considerados 3 estados cuando se considere la propagación mediante cultivo de tejidos. El estado inicial adicional es la función patológica de identificar y remover subsecuentemente alguna enfermedad presente en las especificaciones del cliente. Las plantas cuyos exámenes preliminares las posicionan como libres de virus, son cultivadas de tal manera que se asegure la remoción de otros organismos contaminantes (Reinert, 1977). Para empezar se deben seleccionar las plantas élite. Estas deben presentar las mejores características de la especie o variedad, deben estar libres de patógeno en el mayor grado posible. Deben ser plantas jóvenes sin quemaduras y sin muestras de sequedad. La(s) planta(s) élite será(n) sometida(s) a polinización controlada en condiciones de invernadero y posteriormente se realizará la selección de semilla desde fruto maduro. Es posible que sea necesaria una etapa de secado de la semilla, que en muchos casos es necesaria para obtener una mejor respuesta de la misma cuando sea sembrada (etapa de dormancia). Seguido de esta primera etapa de selección viene la etapa de siembra de las plantas élite, que se puede realizar en el sustrato constituido por una mezcla desinfectada de grava volcánica, compostaje y astillas de madera, al cual se le suministra una solución nutriente mediante irrigación por goteo. Este suministro es de aproximadamente 130 mL de solución por día (Dufour, 2005). Según los resultados obtenidos por Dufour, (2005) y registrados en la Tabla 11 el tratamiento B presentó los mejores resultados en cuanto al número de flores cosechadas; además este tratamiento mostró un intervalo de tiempo mas corto, para el desarrollo de la etapa vegetativa. En la tabla 11 se resume el éxito en la obtención de cultivos promisorios de Anthurium, los que tendrán una mayor totipotencia debido a las condiciones semiartificiales a las cuales se ha sometido. Se espera que aumente la probabilidad de propagación in vitro. Tabla 11. Composición de la solución nutriente (mmol/L) Tratamiento N: K: Ca A 1 : 1 : B 1 : 1 C 1 N-NO3 N-NH4 N Total - H2PO4 K Ca Mg 7.2 1.8 8.9 1.4 3.2 2.3 1.6 : 0.5 6.5 2.4 8.9 1.4 3.2 1.2 1.6 0.5 : 0.5 : 0.5 2.9 1.5 4.5 1.4 1.6 1.2 1.6 62 Cultivo in vitro Anthurium andreanum La etapa vegetativa es importante, pues es la única que se necesita desarrollar para la obtención de buenos explantes; es decir, se tendría tejido joven y en muy buenas condiciones de asepsia para dar origen a la línea de cultivo. Según los resultados de Dufour, (2005) esta primera etapa tarda alrededor de 6 meses, tiempo para el cual se deben tener preparadas las condiciones para la siembra de estos explantes. En la tabla 3 se encuentran los diferentes tipos de explantes que se han usado con anterioridad y a partir de ellos en la figura 25 se proponen varias rutas para la micropropagación de Anthurium. EXPLANTE A B Ápice radicular Caulogénesis* C Semillas maduras D Hoja joven Embrión zigótico Callos embriogénicos* Rizogénesis* Protoplastos* Embriones Zigóticos Embriones Somáticos* Plántulas Completas Figura 25. Esquema de posibles rutas in vitro a seguir para la obtención de plántulas completas de Anthurium andreanum (Dufour, 2005). La ruta A propuesta requiere del desarrollo de dos tipos de regulaciones diferentes (su introducción se enmarca con un asterisco) en el medio basal MS sobre los explantes de raíz. Imaginemos que la superficie del medio corresponde a una frontera horizontal o punto de partida del crecimiento. El asterisco (*) indica el cambio de medio de cultivo que es diferente a los cambios en la regulación. Considerando esto, el crecimiento se puede dar hacia fuera del medio, o sea, la caulogénesis o formación de tallo y hojas; o por el contrario, hacia dentro del medio formando raíces o mejor denominada rizogénesis. En este caso, y sobre todo para la obtención del sistema radicular de la plántula, pueda ser de mucha utilidad el empleo del medio Schenk and Hildebrandht, (1972) (SH) desarrollado para este fin. Su composición de macro y micronutrientes se encuentra especificada en el anexo 4. 