GUIA DE USUARIOS DE GENOTIPADO (SNPs) El análisis de polimorfismos de una sóla base (SNPs) se puede realizar mediante diversas técnicas. Según los equipos existentes en la Unidad, las posibilidades son las siguientes: 1) Análisis de SNPs mediante los kits SNaPshot (SBE/Minisecuenciación) y SNPlex de Applied Biosystems (analizadores genéticos multicapilares). 2) Discriminación alélica mediante Sondas Taqman (Real-Time PCR 7500Fast de AB). 3) Screening a gran escala mediante D-HPLC (Varian) que permite detectar cualquier variación en la secuencia de DNA (SNPs, deleciones, inserciones, etc…). Las dos primeras son factibles de utilizar siempre que el SNP sea conocido. Por el contrario, la principal ventaja de la técnica de D-HPLC es que no requiere conocimiento previo de la región a estudiar. Para detectar los tres genotipos se puede emplear las dos primeras, la tercera solo permite detectar homocigoto/heterocigoto. 1. Primer Extension Analysis: SNaPshot kits, ddNTP* = Minisecuenciación = Single Base Extensión (SBE). Se basa en el uso de cebadores específicos (sin marcar) adyacentes a la base a determinar. SNP Primer Figura 1. Diseño de Primer para SNaPshot. Molde Se realiza una reacción de PCR sólo con los 4 didesoxinucleótidos marcados cada uno con un fluoróforo diferente sobre el molde de DNA previamente amplificado y purificado (pueden ser uno o varios los moldes a analizar en una sola reacción de SNaPshot) Terminadores (dideoxi), cada uno marcado con un fluorocromo diferente (más la polimerasa, buffer, etc…) Molde DNAamplificadopurificado Primer AmpliTaq FS Figura 2. Reacción de Primer Extensión (Kit SNaPshot). -1- La detección de la base incorporada revela la presencia/ausencia de polimorfismo y el genotipo. Color=Genotipo Figura 3. Electroforesis y Análisis de Reacción de SNaPshot. 1.1. Diseño del ensayo. El primer debe ser diseñado para que termine justo en el 5´ del SNP, es decir, justo antes de la base a determinar. Tm > 50ºC (la reacción es más eficiente). Puede ser diseñado tanto en la cadena foward (directa) como en la reverse (reversa). Se recomienda chequear la secuencia en la web http://bioinfo.math.rpi.edu/mfold/dna/forml.cgi para ver en que dirección es más accesible el primer al SNP. Se debe chequear el primer para evitar la formación de dimeros, hairpins, etc… La longitud debe estar entre 20-30 nucleótidos y ser purificados mediante HPLC (sobre todo aquellos > 30 nt). PCR y Análisis: ¿Simple o Múltiple? Tm PCR RUN POSICIONES A Distinta Simple Simple 1 B Distinta Simple Múltiple 2-10* C Igual Múltiple Múltiple 2-10* * Primers de diferente longitud Hay dos tipos de multiplex o En base al tamaño del primer o En base al color del polimorfismo (solo cuando no sean coincidentes los genotipos a distinguir) Para realizar multiplex con primers que tengan igual Tm, estos se diseñan con el mismo nº de nt y la diferencia de longitud se consigue mediante la adicción de colas inespecíficas poliAT en 5´. Se recomienda que los primers difieran entre si 4’6 nt (Fig. 4). -2- D nnnnnnnnnnnnnNnnnnnnnnnNNnnnnnnnnnnnnNnnnnnnnnnn A (AT)4 (AT)8 B C 20nt A 24nts (AT)12 20nt B 28nts (AT)16 C 32nts 20nt D 36nts Cola inespecífica Electroforesis No afecta: Hibridación Condiciones de PCR Afecta: Movilidad 33 25 20nt 29 37 Tamaño Locus? Color Alelo? Figura 4. Ejemplo de búsqueda de 4 SNPs en una mismo producto de PCR • Para los fragmentos muy pequeños (primers menores de 36 nt) es complicado predecir la mobilidad por lo que es recomendable probarlos previamente por separado antes de correrlos juntos. Existe para ello el SNaPshot Primer Focus kit de Applied Biosystem. Lo que se hace es añadir las 4 posibles bases a los primers a evaluar, lanzar una carrera con ellos y ver si se solapan entre ellos 1.2. Requisitos de las muestras. El usuario puede entregar las reacciones de SNPs ya preparadas para la electroforesis capilar o los productos de PCR previamente purificados (SAP y ExoI) (indicar en el formulario de solicitud). El producto de PCR, siempre que sea posible, debe tener una longitud mínima de 300 pb. Cuantificar los productos de PCR en un gel de agarosa y entregar un volumen minimo de 10 l (más de5 ng/l). Como se detallaba en el diseño del experimento, los cebadores deben haber sido purificados mediante HPLC, de longitud comprendida entre 20 y 30 nt y a una concentración de 2 µM. 1.3. Entrega de muestras. El envío de las muestras puede realizarse de alguna de las siguientes formas: Servicio de mensajería con portes pagados a Unidad de Genómica. Universidad de Campus de Rabanales. Edificio Ramón y Cajal. 14071.Córdoba.Tel: 957-218587 e-mail: genomica@uco.es la dirección: Córdoba. 3ª Planta. -3- Entrega directa en la Unidad. Para la solicitud del Servicio de Análisis de SNPs el horario de recepción de muestras será de 9 a 14 horas los días laborables. Las muestras deberán de ir acompañadas del “formulario de solicitud” (ver apartado de Formularios y Manuales) correspondiente debidamente cumplimentada y el cual debe ser remitido a la Unidad vía e-mail (genomica@uco.es). 1.4. Entrega de resultados. Los resultados se pueden enviar en formato electrónico a través de e-mail o en disco. En este último caso, el soporte informático deberá ser suministrado junto con las muestras y podrá ser recogido en la Unidad o ser enviado a portes debidos a la dirección que se indique. Las muestras de análisis de fragmentos serán conservadas durante un mes. En caso de que el usuario quiera recuperar dichas muestras podrá hacerlo personándose en la Unidad dentro del plazo. Programas para visualizar los ficheros: Si el usuario no dispone de los softwares de análisis específicos (GeneScan, Genotyper o GeneMapper), existe en la Unidad un ordenador con dichos programas y a disposición del usuario que lo solicite. 4.INFORMACIÓNADICIONAL. El Servicio pone a disposición de los usuarios la asesoria científica-técnica necesaria para ser usuarios de este Servicio asi como para la optimización de cualquier técnica compatible con la instrumentación científica disponible en la Unidad de Genómica. En caso de duda, aclaratorias sobre cualquier punto, etc... puede ponerse en contacto con la Unidad a través de nuestros teléfonos o e-mail. 957 21 85 87 o genomica@uco.es -4-