b) Determinación de HPV. Aprobados, No aprobados por la FDA

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Métodos de determinación del virus del papiloma
humano (HPV) en cribado de cáncer de cérvix
Beatriz Bellosillo
Servicio de Anatomía Patológica
Hospital del Mar, Barcelona
Virus del Papiloma Humano- HPV
– El virus del Papiloma pertenece a
un grupo diverso de virus DNA
– infectan a piel y a membranas
mucosas de humanos y una
variedad de animales
– cerca de 150 tipos de papilomavirus
afectan a humanos
– 40 de ellos se localizan en el tracto
ano-genital, y pueden ser:
• alto riesgo
• bajo riesgo
Virus del Papiloma Humano- HPV
•El HPV se infecta por transmisión sexual, un 80% de las
mujeres podrían haber sido infectadas por al menos un
tipo de HPV antes de cumplir los 50 años
•A menudo no se observan síntomas, especialmente en el
caso de HPV de alto riesgo
•Mayoría de las infecciones de HPV son transitorias y
asintomáticas y se solucionan sin tratamiento. El 91/%
puede revertirse en dos años
•Otras permanecen en estado latente durante largos
periodos
•La mujeres con riesgo de cancer de cérvix son aquellas
en las que persiste la infección de un HPV de alto riesgo
(HR)
Clasificación de ensayos para determinación de HPV
Hibridación de
ácidos nucleicos
Hibridación + Amplificación
de señal
Southern Blot
Hibridación in situ
Hybrid Capture®2 (hc2)
Hibridación dot blot
Cervista®HPV
Ensayos aprobados por la FDA para determinación de HPV
Amplificación de
ácidos nucleicos
PCR
PCR-RFLP
PCR en tiempo real
Secuenciación
Microarray
COBAS®4800
Abbott real time
PapilloCheck®
CLART HPV 2®
INNO-LiPA®
Linear Array®
MCHA®
PreTect®Proofer
APTIMA®HPV Assay
FlowChip®
Clasificación de ensayos para determinación de HPV
Hibridación de
ácidos nucleicos
Hibridación + Amplificación
de señal
Southern Blot
Hibridación in situ
Hybrid Capture®2 (hc2)
Hibridación dot blot
Cervista®HPV
Ensayos aprobados por la FDA para determinación de HPV
Amplificación de
ácidos nucleicos
PCR
PCR-RFLP
PCR en tiempo real
Secuenciación
Microarray
COBAS®4800
Abbott real time
PapilloCheck®
CLART HPV 2®
INNO-LiPA®
Linear Array®
MCHA®
PreTect®Proofer
APTIMA®HPV Assay
FlowChip®
Clasificación de ensayos para determinación de HPV
Hibridación de
ácidos nucleicos
Hibridación + Amplificación
de señal
Southern Blot
Hibridación in situ
Hybrid Capture®2 (hc2)
Hibridación dot blot
Cervista®HPV
Ensayos aprobados por la FDA para determinación de HPV
Amplificación de
ácidos nucleicos
PCR
PCR-RFLP
PCR en tiempo real
Secuenciación
Microarray
COBAS®4800
Abbott real time
PapilloCheck®
CLART HPV 2®
INNO-LiPA®
Linear Array®
MCHA®
PreTect®Proofer
APTIMA®HPV Assay
FlowChip®
Hybrid Capture®2 (hc2)
DNA de HPV
Unión de sondas de RNA
que hibridan con DNA de
HPV
Unión de Ac que
reconocen los híbridos
DNA- RNA
Unión de Ac secundario
Emisión de luz
Formación de hídridos
DNA-RNA
Test Cervista™ HPV HR
Resumen del Flujo de trabajo
MAGNET
Botón celular
Alícuota 2ml de
muestra desde el Vial
Extracción Agencourt
Preparación de
la Reacción
Incubación
Leer & Analizar
Cervista®HPV
Clasificación de ensayos para determinación de HPV
Hibridación de
ácidos nucleicos
Amplificación
de señal
