“Importancia del metabolismo de colina en Pseudomonas syringae

“Importancia del metabolismo de colina en Pseudomonas syringae pv.
coronafaciens S5”
Ruffinatto, L.A., Lisa, A.T., Garrido, M.N. Dpto. de Biología Molecular, Facultad de Cs Exactas, Fco-Qcas
y Naturales, Universidad Nacional de Río Cuarto. Ruta 36 Km 601 (5800) Río Cuarto, Cba. Argentina
Colina es un compuesto de amonio cuaternario ubicuo en la naturaleza. En el
hombre se encuentra como tal en el tracto urinario, como dipalmitoilfosfatidilcolina en la
sustancia surfactante del pulmón y como acetilcolina en el epitelio corneal. En nuestro
laboratorio demostramos que Pseudomonas aeruginosa crecida en presencia de los
compuestos de amonio cuaternario o terciario colina, betaína, dimetilglicina o carnitina,
inducen conjuntamente las enzimas fosfolipasa C hemolítica (PLC-H), fosforilcolina
fosfatasa (PChP) y acetilcolinesterasa (AChE), junto a un transporte con sistemas de alta y
baja afinidad por colina, además de poseer un sistema constitutivo de transporte de colina.
Ello nos condujo a proponer que colina debía ser considerada como un factor que
favorecía la patogenicidad de P. aeruginosa y que las proteínas mencionadas, AChE, PLC
y PChP estaban involucradas en la misma. Así, sugerimos que las actividades enzimáticas,
actuando coordinadamente en la secuencia AChE, PLC, PChP, participaban en el
mecanismo de infección del epitelio corneal y que la infección pulmonar ocurría a través
de la acción de la PLC sobre la sustancia surfactante del pulmón para producir
fosforilcolina (PC) que es el sustrato fisiológico de la PChP. La importancia que tendría
PChP en la patogenicidad de P. aeruginosa nos condujo a la búsqueda e identificación del
gen correspondiente en el genoma secuenciado de P. aeruginosa PAO1, demostrándose
que la proteína PA5292 es el producto de dicho gen. De esta manera, quedó establecido
que colina debe considerarse un factor que favorece la patogenicidad de P. aeruginosa
tanto en condiciones de iso como de hiperosmolaridad, a través del mecanismo de
obtención de nutrientes propuesto. Se sugirió además la importancia del estudio del
metabolismo de colina para mantener la colonización en otros ambientes por parte de otras
especies del género.
Posteriormente en nuestro laboratorio se aisló e identificó la cepa fitopatógena
Pseudomonas syringae pv. coronafaciens S5, a partir de hojas de avena (Avena sativa
cultivar Cristal INTA) provenientes de la zona rural de Suco. El estudio de los factores de
patogenicidad y virulencia del microorganismo demostró que produce sideróforos, levansacarasa, lipasas, proteasas, lecitinasa, actividad nucleadora de hielo y tabtoxina. La
tabtoxina es un β-lactámico monocíclico cuya estructura es un dipéptido que contiene
tabtoxinina-β-lactámica (TβL) unida a treonina. La molécula segregada por la bacteria es
inactiva pero luego de la hidrólisis de la unión peptídica por aminopeptidasas de origen
vegetal o bacteriano es convertida en un componente bioactivo que inhibe
irreversiblemente la glutamina sintetasa en bacterias, plantas y hongos.
Se sabe que la producción de Tabtoxina esta influenciada por la fuente de carbono
y/o nitrógeno utilizada por la bacteria durante su crecimiento. Un factor muy importante
para el desarrollo de los microorganismos epífitos en la superficie de las hojas, es la
disponibilidad de fuentes de carbono, siendo la sacarosa el principal azúcar presente. En
cuanto a fuentes de nitrógeno accesible, diferentes estudios mencionan compuestos como
el amonio y diferentes aminoácidos. La existencia de colina en tejidos vegetales, además
de ser parte componente de fosfolípidos, se ha demostrado en exudados de raíces y como
fosforilcolina en apoplastos. Se conoce también como un metabolito clave para la
producción del osmolito protector betaína. Estudios preliminares realizados en nuestro
laboratorio con P. syringae S5 indicaron que, cuando creció con sorbitol como fuente de
carbono y colina como fuente de nitrógeno, la producción de tabtoxina y la actividad
PChP se vieron favorecidas, lo que indicaría la intervención de colina en el metabolismo
del fósforo y el nitrógeno en esta bacteria.
