Universidad de Oviedo Instituto Universitario de Oncología del Principado de Asturias Máster en Biomedicina y Oncología Molecular Estudio de susceptibilidad tumoral en ratones deficientes en Adamts12 Laura Solares Sampedro Julio 2015 Trabajo Fin de Máster 1 SANTIAGO CAL MIGUEL y ÁLVARO OBAYA GONZÁLEZ, profesores titulares del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Departamento de Biología Funcional de la Universidad de Oviedo. CERTIFICA: Que la Graduada, Laura Solares Sampedro, ha realizado bajo su dirección el Trabajo Fin de Máster titulado: “Estudio de susceptibilidad tumoral en ratones deficientes en Adamts12” que reúne a nuestro juicio las condiciones necesarias de originalidad y calidad para ser admitido como Trabajo Fin de Máster de la Universidad de Oviedo Y para que así conste, firman la presente certificación. Oviedo, en Julio de 2015 Fdo: Santiago Cal Miguel Fdo: Álvaro Obaya González 2 ABREVIATURAS Y SIGLAS ADAMTS Metaloproteasa y desintegrina con dominios trombospondina ADAM Metaloproteasa con dominios desintegrina EGF Factor de crecimiento epitelial FBS Suero fetal bovino HGF Factor de crecimiento de hepatocitos kDa Kilodalton/s KO Knock out MEX Matriz extracelular mg Miligramos mM Milimolar pb Pares de bases PBS Tampón fosfato salino RNAi RNA de interferencia SDS-page Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico TGF-β1 Factor de crecimiento transformante beta-1 Tris Tris(hidroximetil)-animometano TSP-1 Motivo trombospondina tipo 1 TSP Motivos trombospondina VEGF Factor de crecimiento endotelial vascular vWF Factor de Von Villebrand WT Wild type 3 Resumen………………………………………………………………….............................................5 INTRODUCCIÓN………………………………………………………….…………………..........6 ADAMs y ADAMTSs…………………..……………………….…..................................................8 ADAMTS-12……………………………………………………….................................................13 OBJETIVOS…………………………………………………………………………………..........16 MATERIAL Y MÉTODOS………………………………………………………………….........18 Líneas celulares y animales de experimentación……………........................................................19 Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-page)………………………………...........19 Análisis por Western Blot…………………………………………………………………….…..20 Cultivos celulares y transfecciones………………………………………………………….........20 Ensayos de invasión y migración……………………………………………………………........21 Ensayos de formación de colonias……………………………………………………………......22 Genotipado de ratones………………………………………………………………………...…..22 Generación de tumores subcutáneos………..………………………………………………….....22 Tumorigénesis química mediante empleo de uretano…………………………………………….23 Análisis estadístico…………………………………………………………………………..…....23 Bibliografía……………………………………………………………………………………….24 4 RESUMEN Las ADAMTSs (A Disintegrin And Metalloprotease domains with ThromboSpondin motifs) son un conjunto de metaloproteasas de matriz extracellular (MEX) que han sido relacionadas con funciones tanto oncogénicas como anti-tumorales. Estos enzimas pueden ser secretados por células tumorales y del estroma contribuyendo a modificar el microambiente tumoral por múltiples mecanismos. Así, algunas ADAMTSs como ADAMTS-12 pueden hidrolizar o interactuar con un amplio rango de componentes de MEX o factores reguladores de crecimiento, afectando a procesos de adhesión, migración, proliferación celular y angiogénesis. Por otra parte, diferentes ADAMTSs se han encontrado sobreexpresadas, mutadas o epigenéticamente silenciadas en tumores de distinto origen, sugiriendo el impacto directo de estas metaloproteasas en el desarrollo del cáncer. En este trabajo hemos examinado las alteraciones que provocan, en el comportamiento de tres líneas celulares de origen murino, cambios en la expresión de ADAMTS-12. Estas líneas han sido RM1, derivada de carcinoma de próstata; LLC, derivada de carcinoma de pulmón; y MC38, derivada de carcinoma de colon. Nuestros datos indican que las tres líneas celulares expresan endógenamente Adamts12 y que una bajada en los niveles de su expresión mediante interferencia de RNA provoca un descenso en su capacidad invasiva de dos de ellas, RM1 y MC38, lo que sugiere un papel protumoral de la metaloproteasa. Además estas tres líneas nos han permitido iniciar el estudio de la susceptibilidad tumoral del ratón deficiente en Adamts12, TS12(-/-). Los primeros ensayos indican que las tres líneas celulares inyectadas subcutáneamente en ratones TS12(-/-), no inducen la formación de tumores de mayor tamaño que cuando son inyectadas en ratones "wild-type" TS12(+/+). Sin embargo, el modelo de carcinogénesis química mediante uretano revela una mayor susceptibilidad del ratón TS12(-/-) que el TS12(+/+) a formar tumores de pulmón. Estos datos profundizan en la función dual, pro y antitumoral, de ADAMTS-12, que depende de factores tan diversos como la línea tumoral empleada, el microambiente