V - Simfit

Caso 305 : Cinética de inhibición de una enzima
1
Caso 305 : Estudio de la cinética de inhibición de una
enzima. (Regresión no lineal con pesos estadísticos) (F.J. Burguillo, USAL)
CASO PRÁCTICO (APARTADO 1): ESTUDIO V-[INHIBIDOR] A [SUSTRATO] FIJA
El primer paso en el estudio cinético de un inhibidor es caracterizar el comportamiento
velocidad-[Inhibidor], es decir encontrar su ecuación de velocidad v([I]) a concentración de
sustrato fija. Para practicar sobre este aspecto imaginemos la hidrólisis del p-nitrofenil fosfato por
una fosfatasa, y que esta hidrólisis es inhibida por el fosfato inorgánico.
Imaginemos que se ha medido la velocidad inicial de reacción en condiciones óptimas, a
una concentración de sustrato fija y 8 concentraciones diferentes de inhibidor (entre 0.5 y 10 mM)
espaciadas logarítmicamente. Esta vez no haremos réplicas por simplificar y porque no
pretendemos estimar parámetros cinéticos sino sólo caracterizar el comportamiento frente al
inhibidor. Los resultados obtenidos fueron los siguientes:
[I] (mM)
v (µmol min-1 mg-1)
si
0.500
3.922
1
0.767
3.516
1
1.177
3.035
1
1.805
2.509
1
2.770
1.982
1
4.279
1.489
1
6.518
1.090
1
10.000
0.769
1
El objetivo de este apartado será encontrar la ecuación v-[I] que mejor se ajuste a los
datos. Hay dos grandes posibilidades:
a) Que se trate de una inhibición de tipo completa:
V=
A(0)
1 + B(1)[I]
[1]
(es decir
VG0
cuando [I]
G’)
(asĺntota)
cuando[I]
b) Que se trate de una inhibición de tipo parcial:
V=
A(0) + A(1)[I]
1 + B(1)[I]
[2]
(es decir
VG
A(1)
B(1)
G ’)
PROCEDIMIENTO PASO A PASO
1.- ARCHIVO DE DATOS
• No hace falta teclear los datos, ya que existe un archivo preparado al efecto con el nombre
caso305a.dat .
2
Caso 305 : Cinética de inhibición de una enzima
2.- AJUSTE DE LAS ECUACIONES A LOS DATOS
•
Vamos a realizar el ajuste utilizando la siguiente función racional genérica:
A(0) + A(1)[I] + A(2)[I] 2 + .... A(n)[I] n
V=
1 + B(1)[I] + B(2)[I] 2 + .... B(n)[I] n
[3]
Vamos a empezar ajustando una ecuación de orden uno con términos A(0) y A(n) (que es
el modelo de inhibición parcial de la ecuación [2]). El propio ajuste nos dará un valor de
cero para A(n), indicando así que la ecuación correcta es la [2] (inhibición completa), sin
necesidad de realizar este segundo ajuste a la ecuación [2].
•
Los pasos a seguir serían:
1) En la barra de opciones del menú principal despliegue la opción “Ajustes” y dentro de
ella seleccione “Funciones racionales positivas de grado n:n (rffit)” .
2) Elija la opción “Ejecutar”.
3) Seleccione o escriba la fila “c:\curso\caso305a.dat”, y pulse el boton “Abrir”.
4) “¿Usar este archivo?, contestaremos “Sí”.
5) “¿Incluye el término A(0) en el modelo (normalmente no)?”, contestaremos “Sí”.
6) “¿Incluye el término A(n) en el modelo?”, contestaremos “Sí”.
7) “¿Orden más bajo para el modelo?”, contestaremos “1” (grado 1:1 (ecuación de la
forma: (A(0)+A(1)[I])/(1+B(1)[I])).
8) “¿Orden más alto para el modelo?”, contestaremos “1” (misma ecuación)
9) Para las estimas iniciales elijamos la opción “Búsqueda al azar extensiva”.