En este trabajo se investigó la influencia de colina y sus metabolitos como fuente de
nitrógeno en la producción de tabtoxina y en la inducción de la actividad PChP en P.
sryringae S5. Para el crecimiento del microorganismo y estimulación de la producción de
toxina se utilizó un medio mineral mínimo con sacarosa como fuente de carbono y las
diferentes fuentes de nitrógeno a estudiar. Se tomaron como control bacterias crecidas en
presencia de sacarosa y NH4Cl. Los cultivos líquidos se mantuvieron en agitación a 30 ºC,
a 110 rpm, hasta fase estacionaria. Para la realización de las curvas de crecimiento se
utilizó un inóculo de modo que tuvieran una DO660 inicial de alrededor de 0,1, y se
extrajeron muestras periódicas de los cultivos. La producción de tabtoxina se determinó
por un ensayo de difusión en agar usando E. coli como microorganismo indicador y el
sobrenadante de cultivo como fuente de tabtoxina. A las 16 horas de incubación se
midieron los halos de inhibición obtenidos y se calculó la actividad toxigénica (A.T.,
diámetro del halo en cm/DO del cultivo). Los controles negativos se realizaron en
presencia de glutamina agregada al sobrenadante. La actividad PChP se midió en forma
indirecta, con el sustrato artificial p-nitrofenil fosfato con y sin fosforilcolina como
inhibidor de manera de descartar la presencia de fosfatasas inespecíficas.
Tanto colina como algunos de sus metabolitos demostraron ser muy buena fuente de
nitrógeno ya que los tiempos de generación obtenidos fueron muy similares al de la fuente
preferencial (NH4Cl). Los datos de Actividad Toxigénica (A.T.) se muestran en la
siguiente tabla:
A.T. (halo en cm/DO660 del cultivo)
Fuente de N:
NH4Cl
Colina
Betaína
Dimetilglicina
1,19 ± 0,18 (n = 6)
2,20 ± 0,50 (n = 7)
1,54 ± 0,20 (n = 6)
1,43 ± 0,10 (n = 6)
Estos datos se obtuvieron con 40 µl de sobrenadante de cultivo, y también se
encontraron relaciones similares con 75 µl del mismo. En todos los casos existe diferencia
significativa con el control (p > 0.01). Estos datos evidenciaron la capacidad de colina, y
en menor grado sus metabolitos derivados, de inducir una mayor producción de tabtoxina.
En las células obtenidas de cada cultivo se ensayó la actividad fosforilcolina fosfatasa
(PChP), y se encontró una inducción provocada por cada metabolito en relación
decreciente de colina a dimetilglicina, tal como ha sido anteriormente demostrado en P.
aeruginosa:
Actividad PChP (% del control sacarosa/NH4Cl ± D.E.)
Colina
305 ± 44.5
Betaína
205 ± 113
Dimegli
247 ± 95
Para corroborar la especificidad de la influencia de colina sobre la producción de
tabtoxina, se utilizaron otros compuestos como fuentes de nitrógeno. Se comprobó que
glicina, alanina y serina sólo produjeron actividades toxigénicas iguales o menores a las
obtenidas con NH4Cl. Así, los datos obtenidos hasta el momento permiten sugerir que
colina participaría en la patogenicidad de P. syringae favoreciendo la producción de
tabtoxina, cuya actividad inhibe irreversiblemente a la glutamina sintetasa de la planta,
provocando el síntoma de clorosis. Datos bibliográficos actuales indican la presencia de
colina y fosforilcolina en el apoplasto, sitio de colonización de esta bacteria. Esta
circunstancia haría muy factible la inducción de una enzima con actividad PChP, que le
brindaría a la bacteria una fuente de fósforo y nitrógeno, y sería altamente beneficioso
para la supervivencia del patógeno.