tumoral o la interacción con otros componentes de la matriz extracelular. ABSTRACT ADAMTSs (A Disintegrin And Metalloprotease domains with ThromboSpondin motifs) consist of a set of extracellular matrix (MEX) proteases that have been related to both as anti-tumor oncogenic functions. These enzymes can be secreted by tumor and stromal cells contributing to modify the tumor microenvironment by multiple mechanisms. Thus, some ADAMTSs as is the case of ADAMTS-12 can cleave or interact with a wide range of extracellular matrix components as well as with growth factor involved in processes such as cell adhesion, migration and proliferation or angiogenesis. Moreover, different ADAMTSs have also been found overexpressed, mutated or epigenetically silenced in tumors of different origin, suggesting the direct impact of these metalloproteinases in cancer development. In this work we have examined potential alterations in cell behavior of three murine cancer cell lines. These cell lines were the prostate carcinoma RM1; the lung carcinoma LLC, and the colon carcinoma MC38. Our data indicate that these cell lines endogenously express Adamts12 and that a reduction of gene level expression by RNA interference induces a decreases in their invasive capacity of RM1 and MC38, which suggests a tumor-promoting effect by the metalloprotease. Moreover, these cell lines have been employed to initiate the tumor susceptibility analysis of the Adamts12 deficient mouse, TS12(-/-). Fist assays indicate that tumor size induced by these three lines subcutaneously injected in TS12(-/-) did not show differences respecting the tumor size induced in wild-type TS12(+/+) mouse under the same conditions. However, induction of lung chemical carcinogenesis by urethane revealed more tumor susceptibility in TS12(-/-) mice than in TS12(+/+) mice. These findings provide new insights into the dual function of ADAMTS-12 as a proand anti-tumor agent, which may depend on several factors including the type of cell line, tumor microenvironment or different interactions that upon secretion ADAMTS-12 can establish with other extracellular matrix components. 5 INTRODUCCIÓN 6 Originalmente las proteasas fueron consideradas como enzimas degradativos encargados de la digestión de proteínas procedentes de la dieta. Sin embargo, hoy conocemos que estos enzimas también influyen decisivamente tanto en procesos normales como en distintas patologías humanas. Así, mediante su actividad enzimática, las proteasas también llevan a cabo hidrólisis rigurosamente controladas y procesamientos proteolíticos mediante la rotura de enlaces peptídicos. Se trata de modificaciones irreversibles y post-traduccionales que intervienen en la localización, actividad o interacciones de gran variedad de proteínas, implicando a estos enzimas en multitud de funciones biológicas (López-Otín & Bond, 2008). La importancia de estos enzimas proteolíticos se puede traducir también en términos de diversidad. Hasta el momento, se han identificado en el genoma humano 578 genes que codifican proteasas. Este número es aún más elevado en el caso de los genomas de rata y ratón, que incluyen 652 y 664 genes de proteasas, respectivamente (http://degradome.uniovi.es). Estos números constituyen alrededor del 2% del total de genes identificados en estos genomas, de ahí la necesidad de intentar ampliar la comprensión y manejo de este tipo de enzimas. Por ello, el conjunto de proteasas de cualquier organismo, denominado degradoma (Lopez-Otin & Matrisian, 2007), se ha organizado en grupos que a su vez son extensibles a las diferentes especies. Según esto, las proteasas pueden clasificarse en base a diferentes criterios como especificidad de sustrato, mecanismo catalítico, localización intracelular o funciones en el organismo. Una de las clasificaciones de las proteasas se basa en el mecanismo catalítico de éstas. De este modo, podemos encontrar 6 clases catalíticas: las aspartil, las glutamil, las metaloproteasas, las cisteín-, serín- y treonín-proteasas (Rawlings & Barrett, 1992; Quesada et al., 2009). Todas estas clases catalíticas de proteasas se pueden a su vez organizar en familias según sus similitudes en secuencia o estructura. De esta manera obtenemos un conjunto inmenso y dispar, tanto en lo que se refiere a complejidad estructural como a especificidad. Un punto clave para establecer la relevancia funcional de las proteasas es la identificación de sus sustratos. En este contexto nos encontramos con situaciones de menor especificidad, en las que una misma proteasa es capaz de procesar múltiples sustratos (López-Otín, & Overall, 2002). Además, las proteasas desempeñan un papel fundamental en la regulación de multitud de rutas de las que dependen la vida y la muerte celular, tales como división y diferenciación celular, construcción y remodelación de tejidos, angiogénesis, ovulación, fertilización, inflamación, coagulación