10) En el siguiente menú de selección simultánea dejaremos activadas las opciones por
defecto y la opción “Usar gradiente Analítico/Alta precisión”, luego pulsaremos “OK”.
11) A continuación apareceran los resultados de los ajustes, para ir avanzando basta con ir
pulsando sucesivamente “OK” y si se trata de gráficas basta con ir pulsando
sucesivamente “Cancelar”. Cuando hayamos terminado del todo pulsaremos “Salir” para
salir al menú principal.
SOLUCIONES:
Los valores de los parámetros del ajuste son:
La bondad del ajuste es:
Caso 305 : Cinética de inhibición de una enzima
3
La representación gráfica es:
Datos y curva ajustada
-1
-1
velocidad / µmol min mgE
4.00
3.00
2.00
1.00
0.00
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
[ I ] / mM
La inhibición es, pues, de tipo “Completa”.
CASO PRÁCTICO (APARTADO 2): ESTUDIO V-[SUSTRATO] A DIFERENTES [INHIBIDOR]
4
Caso 305 : Cinética de inhibición de una enzima
En el apartado anterior hemos caracterizado que la inhibición de nuestra fosfatasa por el
fosfato es de tipo completa, nuestro siguiente objetivo debiera ser profundizar en el análisis de
esta inhibición, realizando para ello un estudio clásico velocidad-[sustrato] a diferentes
concentraciones de inhibidor. Este tipo de estudios permite decidir si el inhibidor presenta
comportamiento michaeliano o no, si El inhibidor afecta a la Vmax, a la Km, al cociente
Vmax/Km...etc. Todo ello sirve para proponer algún mecanimso de reacción para la inhibición:
competitiva, no competitiva, mezclada, así como para determinar los respectivos parámetros
cinéticos que caracterizan al inhibidor (Ki, Kii...)
El diseño experimental sería ahora el siguiente: las concentraciones de sustrato elegidas
fueron 6, espaciadas logarítmicamente entre 0.1 y 1.4 mM y las medidas de velocidad se hicieron
a cuatro concentraciones de inhibidor: 0, 1, 2, y 3 mM. No se hicieron réplicas para poder hacer el
estudio en una sóla jornada, por lo que el total de datos fue de 24, que son los siguientes:
[I]= 0 mM
[S]
mM
0.100
0.169
0.287
0.487
0.825
1.40
[I]= 1 mM
V
mol/ min
mgE
0.908
1.483
2.2532
3.306
4.477
5.823
[I]= 2 mM
[S]
mM
0.100
0.169
0.287
0.487
0.825
1.46
[S]
mM
0.100
0.169
0.287
0.487
0.825
1.40
V
mol/ min
mgE
0.736
1.100
1.638
2.305
2.844
3.396
[I]= 3 mM
V
mol/ min
mgE
0.569
0.904
1.285
1.720
2.114
2.524
[S]
mM
0.1
0.169
0.287
0.487
0.825
1.4
V
mol/ min
mgE
0.489
0.731
1.042
1.358
1.712
1.887
PROCEDIMIENTO PASO A PASO
1.- ARCHIVOS DE DATOS
• No hace falta teclear los datos, ya que existen unos archivos preparados al efecto, cuyos
nombres se irán mencionando cuando sean necesarios.
2.- VISUALIZACIÓN DE LOS DATOS
Caso 305 : Cinética de inhibición de una enzima
5
• Primero vamos a representar gráficamente los datos en diferentes espacios (directo y doble
inverso que son los habituales en los estudios de inhibición):
1) En la barra de opciones del menú principal despliegue la opción “Gráfica” y dentro de
ella seleccione “Gráficas interactivas (simplot )” .
2) Elija la opción “Ejecutar”.
3) Seleccione ahora “Gráficas avanzadas: ejes normales x-y”.