63 Cultivo in vitro Anthurium andreanum Este medio de cultivo fue diseñado por Shenck y Hildebrandht en 1972 para el cultivo de raíces de dicotiledóneas. Aunque existe la posibilidad de desarrollar un buen sistema radicular en este medio dado que se usa con este propósito, hay que recordar que los Anthurium son monocotiledóneas y este medio esta destinado para el cultivo de dicotiledóneas. La ruta marcada como B, parece la más corta dado el número de pasos a seguir en el cultivo además de no modificar la regulación del crecimiento; sin embargo, es difícil predecir la facilidad con que se determinará la regulación perfecta para el crecimiento y desarrollo de los embriones zigóticos. La ruta C es tal vez la mas importante en el cultivo in vitro dada su propiedad. A diferencia de la embriogénesis zigótica (proveniente de células responsables de la reproducción), la embriogénesis somática se considera como la expresión totipotente de una célula somática (que nada tiene que ver con la reproducción) y se considera una habilidad valiosa de los tejidos vegetales, consistente en la desdiferenciación celular y expresión de la capacidad reproductora que se encuentra latente en toda célula vegetal. La ruta D es importante para la obtención de híbridos mediante la fusión de protoplastos y la inserción de material genético. Se debe tener en cuenta que la estabilidad genética es muy baja. Para su obtención se ha referenciado en la tabla 8 el empleo de 6 reguladores de crecimiento: BA, 2,4-D, kinetina, ANA, TDZ y timina. Al igual que la ruta A, la C requiere de dos cambios en la regulación del crecimiento, uno de ellos en la etapa de obtención de callos embriogénicos y la otra para el desarrollo de los embriones provenientes de la superficie de los callos. 64 Cultivo in vitro Anthurium andreanum CAPITULO VII. PROTOCOLOS DEL LABORATORIO. El formato es usado por el Grupo de Biotecnología Productos Naturales (GBPN) y puede ser aplicado para otros medios y soluciones stock (ver figura 26). El factor 1X indica la cantidad de medio a preparar (1 litro en este caso) que puede variar (0,5X para 500 mL, 0,1X para 100 mL, etc). Pesar todos los componentes sólidos permitidos por la precisión de la balanza ADICIONAR Masas resultado del factor volumen de medio (1X). Ver tabla MS Volúmenes equivalentes al factor volumen de medio (1X) Preparar la menor cantidad posible de soluciones stock para los demás componentes Recipiente volumétrico Matraz aforado de volumen de medio a preparar con una cuarta parte de su capacidad ocupada con Agua Destilada Desionizada Esteril (ADDE), Uno a uno los componentes sólidos seguido de pequeñas adiciones de agua luego las stock. AGITACION CONTINUA AJUSTAR pH (5.8) AFORAR con ADDE (1L) AGREGAR SOLIDIFICANTE CALENTAMIENTO ADICIONAR CARBON ACTIVADO (OPCIONAL) DISPENSAR EN LOS FRASCOS DE CULTIVO Figura 26. Preparación general de un litro de medio de cultivo (MS) (Niño., 2003). 