sanguínea o cicatrización de heridas, entre otros muchos (LópezOtín & Bond, 2008). La multitud de eventos proteolíticos explica que la alteración en las 7 funciones normales de muchas proteasas constituye una causa de enfermedad. Dichos cambios se pueden producir a nivel de la propia proteasa, por mutaciones que modifican sus propiedades o por alteraciones en los patrones de expresión o de actividad en el tiempo o espacio, o bien, afectar a componentes de los sistemas proteolíticos, como pueden ser sustratos o inhibidores de dichas proteasas. La lista de patologías con dicha etiología es amplia e incluye varias enfermedades neurodegenerativas, como son la enfermedad del Alzheimer o la distrofia muscular de Duchenne; inflamatorias como el asma, artritis; o cardiovasculares como la aterosclerosis, además de estar implicadas en cáncer (Wagstaff et al., 2001; Jorgesen et al., 2007; Paulissen et al., 2009). En lo referente a tumorigénesis, las proteasas se han considerado tradicionalmente, y tal y como Fischer postuló (Fischer, 1946), promotoras del desarrollo neoplásico y metastásico ya que muchas se encontraban sobreexpresadas en gran cantidad de tumores y a que, con el descubrimiento de inhibidores de metaloproteasas, se vio reducida la capacidad de invasión in vitro y de metástasis in vivo de las células tumorales (Folgueras et al., 2008). Sin embargo, tras numerosos ensayos clínicos basados en terapias con estos inhibidores, no se produjeron los efectos esperados e incluso, en ocasiones, se aceleraba el proceso tumoral. Hoy en día sabemos que existen proteasas extracelulares e intracelulares que participan en todos los estadios tumorales a través del control de gran variedad de procesos biológicos. Así, estos enzimas desarrollan diversos papeles en la progresión tumoral, y pueden incluso comportarse como supresores tumorales (Wagstaff et al., 2001; López-Otín & Matrisian, 2007) ADAMs y ADAMTSs Las adamalisinas son una familia de metaloproteasas que incluye los grupos ADAM “A Disintegrin And Metalloprotease domains” y ADAMTS y “A Disintegrin And Metalloprotease Domains with ThromboSpondin motifs”, respectivamente (figura 1). Miembros de estos grupos se hallan ampliamente distribuidos en mamíferos y en otros eucariotas pero no se han encontrado ni en plantas ni en bacterias. 8 Figura 1. Organización estructural básica de la familia de ADAM y ADAMTSs. A) La familia de ADAMs presenta como estructuralmente reseñables un dominio desintegrina (involucrado en adhesión), un dominio metaloproteinasa (encargado de la proteólisis), repeticiones de dominios EGF, un dominio transmembrana y una cola citoplasmática. Aunque todas las ADAMs poseen un dominio metaloproteinasa común, no todas son catalíticamente activas. B) ADAMTSs poseen además de los indicados para las ADAM, un dominio TSP-1 y varias repeticiones de este tipo de dominios en el extremo carboxilo terminal. A diferencia de las ADAMs, las ADAMTSs no poseen un domino transmembrana ni cola citoplasmática y por tanto son proteínas que no están ancladas a la matriz extracelular. Además varios dominios adicionales se han encontrado en algunas ADAMTSs (dominio CUB, GON o PLAC). Imagen tomada de Lafleur et al., 2003. Dentro de esta familia, las ADAMs fueron los primeros miembros caracterizados, tratándose de proteínas con un dominio transmembrana que suelen permanecer en la superficie celular, aunque se pueden encontrar formas solubles generadas mediante proteólisis o como consecuencia de splicings alternativos. En un principio se asociaron a la espermatogénesis, unión y fusión del esperma al huevo, sin embargo, más adelante fueron implicadas en modulación de la migración y adhesión de las células tumorales, activación de vías señalizadoras y liberación de citoquinas y factores de crecimiento unidos a membrana (Duffy et al., 2011; Klein & Bischoff, 2011). Así, la complejidad de esta familia se incrementó considerablemente con la identificación de la primera ADAMTS, ADAMTS-1 (Kuno et al.,1997). Un total de 19 ADAMTSs han sido funcionalmente identificadas en los genomas humano y de ratón, ejerciendo funciones específicas en procesos tanto fisiológicos como patológicos (figura 2) (van Goor et al., 2009; Klein & Bischoff, 2011; Kelwick et al., 2015). Todas las adamalisinas presentan algunas características estructurales comunes. Así, tanto ADAMs como ADAMTSs llevan en su secuencia polipeptídica una región de adhesión 9 y otra proteolítica (figura 1). Además, presentan un dominio proteasa, relacionado con la capacidad que presentan estas moléculas para degradar componentes de MEX como colágeno o fibronectina. En cuanto a funciones de adhesión, las adamalisinas presentan un dominio desintegrina y otro rico en cisteínas para interacciones con proteoglicanos y componentes de MEX (Lafleur et al., 2003). Sin embargo, las ADAMs son proteínas