4) En el siguiente menú aparece seleccione “Introducir archivos individuales”.
3) Seleccione o escriba la fila “c:\curso\caso305b1.dat”, y pulse el boton “OK”.
4) ¿Quiere importar otro archivo de datos para representarlo?, contestaremos “SÍ”.
5) Seleccione o escriba la fila “c:\curso\caso305b2.dat”, y pulse el boton “OK”.
6) Y así sucesivamente para abrir los archivos “c:\curso\caso305b3.dat” y
“c:\curso\caso305b4.dat”, contestando al final a la pregunta ¿Quiere importar otro
archivo de datos para representarlo?, con “No”.
7) Seguidamente apareceran los datos en pantalla en el espacio directo (v-[S]) a las
diferentes concentraciones de inhibidor. Observemos esta representación.
8) Pulse el botón “Transformar” y seleccione el representar los datos bajo la
transformación doble inversa (Lineweaver Burk).
7) Observando estas representaciones trate de aventurar alguna respuesta para las
preguntas habituales en este tipo de estudios (¿La Vmax, Km, el cociente Vmax/Km se ven
afectados por la concentración de inhibidor?, ¿Cuál sería el mecanismo de inhibición más
plausible entre los habituales?). Las representaciones son las siguientes:
-1
-1
velocidad / µmol min mgE
6.00
[ I ] = 0 mM
[ I ] = 1 mM
[ I ] = 2 mM
[ I ] = 3 mM
4.00
2.00
0.00
0.00
0.40
0.80
[Sustrato] / mM
1.20
1.60
Caso 305 : Cinética de inhibición de una enzima
3.00
[ I ] = 0 mM
[ I ] = 1 mM
[ I ] = 2 mM
2.00
[ I ] = 3 mM
1/v
6
1.00
0.00
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
1/[S]
a) El comportamiento cinético parece Michaeliano.
Vmax sí que varía al
variar la concentración del inhibidor.
c) Se puede descartar la inhibición acompetitiva por que las rectas no son paralelas
en la representación doble inversa y por tanto el cociente Vmax/Km también varía
con la concentración de inhibidor.
d) Más dificil es distinguir entre inhibición no competitiva (Varía la Vmax pero no la
Km con la contración de inhibidor) y la inhibición mezclada (Varía todo: tanto la
Vmax, como la Km, como el cociente Vmax/Km). De esto nos ocuparemos a
continuación.
• Aboradaremos ahora estas especulaciones de una forma cuantitativa mediante ajustes por
regresión no lineal sin pesos estadísticos (no disponemos de desviaciones estándar (si)
procedentes de réplicas, por otra parte las variaciones de V no superan un orden de
magnitud, por lo que podríamos suponer que estas desviaciones estándar son constantes).
Supondremos que si=1 a efectos de cálculo, ya que este valor en si mismo es irrelevante a
la hora del ajuste y proporciona unos pesos sencillos (w i = 1/s 2i = 1/1 2 = 1).
Estos ajustes se podrían hacer mediante dos procedimientos:
a) Uno clásico, consistente en ajustar cada una de las cuatro series ( [I] fija en cada
una de ellas y variando la [S] ) a la ecuación de Michaelis-Menten (función sólo de la
ap
ap
variable [S]. Interpretándose a continuación los valores V max y K m que se obtengan.
b) Otro más avanzado, que consistiría en ajustar directamente la matriz con todos los
datos (los 24 puntos), a las respectivas ecuaciones de inhibición (no competitiva y
mezclada), con lo cual se trataría de un ajuste a funciones de dos variables ([S] y [I]).
Después habría que discriminar entre los modelos según la bondad de los ajustes.
Caso 305 : Cinética de inhibición de una enzima
7
3.- PROCEDIMIENTO CLÁSICO
• Ajustemos la ecuación de Michaelis-Menten a los datos:
1) En la barra de opciones del menú principal despliegue la opción “Ajustes” y dentro de
ella seleccione “Suma de 1 a n ecuaciones de Michaelis-Menten (mmfit)” .