65 Cultivo in vitro Anthurium andreanum PREPARACIÓN. MATRAZ DE 100 mL ADDE 60 mL ORDEN DE ADICION CON AGITACIÓN CONSTANTE NH4NO3 1650 mg KNO3 1900 mg CaCl2.2H2O 440 mg MgSO4.7H2O 370 mg DISOLUCIÓN COMPLETA KH2PO4 170 mg MIOINOSITOL 100 mg AFORAR CON ADDE A 100 mL Figura 27. STOCK 1: SOLUCION DE MACRONUTRIENTES MEDIO MS (1962) PREPARACIÓN. MATRAZ AFORADO 200 mL ADDE 120 mL ORDEN DE ADICION CON AGITACION CONSTANTE MnSO4.H2O 3379 mg ZnSO4.7H2O 1720 mg H3BO3 1240 mg KI 166 mg DISOLUCIÓN COMPLETA Na2MoO4.2H2O 50 mg CuSO4.5H2O 5 mg CoCl2.6H2O 5 mg AFORAR CON ADDE A 200 mL TOMAR 20 mL EN MATRAZ DE 200 mL Y AFORAR CON ADDE ALMACENAR A 5°C EN LA OSCURIDAD Figura 28. STOCK 2: SOLUCIÓN MICRONUTRIENTES MEDIO MS (1962) 66 Cultivo in vitro Anthurium andreanum MATRAZ 200 mL PREPARACIÓN. 120 mL de ADDE GLICINA 40 mg ORDEN DE ADICION CON AGITACIÓN CONSTANTE ACIDO NICOTÍNICO 10 mg PIRIDOXINA.HCL 10 mg TIAMINA.HCL 2 mg DISOLUCION COMPLETA AFORAR CON ADDE A 200 mL ALMACENAR A 5°C EN LA OSCURIDAD Figura 29. STOCK 3: SOLUCION VITAMINAS MS (1962) PREPARACIÓN. MATRAZ AFORADO 200 mL ADDE 120 mL ORDEN DE ADICION CON AGITACIÓN CONTINUA Na2EDTA 745 mg FeSO4.7H2O 557 mg MEZCLAR EN CALIENTE DISOLUCION COMPLETA AFORAR CON ADDE A 200 mL ALMACENAR A 5°C EN LA OSCURIDAD Figura 30. STOCK 4: SOLUCION DE Fe-EDTA MEDIO MS (1962) 67 Cultivo in vitro Anthurium andreanum CONCLUSIONES El cultivo in vitro de Anthurium andreanum es una estrategia viable para la producción y comercialización de especies comerciales. Asimismo, el estado del arte permite el establecimiento de un sistema de producción para el comercio colombiano de flores de Anthurium; una biofábrica para la explotación comercial de esta especie. La vistosidad y accesibilidad del Anthurium andreanum lo convierte en un protagonista en el cultivo in vitro de nuestro país. Las condiciones climáticas de la zona cafetera son óptimas para su cultivo, siendo común encontrarlas en esta zona templada. El aporte que se puede hacer al cultivo in vitro desde el punto de vista de la micropropagación de monocotiledóneas puede ser muy importante dado que han sido las dicotiledóneas las que tienen un estado del arte mas amplio. 68 Cultivo in vitro Anthurium andreanum PERSPECTIVAS El aporte que se puede hacer a la física desde el punto de vista de la termodinámica clásica (transferencia de masa y transformación de las diferentes formas de energía) tomando los medios de cultivo como modelos diferenciales para establecer las leyes de la conservación de la masa y la energía. En comparación con las orquídeas que son la familia de mayor comercio en el mundo, las flores de corte de Anthurium las superan en cuanto a tiempo de vida proyectándolas como material vegetal valioso para el comercio internacional. El presente trabajo puede contribuir comercio regional y a los pequeños cultivos o simplemente para variar la ingresos adicionales; además permite mejorar las variedades existentes. de una manera muy importante al productores para que puedan rotar reducción como una alternativa para proveerles material vegetal valioso y Además dados los requerimientos de bioseguridad durante los intercambios comerciales hacen necesario el control biológico que permite el cultivo in vitro. 69 Cultivo in vitro Anthurium andreanum BIBLIOGRAFIA 1. Adelheid, R K; Fure-Chyi Chen; Nellie Sugii (1992). Somatic embryogenesis and plant regeneration in Anthurium andraeanum hybrids. Plant Cell Reports. 11: 438442. 2. Alencar, V; Alencar, N; Assreuy, A; Mota, M; Brito, G; Aragao, K; Flavio B; Pinto, V; Debray, H; Ribeiro, R; Cavada, V. (2005) Pro-imflammatory effect of Arum maculatum lectin and role of resident cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 37: 1805-1814. 3. 