ancladas a la membrana citoplasmática, mientras que las ADAMTS se secretan e interaccionan con la MEX (Lafleur et al., 2003). Otro aspecto estructuralmente destacable es que las ADAMTSs además poseen uno o varios dominios trombospondina-1 (TSP-1) relacionados con funciones de interacción proteica, los cuales fueron descritos inicialmente en proteínas secretadas con funciones antiangiogénicas (trombospondinas 1 y 2) (Vázquez et al., 1999). Las ADAMTSs disponen de un dominio TSP-1 conservado en posición central, entre el dominio desintegrina y el dominio rico en cisteínas, un número variable en el extremo carboxilo terminal con mayor variabilidad (a excepción de la ADAMTS-4 que no presenta ningún TSP-1 en dicho extremo). Además, tanto ADAMTS-7 como ADAMTS-12 presentan dos dominios espaciadores que separan dos sets de repeticiones TSP-1. Finalmente, algunas ADAMTSs presentan otros dominios específicos en la región carboxilo terminal como pueden ser el motivo proteasa y lacunina (Plac), el motivo gon-1 (Gon), o motivo cubilina (Cub), exclusivo de ADAMTS-13 (figura 2) (Barret, 2003; Kelwick et al.,2015). Es precisamente el extremo carboxilo terminal el que aporta mayor variabilidad estructural a estos enzimas, afectando al modo de interacción con sus sustratos y con el entorno celular. Esta región es además diana de frecuentes modificaciones mediante proteólisis lo que podría provocar alteraciones en las propiedades de estos enzimas (Cal et al., 2001; Liu et al., 2006a). Figura 2. Familia de ADAMTS (A Disintegrin And Metalloproteinase with ThromboSpondin Motifts). La figura ilustra la organización básica de las 19 ADAMTSs identificadas hasta el momento en mamíferos y clasificadas según su función. Imagen tomada de: (Kelwick et al. , 2015) 10 La MEX que rodea a las células de un tejido está formada por gran cantidad de componentes que se clasifican en tres grupos: proteoglicanos y glicosaminoglicanos, proteínas estructurales (colágeno y elastina), y proteínas de adhesión (fibronectina y laminina). Tal variedad de componentes se encuentran interconectados y requieren de la función de las proteasas, cuya misión es degradar las proteínas integrantes de dicha matriz o activar factores de crecimiento, receptores de superficie y moléculas de adhesión (Laconi, 2007). La interacción de la célula con la matriz desencadena cascadas de señalización que promueven la diferenciación, migración y movilización celular, esenciales para el mantenimiento de la homeostasis tisular (Gillian & Nagase, 2008). Por lo tanto, las ADAMTSs actúan como mediadores esenciales de procesos de remodelación de matriz y señalización celular. Así, algunas ADAMTSs son capaces de procesar distintas formas de procolágenos eliminando sus propéptidos y participando en procesos de maduración de componentes de matriz, como es el caso de las ADAMTS-2, -3 y -14, manteniendo la homeostasis tisular. Otro caso es el de la ADAMTS-13, que actúa sobre el sustrato vWF o factor de von Willebrand, proteoglicano implicado en la agregación plaquetaria, contribuyendo a la adecuada homeostasis en la formación de trombos. Sin embargo, mutaciones en el gen de ADAMTS-13 desencadena la pérdida de función de la misma generando la patología vascular de la púrpura trombocitopénica trombótica (Levy et al., 2001; Colige et al., 2002). Además de estas funciones, muchas ADAMTSs están también implicadas en la aparición y progresión de tumores así como en procesos de angiogénesis y en el desarrollo de metástasis a través de la acción de sus dominios TSP-1 entre otros (Liotta, 1986; Liu et al., 2006b; El Hour et al., 2010). Alteraciones en la expresión de ADAMTSs en tumores de distinto origen han llevado a asociar estas proteasas con cáncer. En el caso de la ADAMTS-1, proteasa mejor caracterizada por sus efectos pro y antitumorales (figura 3), se ha relacionado con la progresión tumoral facilitando procesos de invasión celular y metástasis hacia nódulos linfáticos en carcinoma pancreático (Masui et al., 2001). También se encuentra sobreexpresada en modelos de fibrosarcomas favoreciendo el crecimiento del tumor de manera independiente a procesos de angiogénesis. Independientemente del efecto inhibitorio mediado por el corte proteolítico del dominio TSP-1, se ha observado que la actividad enzimática de ADAMTS-1 también es necesaria para incrementar el proceso de formación de nuevos vasos a partir de otros ya preexistentes así como para promover metástasis pulmonar en células de carcinoma de pulmón y de mama. También se ha estudiado que ADAMTS-1 puede facilitar la salida de las células tumorales del propio tumor y favorecer su migración hacia otras zonas por su capacidad para degradar el versicano, proteoglicano presente en gran 11 variedad de tejidos humanos, con funciones de adhesión, migración y proliferación celular por estar involucrado en respuestas estromales basadas en el