2) Elija la opción “Uso normal”.
3) Seleccione o escriba la fila “c:\curso\caso305b1.dat”, y pulse el boton “OK”.
4) ¿Usar este archivo?, contestaremos “Sí”.
6) ¿Orden más bajo del modelo a ajustar?, contestaremos “1” (ecuación de
Michaelis-Menten)).
7) ¿Orden más alto del modelo a ajustar?, contestaremos “1” (ecuación de
Michaelis-Menten)).
8) Para las estimas iniciales elijamos la opción “Búsqueda al azar corta”.
9) En el siguiente menú de multiselección dejaremos sólo las opciones por defecto,
finalmente pulsar “OK”.
10) Seguidamente apareceran los resultados de los ajustes. Para ir avanzando basta con ir
pulsando sucesivamente “OK” y si se trata de gráficas basta con ir pulsando “Cancelar”.
Anótense los valores obtenidos para los parámetros Vmax y Km.
• Cuando hayamos terminado del todo con esta primera serie de datos aparecerá un menú
de opciones de la que elegiremos “Ajustar unos nuevos datos”. A continuación
repetiremos el mismo procedimiento de ajuste con las otras series de datos que estan en
“c:\curso\caso305b3.dat” y “c:\curso\
las archivos “c:\curso\caso305b2.dat”,
caso305b4.dat”, anotando en cada caso los respectivos valores de Vmax y Km que se
obtengan.
• La tabla recopilatoria para los parámetros aparentes de Vmax y Km sería la siguiente:
[I]
mM
0
1
2
3
Vmaxap
Kmap
Vmaxap/Kmap
9.81
4.70
3.35
2.45
0.966
0.521
0.467
0.390
10.15
8.83
7.17
6.29
• A partir de estos datos, se puede deducir que la inhibición ha de ser del tipo mezclada
(con dos constantes de inhibidor diferentes (Ki y Kii)) más que no competitiva (Ki y Kii
iguales), ya que tanto la Vmax, como la Km, como el cociente Vmax/Km varían con la
concentración de inhibidor. Las respectivas constantes Ki y Kii se podrían obtener
algebráicamente a partir de los parámetros obtenidos arriba, sabiendo que para la
inhibición mezclada se cumple que:
[I]
ap
+
1
V max
Ki
V max V max /K M
ap
ap
V max =
; KM = KM
;
ap =
[I]
[I]
[I]
K
M
(1 + K i )
1 + K ii
1 + K ii
Y los resultados que se obtendrían serían los siguientes (calcúlelos):
Ki =
Kii =
8
Caso 305 : Cinética de inhibición de una enzima
• Si se van guardando en archivos las sucesivas curvas de ajuste para las cuatro series de
datos, se podría hacer la siguiente gráfica global con todos los datos y sus
correspondientes curvas ajustadas (bastaría con entrar por la opción “Gráfica” e ir abriendo
sucesivamente cada archivo de datos y su ajuste respectivo (es decir 8 archivos en total)):
Ejes originales
V / µmol min-1 mgE-1
6.00
4.00
2.00
0.00
0.00
0.40
0.80
1.20
1.60
[Sustrato] / mM
Gráfica Lineweaver-Burk
2.50
1/V
1.50
0.50
-4.0
0.0
4.0
8.0
-0.50
¡ Inhibición Mezclada !
y
1/[S]
En resumen la inhibición sería: “Inhibición completa de tipo mezclado”
12.0
Caso 305 : Cinética de inhibición de una enzima
9
4. PROCEDIMIENTO AVANZADO
En el apartado de “Visualización de datos”, la representación doble inversa descartaba
claramente la inhibición competitiva (las rectas no se cortaban sobre un mismo punto en el eje de
ordenadas), también descartaba la inhibición acompetitiva (las rectas no eran paralelas entre si).