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Sus raíces contienen ingredientes activos que poseen propiedades insecticidas, antifúngicas, antibacteriales y alelopáticas. Las Lectinas. Su aplicación más importante tiene que ver con las investigaciones en cáncer. Miembro mejor conocido y más toxico de esta familia. Se caracteriza por la presencia de numerosas e inusuales Sauromatum venosum Arisaema helleborifolium Schott Dieffenbachia picta Schott Acorus calamus L. Usada en tratamiento de la vejez por su fuerte acción fortificante. Usado para curar dolores e hinchazón de heridas traumáticas. Homalomena occulta (Lour.) Schott Se reportó actividad anti-inflamatoria de extractos metanólicos de hoja. Culcasia scandens Beauv P. Importancia Araceae Producción edema en la concentración aplicada. Se reporta como acción contrarrestante de síntomas de ingestión, la inyección de adrenalina intravenosa. El suministro de eugenol Las lectinas son producto del metabolismo primario, sus genes son buenos candidatos para conferir resistencia a los insectos en alimentos transgénicos. Estos compuestos también fueron aislados de las raíces. Aceite vegetal se caracteriza por presencia de mono, sesqui y triterpenos hidrocarbonados oxigenados, algunos propenilbencenos. Se identificaron diploides y triploides. Las lectinas se reportan como un potente mitogénico y antiproliferativo. Identificación diferentes núcleos activos. Entre ellos se encuentra la saponina Henderagenina; no se reporta en otros géneros de Aráceas. Identificación del sitosterol como núcleo activo. Resultados ANEXO 1. PROPIEDADES MEDICINALES IMPORTANTES DE LA FAMILIA ARACEAE Cultivo in vitro Anthurium andreanum Castro, (2004) 76 Kaur et al., (2006) Bertea et al., (2005) Bains et al., (2005) Elbandy et al., (2004) Okoli, (2004) Referencia Altamente toxica Tratamiento para la mordedura de serpientes y antidiarreico Componentes de las infusiones en la medicina tradicional China Arisarum vulgare Dracontium loretence K. Krause. ( Pinellia ternata (Thumb) Breit antieméticos, contra la tos, con acción sedante y antiinflamatorios el cerebrosido aislado muestra ser antiulcerogénico, hepaprotectivo e inhibidor enzimático (xantina oxidasa), pero no es descrito como antimicrobiano Fueron examinados los órganos encontrando en los tubérculos los agentes responsables de los usos etnomedicinales Responsable del envenenamiento humano y animal en Marruecos Las lectinas activan células del sistema inmune. Divergen en sus actividades biológicas in vitro e in vivo. Dependiendo de la ruta de administración, ejercen acciones activantes pro o antiinflamatorias; o inhibición de migración de neutrófilos por medio de interacción entre el dominio de las lectinas exógenos con los residuos de carbohidrato presentes en las membranas celulares inflamatorias. Las lectinas están ampliamente distribuidas en la naturaleza (los 3 reinos) sirviendo como mediador en una variedad de eventos con reconocimiento biológico. Arum maculatum Entre los compuestos identificados se encuentra el 13feniltridecanoato de metilo Prolonga la vida de los pacientes con cáncer cuando es consumido como jugo fresco o en polvo seco, en ambos casos; solo o con hierbas medicinales Typhonium flagelliforme Los extractos metanólicos de hojas y cortezas son responsables directos de la actividad mostrada. En ellas se encuentra el núcleo activo Actividad antibiótica muestra un porcentaje de inhibición edema entre 95-100% de los casos. Syngonium podophyllum células (los idioblastos) Cultivo in vitro Anthurium andreanum 77 (Chen et al., 2003). Kloucek et al., 2005). Lamkadem et ak., (2003) Alencar et al., (2005) Choo et al., (2005) Camporece et al., (2003); Franke et al., (2005) Cultivo in vitro Anthurium andreanum Anexo de Cultivo SH (1972) Anexo 4. 