agrupamiento de fibroblastos que promueven el crecimiento de algunos tumores pulmonares (Rocks et al., 2008; Shiaw-Wei et al., 2012). Además la actividad proteolítica de la proteasa ADAMTS-1 se ha visto incrementada por su interacción con la fibulina-1, glicoproteína que puede interactuar con distintos componentes de la MEX incluyendo sustratos propios de ADAMTS-1 como son nidogen-1 y versicano (Lee et al., 2005). Estos estudios reflejan como la actividad catalítica de ADAMTS-1 puede influir en una remodelación del microambiente tumoral facilitando la migración de las células desde su lugar de origen en diferentes tipos de cáncer y, por lo tanto, pueden promover la metástasis tumoral. Otras proteasas como las agrecanasas ADAMTS-4 y -5 también pueden contribuir a incrementar el potencial invasivo de células tumorales de glioblastomas mediante una degradación de brevicano, un proteoglicano altamente expresado en un tipo de tumor cerebral (Held-Feindt, 2006). Sin embargo, también se han asociado propiedades antitumorales a las ADAMTSs y no relacionadas únicamente con dominios estructurales ya que numerosos genes ADAMTSs se han encontrado mutados o silenciados epigenéticamente en determinados tumores (figura 3) (Moncada-Pazos et al., 2009; Cal & López-Otín, 2015). Figura 3. Representación esquemática de los efectos antitumorales (a la izquierda) y protumorales (a la derecha) mediados por las metaloproteasas ADAMTSs (Imágenes tomadas de Cal & López-Otín, 2015). 12 ADAMTS-12 La proteasa ADAMTS-12 fue identificada en 2001 en nuestro laboratorio, tras ser clonada a partir de una genoteca de cDNA de pulmón fetal humano (Cal y col., 2001). Se expresa en ovario, glándula mamaria, útero y pulmón de ratón, pero tiene baja expresión en tejidos humanos (El Hour et al., 2010). Estructuralmente esta metaloproteasa es similar a otras ADAMTSs, excepto por el hecho de que las repeticiones TSP-1 de su extremo carboxilo terminal están separadas en dos regiones por un segundo espaciador (figura 4), estructura compartida con ADAMTS-7(Liu, 2009). Repetición TSP-1 Prodominio Péptido señal Desintegrina Metaloproteasa Rico en Espaciador cisteínas Espaciador-2 Motivo PLAC Figura 4. Representación esquemática de la estructura de ADAMTS-12. El dominio trombospondina (TSP-1) situado entre el dominio desintegrina y el rico en cisteínas es el más conservado en toda la familia, mientras que los dominios terminales muestran una mayor variabilidad. PLAC, dominio proteasa-lacunina. (Imagen adaptada de Wei et al., 2014). En cuanto a sus funciones, ADAMTS-12 ha sido implicada tanto en procesos artríticos por su actividad proteolítica sobre la proteína oligomérica de matriz de cartílago (COMP), como en procesos inflamatorios. Así, mediante el uso de ratones deficientes en Adamts12 se observa que la falta del enzima exacerba los síntomas en enfermedades inflamatorias tales como colitis, pancreatitis o choque séptico. Los tejidos afectados presentan un aumento del número de neutrófilos en los ratones deficientes en Adamts12, además de observar una ralentización en la cicatrización de heridas de piel producidas sobre estos animales (Liu et al., 2006a; Liu, 2009; Hodgkinson et al., 2010; Moncada-Pazos et al., 2012; Paulissen et al., 2012). Uno de los ensayos llevados a cabo para comprobar el papel de la metaloproteasa ADAMTS-12 en el proceso tumoral fue emplear un modelo celular utilizando células MDCK (Madin-Darby canine kidney). Son células no tumorales derivadas de riñón canino que muestran un fenotipo mesenquimal tras ser tratadas con factores de crecimiento, como el HGF (Hepatocyte Growth Factor). Al seleccionar los clones que producen elevadas cantidades de 13 ADAMTS12, dichas células son refractarias al cambio fenotípico. ADAMTS-12 inhibe la fosforilación de Erk sobre modelos celulares que sobreexpresan esta metaloproteasa, bloqueando efectos protumorales (Llamazares et al., 2007; Koch y col., 2011). Posteriormente, mediante la utilización de animales deficientes en la proteasa ADAMTS-12 se comprobó que esta proteasa está implicada en inhibición de procesos angiogénicos (El Hour et al., 2010). Otro de los efectos antitumorales ha sido inferido teniendo en cuenta que muchos genes supresores tumorales se ven sometidos a fenómenos de silenciamiento a través de hipermetilacion de sus promotores. El promotor de este gen presenta una isla CpG en la región promotora, con alta frecuencia de hipermetilaciones, tal y como se observó mediante técnicas de PCRs específicas de metilación y secuenciación de bisulfito (Moncada-Pazos et al., 2009). Además, por técnicas de inmunofluorescencia pudo observarse que eran las células estromales (fibroblastos activos) las responsables de la producción de esta proteína y no las células del tumor propiamente dichas, experimentando las primeras, una inducción transcripcional de la expresión de ADAMTS-12 ante la