Manual de Genotipado

GENOTIPADO
1. MICROSATÉLITES
El uso de marcadores moleculares para la identificación de genotipos de interés
mediante microsatélites es susceptible de ser analizadas a través de la instrumentación
existente en la Unidad de Genómica. El servicio se encarga de la etapa final de esta técnica
la cual consiste en la cuantificación del tamaño de los fragmentos de DNA proporcionados
por el usuario y generados en el desarrollo de la técnica mencionada. Dicha cuantificación
se realiza en relación a estándares internos que se añaden a las muestras cuando se analizan
mediante electroforesis capilar. Se pueden utilizar hasta 5 marcadores fluorescentes
simultáneamente (uno de ellos reservado para el marcador de tamaños moleculares) y
combinar diferentes tamaños alélicos en la misma muestra por lo que por cada capilar en
una misma electroforesis se pueden analizar multitud de fragmentos. La electroforesis se
lleva realiza en el equipo ABI 3130XL.
1.1 Fluorocromos
Una de las principales ventajas de esta metodología es la detección multicolor. A
continuación, se detallan algunos aspectos de utilidad a la hora de elegir un fluorocromo u
otro para marcar las parejas de primers de interés.
Detección multicolor. Intensidad relativa de los fluorocromos más utilizados.
Dyes
5-FAM™
6-FAM™
JOE™
VIC®
HEX™
NED™
TAMRA/TAMRA™
PET®
ROX™
LIZ®
Max A (nm)
494
494
528
538
535
546
560
558
587
638
Max E (nm) Intensidad Rel
530
522
554
554
553
575
582
595
607
655
100
100
100
100
50
40
25
25
12
50
+
-
Propiedades óptimas de los fluorocromos
a. Deben tener Amax lo más diferente posible para:
- Facilitar la generación de las matrices/calibración espectral
b. Deben ser lo más brillante posible:
- Aumentará la sensibilidad del ensayo
- Regla general: Azul>Verde >Amarillo > Rojo
c. Deben ser lo más estable posible
- VIC es más estable que el HEX
d. Su síntesis debe ser lo más fácil posible
- JOE y 5-FAM son los más complicados para sintetizar
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1.2. Programas
¾
Si el usuario no dispone de los softwares de análisis específicos (GeneScan,
Genotyper o GeneMapper), existe en la Unidad un ordenador con dichos
programas y a disposición del usuario que lo solicite. Además, existen algunos
visores que permiten la lectura de los datos y que se puede descargar gratuitamente
en las siguientes direcciones:
- Peak ScannerTM Software v1.0: http://www.appliedbiosystems.com/support/
software_community/free_ab_software.cfm
- Genescan View http://bmr.cribi.unipd.it/
2. SNPs
El análisis de polimorfismos de una sóla base (SNPs) se puede realizar mediante
diversas técnicas. Según los equipos existentes en la Unidad, las posibilidades son las
siguientes:
1) Análisis de SNPs mediante los kits SNaPshot (SBE/Minisecuenciación) y SNPlex
de Applied Biosystems (ABI 3130xl).
2) Discriminación alélica mediante Sondas Taqman (Real-Time PCR 7500Fast de
Life Technologies).
3) Screening a gran escala mediante D-HPLC (Varian) que permite detectar
cualquier variación en la secuencia de DNA (SNPs, deleciones, inserciones,
etc…).
Las dos primeras son factibles de utilizar siempre que el SNP sea conocido. Por el
contrario, la principal ventaja de la técnica de D-HPLC es que no requiere conocimiento
previo de la región a estudiar.
Para detectar los genotipos se puede emplear las dos primeras, la tercera solo
permite detectar homocigoto/heterocigoto.
2.1. Primer Extension Analysis: SNaPshot kits, ddNTP* = Minisecuenciación = Single
Base Extensión (SBE)
• Se basa en el uso de cebadores específicos (sin marcar) adyacentes a la base a
determinar.
SNP
Primer
Molde
Figura 1. Diseño de Primer para
SNaPshot.
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• Se realiza una reacción de PCR sólo con los 4 didesoxinucleótidos marcados cada
uno con un fluorocromo diferente sobre el molde de DNA previamente amplificado
y purificado (pueden ser uno o varios los moldes a analizar en una sola reacción de
SNaPshot)
Terminadores (dideoxi), cada uno
marcado con un fluorocromo
diferente (más la polimerasa,
buffer, etc…)
Molde DNAamplificadopurificado
Primer
AmpliTaq FS
Figura 2. Reacción de Primer Extensión (Kit SNaPshot).