2. Medio ASPECTOS BOTÁNICOS DE LA FAMILIA ARACEAE Araceae Subfamilia Orontioideae 101 especies de 70 géneros; 83 géneros y 221 especies Zantedeschia aethiopica Varios géneros de la subfamilia Aroideas Importancia Symplocarpus y Lysichiton son excelente ejemplos de los géneros comunes entre el Viejo y el Nuevo mundo. Taxonómica, Evolutiva y Biológica. Fisiología de la espata. Relaciones filogenéticas. Resultados Resultados biogeográficos sugieren migraciones independientes a través del estrecho de Bering en la era terciaria (Plioceno/Mioceno). Posibilidades de clasificación morfológica mediante la observación de la distribución sistemática de los caracteres del polen. Este proceso de rompimiento del H2O2, genera dos radicales libres del * tipo OH , uno de los responsables de la senescencia de la espata. Más de la mitad de los géneros en la subfamilia contienen ácidos ωfenilalcaniocos y ω-fenilalquenoicos en los lípidos de sus semillas Referencia Nie et al., (2006) Hesse, (2006) Lino-Neto et al., (2004) Meija, (2004) Anexo 3. Medio de cultivo MS (1962) Compuesto Nitrato de Amonio Nitrato de Potasio Sulfato de Magnesio Sulfato de Manganeso Sulfato de Zinc Sulfato Cúprico Cloruro de Calcio Yoduro de Potasio Cloruro de Cobalto Fosfato de Potasio Acido Bórico Molibdato de Sodio Sulfato Ferroso Acido Etilendiaminotetracetico (EDTA) Mio-inositol Glicina Acido Nicotínico Piridoxina-HCl Tiamina-HCl Concentración (mg/L) 1650 1900 370 16.89 8.6 0.025 440 0.83 0.025 170 6.2 0.25 27.81 37.81 100 2.0 0.5 0.5 0.1 78 Cultivo in vitro Anthurium andreanum Compuesto Nitrato de Potasio Sulfato de Manganeso Sulfato de Magnesio Sulfato de Zinc Acido Bórico Sulfato de Cobre Yoduro de Potasio Molibdato de Sodio Cloruro de Cobalto Fosfato de Amonio Etilendiaminotetracetato de Sodio (Na-EDTA) Sulfato Ferroso Cloruro de Calcio Niacina Piridoxina-HCl Tiamina-HCl Mio-inositol Concentración (mg/L) 2500 o superior 13.2 400 o superior 1.0 5.0 0.3125 1.0 0.1 0.1 300 20 15 200 o inferior 5.0 0.5 5.0 1000 Anexo 5. Medio de cultivo NN (1956). - NO3 H2PO4 SO4 Cl + K + Na 2+ Mg 2+ Ca + NH4 N Total Macronutrientes en meq/L 19.8 1.81 2.04 20.47 39.93 1.81 2.04 0.34 --------------------19.8 Anexo 6. Medios nutritivos usados en Spirodela polyrhiza. (Appenroth, 2003) Componente A (mmol/L) B (mmol/L) 1. NO310.0 3.30 2. K+ 8.06 3.60 3. SO421.00 0.68 4. Ca2+ 1.00 0.85 5. Mg2+ 1.00 0.68 6. H2PO4 0.06 0.34 7. Fe3+ *2.80 25.0 8. Cl26.0 6.80 9. Mn2+ 13.0 3.40 10. BO35.00 15.4 11. Zn2+ 0.00 0.23 pH 5.8 5.2 Medios empleados en el cultivo de especies acuáticas de la familia. Medio A: medio Lemnaceae. Medio B: Hoagland (0.3X ) (*) tartrato. 79 Cultivo in vitro Anthurium andreanum Anexo 7. Medio para la inducción de yemas de Anthurium desde explantes de raíz por Chen et al., (1997) 1 2 Componentes ½ Macronutrientes MS Micronutrientes MS 3 4 5 6 7 8 9 Vitaminas MS Tiamina.HCl NaFeEDTA Mioinositol Sacarosa BA Gelrite Concentración Ver medio MS Ver medio MS Ver medio MS 0.4 ppm 25 ppm 100 ppm 2% 0.8 ppm 0.18% Anexo 8. Coloraciones presentadas por las diferentes variedades de Anthurium andreanum en cultivos Holandeses (Reinert, 1977) # 1 2 3 4 5 Coloración presentada por la espata Rojos Naranjas Rosados Blancos Bicolores Variedad Tropical, Avoclaudia, Avonette y Avanti Casino Rosados: Lunette, Avoanneke, Limbo, Scorpion Acrópolis, Fantasia, Cuba, Merengue Uranus, Paradise, Champion. Anexo 9. COMPONENTES SOLUCION MICRONUTRIENTES MS (mg/ 200mL) SULFATO DE MANGANESO SULFATO DE ZINC ACIDO BORICO YODURO DE POTASIO MOLIBDATO DE SODIO SULFATO CUPRICO CLORURO DE COBALTO 3379 1720 1240 166 50 5 5 Anexo 10. COMPONENTES SOLUCION