presencia de células malignas (Moncada-Pazos et al., 2009) . Un tumor se debe interpretar como una entidad formada por la agregación de varios componentes de matriz (estroma) y no sólo por la presencia de las células tumorales. En este contexto, ADAMTS-12 ha sido relacionada con una respuesta estromal basada en el control de la progresión tumoral, sugiriendo que esta metaloprotelasa podría ser un marcador de buen pronóstico en carcinomas colorrectales (Moncada-Pazos et al., 2009; Filou et al., 2015). La intervención de ADAMTS-12 in vivo tendría lugar bajo ciertos estímulos propios del ambiente tumoral. De tal forma que primarían las señales particulares como el TGF-β1 que estimularía la producción de la proteasa (Cal et al., 2001). En los fibroblastos este evento provocaría su activación, diferenciándose a un tipo celular distinto, típico de situaciones reactivas como cicatrización de heridas o tumorigénesis. Así podría explicarse que la expresión de ADAMTS-12 en ratones silvestres se detecta preferentemente en tejidos con remodelación constante (glándulas mamarias, útero, ovario o nódulos linfáticos) en los que también están presentes los fibroblastos activos (El Hour et al., 2010). Tal y como se ha ido comentando, hay un conjunto creciente de enzimas con propiedades antitumorales, explicando por su presencia, el fracaso de numerosos ensayos clínicos con inhibidores de amplio espectro, incapaces de distinguir entre acciones pro y antitumorales causadas por enzimas proteolíticos, entre los que se encontrarían las ADAMTSs (López-Otín & Matrisian, 2007). 14 Sin embargo, aunque existe un menor número de evidencias al respecto, ADAMTS-12 también desempeña acciones protumorales además de estar relacionada con una exacerbación de la inflamación e hipersensibilidad en procesos asmáticos (Paulissen et al 2012; Fontanil et al., 2014; Cal & López-Otín, 2015). Así, se ha comprobado que una mayor expresión de ADAMTS-12 en células trofoblásticas humanas lleva a que dichas células adquieran mayor fenotipo invasivo. Esto es debido a que ADAMTS-12 modula la invasión celular mediante la regulación de la expresión y la función de la integrina αvβ3 (Beristain y col., 2011). Otro de los factores que puede condicionar el papel pro- o anti-tumoral de ADAMTS-12 y de otras metaloproteasas es la modulación de su actividad mediante la interacción con componentes de la matriz extracelular. Se sabe que ADAMTS-12 es capaz de potenciar procesos de migración, invasión celular y formación de tumores subcutáneos, en MCF-7, una línea de cáncer de mama. Sin embargo, de forma similar a como ADAMTS-1 lo hace con la fibulina-1, ADAMTS-12 interacciona con fibulina-2, lo que conduce a una reducción de la capacidad protumoral de la proteasa en células de cáncer de mama. Además, una alta expresión conjunta de ambas proteínas extracelulares se correlaciona con un mejor pronóstico en pacientes con este tipo de patología (Fontanil et al., 2014). 15 OBJETIVOS 16 La metaloproteasa ADAMTS-12 ejerce sus funciones tanto en procesos fisiológicos como patológicos, manteniendo la homeostasis de tejidos así como participando en diversas patologías asociadas a procesos inflamatorios o a enfermedades como el cáncer. En el presente trabajo, se plantea profundizar en el papel que la adamalisina ADAMTS-12 desempeña en cáncer, utilizando distintas líneas celulares tumorales que endógenamente expresan ADAMTS-12. Además, el estudio de la susceptibilidad tumoral que presentan ratones deficientes en esta proteasa, contribuirían a esclarecer los factores que potencian una acción protumoral o favorecen una inhibición de crecimiento tumoral. En base a estos precedentes, los objetivos concretos de este trabajo son: 1. Establecimiento y selección de clones derivados de las líneas de cáncer de próstata RM1, cáncer de pulmón LLC y cáncer de colon MC38 con bajos niveles de expresión de Adamts12 . 2. Estudio de cambios en el fenotipo de la líneas celulares indicadas mediante ensayos in vitro. 3. Inicio de los estudios de susceptibilidad tumoral en el ratón deficiente en Adamts12. 17 MATERIAL Y MÉTODOS 18 Líneas celulares Para el presente trabajo se emplearon 3 líneas celulares, todas ellas isogénicas con la cepa de ratones C57BL/6J; por un lado la línea celular RM1, derivada de carcinoma de próstata y cedidas por el Dr. Timothy Thompson, MD Anderson Cancer Center-Universtity of Texas; la línea celular LLC (Lewis Lung carcinoma cells, ATCC), derivada de cáncer de pulmón y la línea celular MC38, cedida por Ignacio Melero (Centro de Investigación Médica Aplicada CIMA, Navarra) derivada de carcinoma de colon. Animales de experimentación Los animales empleados en los ensayos in vivo fueron ratones deficientes en Adamts12, knock out (KO), así como los wild type (WT). Fueron generados en una colaboración de nuestro laboratorio con el que dirige la Dra. Agnes Noel (Universidad de Lieja, Bélgica), por técnicas de recombinación homóloga en células pluripotenciales embrionarias de ratón pertenecientes a la cepa C57BL/6J (El Hour et al., 2010). Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) Tras el crecimiento de las distintas líneas tumorales en placas de cultivo, se procedió al lavado de las mismas con PBS y a su homogenización mediante la adición del volumen adecuado de tampón de disociación (Tris-HCl 0,25M, SDS 8%, glicerol 35% y 2βmercaptoetanol 2,5% bromofenol, glicerol35%, pH 6,8). Las muestras se calentaron a 100ºC durante 5 min asegurándose así de la completa desnaturalización de las mismas, antes de proceder a la electroforesis en geles SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-PoliAcrilamide Gel Electrophoresis”). Para la electroforesis se empleó el tampón Tris-HCl 24,8mM; pH 8,8, glicina 192 mM; SDS 0,1% y se aplicó un voltaje de entre 150-200V. 19 Análisis Western-blot Las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Hybond ECL, Amersham Biosciences) a 50 voltios en un soporte Miniprotean II (Bio-Rad Laboratories,) con un tampón de transferencia (CAPS 10mM, NaOH 4mM, metanol 20%, pH 10,5) durante hora y media. Una vez terminada la transferencia, se procedió al bloqueo de las membranas incubándolas durante media hora con leche en polvo desnatada al 5% diluida en tampón TBST-1X (pH 7,4; 20Mm Tris-NaCl; 150mM NaCl; 0,05% Tween-20). Posteriormente, se incubaron las membranas con el correspondiente anticuerpo primario (anti ADAMTS-12 de Lifetechnologies; anti-Fibulin-2 de SantaCruz Biotech) 16h en agitación y a 4oC. Los anticuerpos primarios se prepararon en leche al 3% diluyéndolos con el tampón TBST-1X, añadiendo 10µl de azida sódica al 0,2% para su conservación. Como anticuerpo secundario se usó el anticuerpo Donkey Anti-Rabbit peroxidase (DARPO 2%). Para el revelado de la membrana se empleó el sustrato Luminata TM Forte, (Western HRP Substrate) de Millipore Corporation, Billerica, MA 01821 reveladas para su visualización mediante el aparato LAS3000 mini (Fujifilm) o exposición autorradiográfica. Cultivos celulares y transfecciones Las líneas celulares RM1, LLC y MC38 se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina/glutamina, todos ellos de Gibco, y fueron mantenidas en incubadores a 37ºC y 5% de CO2. Dichas líneas celulares se transfectaron con los plásmidos que contenían los shRNAs de interferencia para ADAMTS-12 (Origene) usando además como control el correspondiente vector vacío. El procedimiento se llevó a cabo utilizando TransIT-X2 de Mirus, siguiendo las indicaciones del fabricante. 20 Ensayos de invasión Para estudiar la capacidad de invasión in vitro, se utilizó el sistema BD BioCoatTM MatrigelTM Invasion Chamber de BD Biosciences, que dispone de una placa BD Falcon ™ TC Companion con transwells con una membrana de Matrigel que contiene poros de 8 µm. Primero se hidrataron las cámaras de invasión con medio DMEM completo (con suero y antibióticos) durante 2 horas. Posteriormente, se eliminó el medio y se sembraron 8x10⁵ de las tres líneas celulares resuspendidas cada una de ellas en 500 µl de medio sin suero en cada transwell, por fuera de este se añadió medio suplementado con 10% de FBS (actuando de quimioatrayente). Tras una incubación de 48 horas, las células que habían alcanzado la superficie inferior de la cámara se tiñeron con cristal violeta. El número de células en cada uno de los casos se contó a partir de 3 campos de observación al microscopio, escogidos aleatoriamente, mediante fotografías tomadas con el programa LAS EZ 2.0 (Mycrosystems), Leica. Ensayo de migración mediante insertos en Micro-Dish de Ibidi Para comparar la capacidad migratoria de las células RM1 así como de las células tumorales LLC y MC38 con sus respectivas líneas con la interferencia de ADAMTS-12 se empleó el sistema de insertos en Micro-Dish de Ibidi. En este ensayo, se enfrentó a cada línea celular con su respectiva interferencia de ADAMTS-12 en los dos pocillos del soporte, para ello se añadieron 1x10⁶ células de cada línea y condición, una vez adheridas a la base de la placa se retiró el insert, dejando un espacio libre de células de 500 µm (figura 5). Después se rellenó la placa con medio completo y se procedió a tomar fotografías cada 2h, observando las diferencias que posteriormente fueron analizadas mediante el programa ImageJ. Figura 5. Esquema de insertos en Micro-Dish de Ibidi. A la izquierda del insert se colocó cada línea celular control y a la derecha del mismo, las correspondientes interferencias de cada tipo celular (TS12-shRNA) estudiando cómo influye la reducción de la expresión de ADAMTS-12 en procesos de migración celular. Imagen de Principle for Wound Healingand Migration Assays recuperado de: http://ibidi.com/fileadmin/products/labware/open_removable/E_8XXXX_CultureInsert/E_8XXX_CultureInsert_image1.jpg 21 Ensayos de