• La detección de la base incorporada revela la presencia/ausencia de polimorfismo y el
genotipo.
Color=Genotipo
Figura 3. Electroforesis y Análisis de Reacción de SNaPshot.
2.1.1. Diseño del ensayo
•
•
•
•
•
•
El primer debe ser diseñado para que termine justo en el 5´ del SNP, es decir,
justo antes de la base a determinar.
Tm > 50ºC (la reacción es más eficiente).
Puede ser diseñado tanto en la cadena forward (directa) como en la reverse
(reversa). Se recomienda chequear la secuencia en la web
http://bioinfo.math.rpi.edu/mfold/dna/forml.cgi para ver en que dirección es
más accesible el primer al SNP.
Se debe chequear el primer para evitar la formación de dimeros, hairpins, etc…
La longitud debe estar entre 20-30 nucleótidos y ser purificados mediante
HPLC (sobre todo aquellos > 30 nt).
PCR y Análisis: ¿Simple o Múltiple?
Tm
PCR
RUN
POSICIONES
A
Distinta
Simple
Simple
1
B
Distinta
Simple
Múltiple
2-10*
C
Igual
Múltiple
Múltiple
2-10*
* Primers de diferente longitud
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•
•
Hay dos tipos de multiplex
o En base al tamaño del primer
o En base al color del polimorfismo (solo cuando no sean coincidentes
los genotipos a distinguir)
Para realizar multiplex con primers que tengan igual Tm, estos se diseñan con el
mismo nº de nucleótidos y la diferencia de longitud se consigue mediante la
adicción de colas inespecíficas poliAT en 5´. Se recomienda que los primers
difieran entre si de 4 a 6 nucleótidos (Fig. 4).
D
nnnnnnnnnnnnnNnnnnnnnnnNNnnnnnnnnnnnnNnnnnnnnnnn
A
(AT)4
(AT)8
20nt
20nt
B
A
B
24nts
(AT)12
28nts
(AT)16
20nt
20nt
C
32nts
D
36nts
Cola inespecífica
Electroforesis
No afecta:
Hibridación
Condiciones de PCR
Afecta:
Movilidad
33
25
C
29
37
Tamaño
Locus?
Color
Alelo?
Figura 4. Ejemplo de búsqueda de 4 SNPs en una mismo producto de PCR
•
Para los fragmentos muy pequeños (primers menores de 36 nt) es complicado
predecir la movilidad por lo que es recomendable probarlos previamente por
separado antes de analizarlos junto con otros. Existe para ello el SNaPshot
Primer Focus kit de Applied Biosystem. Lo que se hace es añadir las 4 posibles
bases a los primers a evaluar, lanzar una carrera con ellos y ver si se solapan
entre ellos.
3. GENOTIPADO A GRAN ESCALA
La Unidad de Genómica cuenta con la plataforma OpenArray® que permite llevar a cabo
hasta 3,072 PCRs individuales en una única placa de acero inoxidable. El sistema óptico
combina 6 filtros de excitación (450-670 nm) y 6 filtros de emisión (500-720 nm) que
permiten trabajar con hasta 21 combinaciones de longitudes de onda en una sola carrera
para reacciones en multiplex. Dicha plataforma se basa en la tecnología de las sondas
TAqMan.
El equipo disponible en la Unidad es el Quant Studio 12K Flex (Life Technologies).
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El flujo de trabajo es el siguiente:
Reunión previa con el usuario para diseñar el experimento (nº SNPs, nº
muestras,…)
Preparar las placas de 384 pocillos en el caso de que el usuario no traiga las
muestras en el formato adecuado.
Preparar la placa de genotipado TaqMan OpenArray con la ayuda del equipo
Acuffil.
Realizar la PCR en el equipo Quant Studio 12K Flex y obtener las imágenes de las
amplificaciones
Analizar los datos de las carreras, con el programa AutoCaller Software
4. INFORMACIÓN ADICIONAL
El Servicio pone a disposición de los usuarios la asesoría científica-técnica necesaria
para ser usuarios de este Servicio así como para la optimización de cualquier técnica
compatible con la instrumentación científica disponible en la Unidad de Genómica. En
caso de dudas sobre cualquier punto, pueden ponerse en contacto con la Unidad a través
de nuestro teléfono o e-mail.
957 21 85 87 o genomica@uco.es
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