Southern Blot
Hibridación in situ
Hybrid Capture®2 (hc2)
Hibridación dot blot
Cervista®HPV
Amplificación de
ácidos nucleicos
PCR
PCR-RFLP
PCR en tiempo real
Secuenciación
Microarray
COBAS®4800
Abbott real time
PapilloCheck®
CLART HPV 2®
INNO-LiPA®
Linear Array®
MCHA®
PreTect®Proofer
APTIMA®HPV Assay
FlowChip®
La reacción en cadena de la polimerasa
• Amplificación de secuencias específicas de DNA
• Diseño de dos oligonucleótidos “primers”
complementarios a los extremos del fragmento
a amplificar y que actúan como cebadores de la
reacción
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
1- Desnaturalización
94ºC-96ºC
2- Hibridación
55ºC-70ºC
3- Extensión
72ºC
Original DNA target region
Thermal cycle
Thermal cycle
En 32 ciclos, al 100% de eficiencia, se crean
1.07 billones de copias del ADN de interés
Detección de HPV mediante PCR
CLART® HPV2
tubo
microarray
FLOWCHIP®
cobas® 4800
cobas x 480
Configuración
Equipo para la
extracción de ácidos
nucléicos
cobas z 480
PCR en tiempo real
cobas® 4800
 Kit multiplex cualitativo en un único tubo para la detección simultánea de14
genotipos de alto riesgo e identificación de los tipos 16 & 18 de HPV con ßglobina como control interno
 4 canales de detección para medir los diferentes objetivos
31, 33, 35, 39,
45, 51, 52, 56,
58, 59, 66, 68
– Canal 1 = panel AR HPV l (12 de 14 tipos de alto riesgo
– Canal 2 = HPV genotipo 16
GT
18
– Canal 3 = HPV genotipo 18
High
HR
Risk
Panel
– Canal 4 = beta-globin
GT
18
GT
16
 Diferentes tipos de muestra
– PreservCyt
– cobas® PCR media
HPV
HR
16
18
Cont
Ch1
Ch2
Ch3
Ch4
APTIMA®HPV Assay
HPV assay
Targeted HPV
genotypes
Detection technology
DNA/RNA,
target HPV
gene
Controls
Certificates
13 HR
Sandwich capture
molecular
DNA,
whole
genome
Batch control for
process
FDA, IVD, CE
14 HR
Signal amplification
DNA,
whole
genome
Sample by sample
Reaction HIST2H2BE
for sample sufficiency
FDA, IVD, CE
13 HR + 22 LR
Polymerase chain
reaction/
DNA, L1
Sample by sample
hCFTR microarray
gene for
sample sufficiency
IVD, CE
18 HR + 18 LR
PCR + dot blot
DNA
Sample by sample
housekeeping gene
for sample sufficiency
IVD, CE
14 HR
Real-time polymerase
chain
DNA, L1
Sample by sample
reaction b-globin for
sample
sufficiency
FDA, IVD, CE
14 HR
MMLV reverse
transcriptase and T7
RNA polymerase
mediated amplification
RNA,
E6/E7
Spiked control for
sample process
validity
FDA, IVD, CE
Hybrid Capture 2
Cervista
CLART
Flow CHIP
Cobas
APTIMA
5064 muestras- 33.2% positivas con ≥ 1 técnica (41% positivas con los 4 ensayos).
Menos concordancia en : Mujeres mayores (>30 años): 30% vs 49%
Muestras cribado primario (29%) vs muestras de seguimiento (38%)
Citología normal (22%) vs mujeres con citología anormal (68%)
Rebolj et al, PLOS One, January 2014
Elección de los ensayos de detección
de HPV – requisitos a considerar
- Sensibilidad clínica adecuada
- Controles internos (evitar falsos negativos)
- Procesamiento de elevado número de muestras
- Automatizable
- Tiempos de respuesta adecuados
- Genotipado – no es imprescindible en estos
momentos
Servei de Patologia
Francesc Alameda
Mercè Muset
Belén Lloveras
Sergi Serrano
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