formación de colonias Se emplearon placas de 24-well, realizando triplicados de cada condición y tipo celular. Para la mezcla de la capa base se combinaron DMEM, FBS y agua Milli-Q en las proporciones 2:1:2. Se preparó también una solución de agar al 1,2% y ambas se dejaron atemperar a 37ºC. Una vez atemperadas, ambas soluciones se mezclaron en volúmenes idénticos mediante agitación suave. La mezcla resultante se empleó para rellenar los pocillos y se dejó solidificar. A continuación se preparó una suspensión de cada línea celular en medio de cultivo con una concentración de 4x10⁵ células/ml. Esta suspensión se mezcló con las disoluciones del apartado anterior y la solución de Agar al 1.2% (en ambos casos atemperadas a 37ºC) en las proporciones 1: 1: 1. A continuación se añadieron 500 µl de la mezcla en cada pocillo de la placa de 24-well. El gel se dejó solidificar a 4ºC durante 15 min y después se añadieron 100 µl de medio completo DMEM a cada pocillo. Por último se dejó en incubador a 37ºC durante 7 días, pasado este tiempo se tomaron fotografías al microscopio para el posterior recuento de las colonias. Genotipado de ratones La identificación genotípica de los ratones se llevó a cabo mediante PCR y diferenciación de los alelos correspondientes mediante análisis en geles de agarosa de los productos obtenidos, 330 pb para el alelo WT y 270 pb para el alelo KO tal y como se describe en El Hour et al., 2010. Generación de tumores subcutáneos Cada línea celular tumoral fue inyectada en el flanco izquierdo de cada animal (se usaron 5 animales Adamts12 (+/+) (TS12-WT) y otros cinco Adamts12 (-/-) (TS12-KO) para cada línea celular. Se inyectaron 1x105 células para el caso de las LLC y RM1 y 1x106 para las MC38. Para la generación de tumores subcutáneos se emplearon machos de la cepa C57BL/6J de 4-6 semanas de edad. Todos los animales fueron mantenidos en el Bioterio de la Universidad de Oviedo en condiciones SPF (libres de patógenos específicos) y en condiciones ambientales estándares de temperatura (22±2ºC), humedad relativa (65±1%) y ciclo de luzoscuridad (12:12 horas). Todos los animales tuvieron acceso ad libitum a comida y bebida y los experimentos realizados con los mismos se llevaron a cabo en el citado Bioterio de acuerdo a la normativa Europea (86/609/EU) y a la regularización española (BOE 67/850922 12, 1988). Los protocolos experimentales fueron además aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Oviedo. Los animales fueron anestesiados con isofluorano en el momento de inyectar subcutáneamente las células. A lo largo del experimento se hizo un seguimiento rutinario para evaluar la apariencia y el estado de salud de los animales. Asimismo, se midió el tamaño de los tumores con un calibre, empleando como aproximación para el cálculo del volumen del tumor la fórmula V=0’4xAxB2, donde A y B son, respectivamente, la mayor y la menor de las medidas (Llamazares et al., 2007). El sacrificio de los animales se llevó al cabo de 3 semanas mediante asfixia con CO2 o por dislocación cervical. Tumorigénesis química mediante el empleo de uretano Para llevar a cabo el estudio sobre carcinogénesis química se emplearon ratones de 7-8 semanas de edad, a los cuales se les inyectó intraperitonealmente una dosis de 1mg/g por peso corporal de uretano (Sigma) preparando una disolución de uretano en 0,9% de NaCl 100mg/ml. La segunda dosis fue dada 48h después de la primera y el resto cada 7 días, hasta un total de 8 dosis. Tras 28 semanas los animales fueron sacrificados y tras esto se les extrae el pulmón y se procede al recuento de los nódulos tumorales. El pulmón izquierdo fue fijado en 4% paraformaldehído durante 24h. Las muestras fueron procesadas en el Servicio de Histopatología molecular en modelos animales de cáncer, del instituto del IUOPA con el fin de proceder a la valoración histológica. Análisis estadístico Para la comparación de medias entre muestras con distribución normal se utilizó el test t de Student, considerando estadísticamente significativo un p-valor < 0’05. 23 BIBLIOGRAFÍA 24 Basbaum CB., Werb Z., (1996). Focalized proteolisis: spatial and temporal regulation of extracellular matrix degradation at the cell surface. Cell Biology, (8), 731–738. Beristain AG., Zhu H., Leung PC., (2011). Regulated expression of ADAMTS-12 in human trophoblastic cells: a role for ADAMTS-12 in epithelial cell invasion. Plos one, 6(4)18473. doi:10.1371/journal.pone.0018473 Cal S., Argüelles JM., Fernández PL., López-Otín C., (2001). Identification, characterization, and intracellular processing of ADAM-TS12, a novel human disintegrin with a complex structural organization involving multiple thrombospondin-1 repeats. The Journal of biological chemistry, 276(21), 17932–17940. doi:10.1074/jbc.M100534200 Cal S., López-Otín C., (2015). ADAMTS proteases and cancer. 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