Solamente cabría dudar entre la inhibición no competitiva (misma Ki) y la inhibición mezclada (con
dos constantes de inhibidor: Ki y Kii ). Para distinguir entre estas dos posibilidades vamos a ajustar
la matriz de datos completa (24 puntos que están en el archivo caso305c.dat) a las dos
ecuaciones correpondientes (que son funciones de las dos variables [S] y [I] ). Discriminando
finalmente entre los dos modelos de acuerdo con la bondad de los ajustes.
Esta matriz de datos tiene la siguiente forma:
[S] (mM)
[ I ] (mM)
v (µmol min-1
mgE-1)
si
0.100
0.000
0.907
1
0.100
1.000
0.736
1
0.100
2.000
0.569
1
0.100
3.000
0.489
1
-----
------
-----
-------
-----
------
-----
-------
1.400
0.000
5.823
1
1.400
1.000
3.396
1
1.400
2.000
2.524
1
1 400
3 000
1 887
1
A) AJUSTE A INHIBICIÓN NO COMPETITIVA:
1) En la barra de opciones del menú principal despliegue la opción “Ajustes” y dentro de
ella seleccione “Advazado: Modelos de coleción o usuario (qnfit)” .
2) Elija la opción “Ejecutar”.
3) Aparece una pantalla informativa, pulsar “OK”.
5) “¿Comprobar nuevas series de datos?”, contestaremos “Sí”.
6) Del menú para seleccionar el tipo de función elegiremos “Función de 2 variables”.
7) Seleccione o escriba la fila “c:\curso\caso305c.dat”, y pulse el boton “OK”.
8) ¿Usar este archivo?, contestaremos “Sí”.
9) “¿Modo experto?”, contestaremos “NO”.
10) Del siguiente menú elegimos “Ajustar los datos actuales”.
11) Del siguiente menú seleccionamos “Cinética enzimática”.
12) Del siguiente menú escogemos “Inhibición no competitiva”. Este modelo es el
siguiente:
v=
V max[S ]
[I ]
[I ]
Km(1+ Ki )+(1+ Ki )[S ]
10
Caso 305 : Cinética de inhibición de una enzima
que en nomenclatura SIMFIT es :
z=
P(1) X
Y
Y
P(2)(1+ P(3)
)+(1+ P(3)
)X
13) ¿Es correcto este modelo?, contestaremos “Sí”.
14) Del siguiente menú elegimos “Parámetros positivos” y a continuación pulsamos OK.
(el programa mostrará unos avisos de queja, diciendo que esa no es la mejor opción y que es más
conveniente que el ususario establezca los límites de los parámetros, pero en nuestro caso todos
los parámetros necesariamente han de ser positivos y así ganamos en brevedad)
15) Pulsar “Proceder al ajuste”.
16) Del siguiente menú seleccionamos “Busqueda al azar extensiva”.
17) Cuando acaba el “contador” de optimización pulsar “OK”.
18) Aparecerá una pantalla informativa, pulsar “OK”.
19) Del siguiente menú escogemos “Análisis completo”.
20) A continuación apareceran los resultados del ajuste, para ir avanzando basta con ir
pulsando sucesivamente “OK” .Si se trata de gráficas en este caso basta cor ir siguiendo
los menus y seleccionando la representación que se desee, en este caso una opción
interesante es “representar el ajuste z=f(x,y) (solamente la superficie)”. Cuando
hayamos terminado con las gráficas, para salir del modo gráfico hay que pulsar la
siguiente secuencia de opciones:
“menú”-->“Cambiar tipo de gráfica (o Cancelar) ”--->“¿abandonar esta gráfica?” “Sí”
21) A la pregunta ¿Mostrar la matriz de correlación?, contestaremos “No”.
22) A la pregunta ¿Mostrar los eigenvalores de Hessiana?, contestaremos “No”.