DE VITAMINAS MS (mg/200mL) GLICINA ACIDO NICOTÍNICO PIRIDOXINA.HCl TIAMINA.HCl 40 10 10 2 Anexo 11. COMPONENTES SOLUCION DE Fe-EDTA MS (mg/200mL) ETILENDIAMINOTETRACETATO DISODICO SULFATO FERROSO 745 557 80 Cultivo in vitro Anthurium andreanum ANEXO 12. MATERIALES Se tiene a disposición para la realización de este proyecto las instalaciones del Laboratorio del GBPN y es el mismo centro el que proporcionará los siguientes materiales necesarios para el mismo: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. Balanza analítica con presición de +/- 0.001g pH-metro Agitador magnético con plancha de calentamiento Microscopio (estudios histológicos) o esteroscopio Autoclave (esterilización material limpio y sucio) Micropipetas (20,50,200 y 1000 µl) Dispensador para medios de cultivo (opcional) Cajas de petri (microcirugía en cabina, obtención de callos friables) Recipientes varios con boca ancha Matraces aforados de 10, 25, 50, 100, 200, 500 y 1000 mL (preparación de soluciones) Beakers 40, 100, 200, 500 y 1000 mL. (preparación de soluciones) Vidrio reloj (pesaje de reactivos) Embudos de vidrio (preparación de soluciones) Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL (medición de soluciones stock) Pipetas volumétricas de 1, 2, 5, 10, 20, 50 y 100 mL (preparación de soluciones) Buretas (preparación de soluciones, ajuste de pH) Escalpelos y cuchillas de acero inoxidable para los mismos (microcirugía, siembra y repique). Pinzas de acero inoxidable de diferentes tamaños (repique y siembra de tejidos) Mecheros de alcohol (siembra y subcultivos) Papel aluminio (usado como tapa de recipientes con medios de cultivo) Papel kraft (procedimientos en cabina y esterilización de materiales) Frascos ámbar para almacenamiento de soluciones stock y reactivo0s Frascos varios para almacenar soluciones Cinta indicadora de contaminación microbiana (opcional). Cinta de papel Vitafilm, cristal flex ó vinilpec para tapar medios de cultivo. Cabina de flujo laminar Guantes de latex o nitrilo Gorros Tapabocas Cepillos (lavado y desinfección de tejidos) Papel adsorbente (limpieza y desinfección de superficies) 81 Cultivo in vitro Anthurium andreanum ANEXO 13. REACTIVOS Reactivos necesarios para el desarrollo de la investigación en el laboratorio de cultivo de tejidos vegetales de BPN: 1. Etanol concentrado (para esterilización) 2. Hipoclorito de Sodio al 5% (para esterilización) 3. Hipoclorito de Calcio 4. Cloruro de Mercurio II 5. Agua de Bromo 6. Nitrato de Plata 7. Peroxido de Hidrógeno 8. Jabón comercial (lavado de material) 9. Tween 20 (lavado de explantes) 10. Jabodine (lavado de explantes) 11. Teelpol (lavado de explantes) 12. Agua Destilada Desionizada Estéril (para fines varios) 13. Agar 14. Sacarosa 15. Auxinas: • Acido Naftalenacetico (ANA) • 2,4-diclorofenoxiacetico (2,4-D) 16. Citoquininas • Kinetina • 6-bencilaminopurina (benciladenina BA) • Thidiazuron (TDZ) 17. Giberalinas • AG3 18. Vitaminas • Piridoxina • Mio-inositol • Tiamina (Vitamina B1) • Niacina (Acido nicotínico) • Glicina 19. • • • • • • • • • • • • • • • Sales inorgánicas: Sulfato de Magnesio Sulfato de Zinc Sulfato de Manganeso Sulfato Cúprico Sulfato Ferroso Sulfato Férrico Nitrato de Potasio Cloruro de Calcio Cloruro de Cobalto Fosfato de Potasio Fosfato Monosódico Fosfato de Amonio Ioduro de Potasio Acido Bórico Etilendiaminotatracetato disódico (Fe-EDTA) • Molibdato de Sodio 20. Fungicidas del Imidazol • Imidazil • Prochloraz • Trifumizole • Triazole • Paclobutrazol • Imidazil 21. Cepas Agrobacterium • LBA 4404 22. Ácidos y Bases para ajustar pH • HCl 0.1 N • NaOH 0.1 N • Acido Cítrico • Acido Ascórbico 82