23) A la pregunta ¿Quiere analizar los residuales?, contestaremos “No”.
24) A la pregunta ¿Mostar la tabla de residuales?, contestaremos “No”.
25) Al volver al menú principal aligiremos ahora las siguientes opciones:
“Guardar WSSQ para test F” -->”Guardar valores actuales”--> “¿Título? (podemos
poner por ej. “no competitiva”) “--> “Cancelar”. Esta secuencia nos ha guardado en
memoria todos los datos necesarios para hacer luego unt test F de discriminación entre el
modelo de inhibición no competitiva y el de inhibición mezclada.
De todos los resultados que aparecen, conviene fijarse especialmente en los valores de los
parámetros y en el sumatorio de residuales al cuadrado, cuyos valores los podemos anotar en
una tabla. Al final deberíamos haber obtenido la siguiente tabla:
Modelo
I. no competitiva
P(1)
(Vmax)
8.368
P(2)
(Km)
0.704
P(3)
(Ki)
1.785
WSSQ
(Sumat. res.)
0.363
B) AJUSTE A INHIBICIÓN MEZCLADA:
26) Al finalizar sale un último menú de opciones del que seleccionaremos “Nuevo modelo
(mismos datos)” para seguir con los mismos datos y ajustar ahora el modelo alternativo
27) Del siguiente menú seleccionamos “Cinética Enzimática”.
28) Del siguiente menú escogemos “Inhibición mezclada”. Este modelo es el siguiente:
v=
V max[S ]
[I ]
[I ]
Km(1+ Ki )+(1+ Kii )[S ]
Caso 305 : Cinética de inhibición de una enzima
que en nomenclatura SIMFIT es :
z=
11
P(1)X
Y
Y
P(2)(1+ P(3)
)+(1+ P(4)
)X
29) A continuación procederemos de forma idéntica a la secuencia 13) -24) comentada
anteriormente. Podemos anotar los repectivos valores de los parámetros y del sumatorio
de residuales para este modelo. Al final deberíamos haber obtenido la siguiente tabla:
Modelo
I. mezclada
P(1)
(Vmax)
9.742
P(2)
(Km)
0.954
P(3)
(Ki)
5.128
P(4)
(Kii)
0.998
WSSQ
(Sumat. res.)
0.021
También podríamos haber imprimido la gráfica “z=f(x,y) (solamente la superficie)”, ya
que esta sería la superficie de ajuste que creeemos será la mejor.
SIMFIT 3D plot for z = f(x,y)
6
Velocidad
1
1.400
3.000
[Inhibidor]
[Sustrato]
0.000
1.000×10-1
30) Ya sólo nos quedaría sancionar mediante el test estadístico F si el segundo modelo
(inhibición mezclada, 4 parámetros) es significativamente mejor que el primer modelo (
inhibición no competitiva, 3 parámetros). Para ello sigamos otra vez la secuencia del
apartado 25 anterior:
Al volver al menú principal aligiremos ahora las siguientes opciones:
“Guardar WSSQ para test F” -->”Guardar valores actuales”--> “¿Título?
(podemos poner por ej. “mezclada”) “--> “Cancelar”. Esta secuencia nos ha
guardado en memoria todos los datos necesarios para hacer el test F entre los dos
modelos. Basta con seleccionar la opción “Test F”, seguidamente elegir
“seleccionar N1, M1, Q1”, luego elegir la línea “no competitiva” (se mostrará un
mensaje (Q1=Q2 (datos idénticos), no importa pulsar OK), luego elegir “seleccionar
N2, M2, Q2”, luego elegir la línea “mezclada”, a continuación elegir ya “Test F” y
12
Caso 305 : Cinética de inhibición de una enzima
No hay duda pues de que el modelo que mejor se ajusta a nuestros datos es la
inhibición mezclada.
31) Para finalizar basta con seguir la secuencia: cancelar --> salir