Ensayos de cuantificación de carga viral VIH-1. El

Ensayos de cuantificación de carga viral VIH-1.
El desarrollo de técnicas moleculares de laboratorio nos ha permitido la detección y
cuantificación de las moléculas de ARN de VIH-1 en sangre periférica y en otras
muestras biológicas.
La cantidad de ARN de VIH-1 presente en plasma, a la que denominamos carga viral,
es un factor pronóstico de evolución a sida y muerte independiente de la cifra de
linfocitos CD4 [1-3]. En un estudio promovido por los Centers for Disease Control
(CDC), la cifra de CD4 era el principal factor de predicción del riesgo de desarrollar una
infección oportunista, pero el riesgo relativo era de 1,6-3,5, en función de la carga viral,
respecto a los pacientes que tenían menos de 400 copias/ml [3]. Entre los pacientes
incluidos en la cohorte MACS, en estadios iniciales, la carga viral y las cifras de CD38
fueron factores de predicción más potentes de evolución a sida que los CD4; con
posterioridad, los CD4 aumentaron su importancia como factor pronóstico [4].
La determinación de la carga viral de VIH-1 en plasma ha demostrado su utilidad como:

factor de predicción del riesgo de progresión a SIDA o muerte;

guía para el inicio del tratamiento antirretroviral, junto con el recuento de
CD4 y la clínica;

indicador principal de la eficacia del tratamiento antirretroviral;

parámetro para la evaluación de la eficacia de nuevos fármacos
antirretrovirales;

medio útil para comparar la potencia relativa de diferentes tratamientos;

sospecha de aparición de resistencias y posible indicación de cambio en la
terapia;

indicador intermedio de interacciones farmacológicas significativas;

control de cumplimiento del tratamiento;

evaluación del riesgo de transmisión, sobre todo materno-fetal;

detección del virus en neonatos y en primoinfección, aunque debe
confirmarse posteriormente;

mejor conocimiento de la cinética viral en diversos compartimientos del
organismo;

identificación de reservorios.
Métodos de cuantificación de la carga viral
Las pruebas comerciales están diseñadas para la cuantificación del ARN vírico en
muestras de pasma. La mayoría están basadas en la detección del ADN
complementario al ARN vírico (ADNc), que ha sido obtenido por un proceso de
transcripción inversa de dicho ARN. El ADNc es inmediatamente amplificado mediante
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; “Polymerase Chain Reaction”). El ácido
nucleico amplificado se denomina amplicón. Las primeras pruebas comerciales como el
test COBAS® Amplicor HIV-1 Monitor (Roche Diagnostics) cuantificaban el ARN a partir
del amplicón acumulado tras la reacción de PCR. Actualmente, este tipo de pruebas
han sido sustituidas por otras como: COBAS® TaqMan HIV-1 Test (Roche Molecular
Systems), RealTime HIV type 1 (HIV-1) assay (Abbott Diagnostics), VERSANT® HIV-1
RNA 1.0 kPCR Assay (Siemens Healthcare Diagnostics) y NucliSens Easy Q HIV-1
(BioMerieux Inc.), en las que la amplificación y cuantificación de los ácidos nucleicos
(ADN o ARN) se realiza mediante la técnica de PCR a tiempo real, utilizando sistemas
cada vez más automatizados que permiten la cuantificación más exacta y en menos
tiempo sin necesidad de métodos laboriosos.
La técnica de PCR a tiempo real cuantitativa permite amplificar y cuantificar
simultáneamente el ADN o el ARN amplificado, ya que utiliza cadenas de
oligonucleótidos marcados fluorescentemente que detectan y se unen al amplicón en
cuanto aparece. Los oligonucleotidos que utilizan las pruebas comerciales VIH-1 suelen
ser de dos tipos: las sondas tipo Taqman y los llamados “molecular bacon”. Las
sondas tipo Taqman son oligonucleotidos que contienen dos moléculas fluorocromos
unidas a cada uno de sus extremos. La molécula de un extremo emite fluorescencia y
la otra del otro extremo (el “quencher”) absorbe la emisión de la anterior. Cuando la
sonda se une al amplicón, la actividad exonucleasa de la polimerasa que interviene en
la amplificación del ADNc elimina el “quencher” de la sonda y, en consecuencia, el
fluorocromo emite una señal fluorescente que es detectada por un instrumento
analizador. Los “molecular bacon” se caracterizan por ser oligonucleótidos de cadena
simple con extremos complementarios capaces de unirse formando una horquilla. En
los extremos de la horquilla se encuentran el fluorocromo y el “quencher”. Cuando la
horquilla está cerrada el quencher absorbe fluorescencia emitida por el fluorocromo. En
presencia del amplicón, la horquilla se abre para unirse al ADN o ARN amplificado y
queda desbloqueada la emisión de fluorescencia, la cual es detectada por el
instrumento analizador.
El sistema empieza a detectar la señal de fluorescencia asociada al incremento
exponencial del amplicón. Existe una relación cuantitativa entre la cantidad inicial de
ácido nucleico y la cantidad de amplicón producido en un ciclo determinado. La
utilización de estándares externos de concentración conocida permiten la preparación
de curvas patrón en las que extrapolar el valor de la señal obtenido en cada muestra
para poder calcular su concentración de carga viral (copias/mL o en unidades
internacionales (IU, “International units”)). La mayoría de pruebas comerciales
contienen, además, estándares internos que se colocan junto a cada muestra en el
mismo tubo desde el inicio de la prueba y con las que se puede controlar las
variaciones del análisis de tubo a tubo
Otras pruebas comerciales de cuantificación de la carga viral han fundamentado la
cuantificación del ARN vírico en la amplificación y detección de la señal emitida, en
lugar de amplificar el ácido nucleico; como es el caso de Versant HIV-1 RNA 3.0 Assay
(b-DNA), aunque este tipo de técnicas terminará siendo sustituido por las pruebas
basadas en la PCR a tiempo real.
Actualmente, los laboratorios pueden disponer de las siguientes pruebas comerciales:

COBAS® TaqMan HIV-1 Test (Roche Molecular Systems)

RealTime HIV type 1 (HIV-1) assay (Abbott Diagnostics)

VERSANT HIV-1 RNA 1.0 kPCR Assay (Siemens Healthcare Diagnostics)

NucliSens Easy Q HIV-1 (BioMerieux Inc.)

®
Versant HIV-1 RNA 3.0 Assay (b-DNA, Siemens Healthcare Diagnostics).
®
COBAS TaqMan HIV-1 Test (Roche Molecular Systems)
La prueba COBAS® TaqMan HIV-1 permite detección cuantitativa de ARN del VIH-1 en
plasma de pacientes infectados, en un rango de 47 – 10.000.000 copias/mL, mediante
la detección de la amplificación de ADNc por PCR a tiempo real [5]. Este test ha sido
validado para la cuantificación de los virus del grupo M (subtipos A-H) y los virus
recombinados (CRF, Circulating Recombinant Form) de los tipos CRF01_AE.
Esta prueba sustituye al anterior COBAS® Amplicor assay. COBAS® TaqMan HIV-1
está basada en tres procesos principales: (1) la preparación de las muestras para
obtener el ARN del VIH-1, que puede realizarse de forma automatizada con el sistema
COBAS AmpliPrep; (2) la transcripción reversa automática de una región del ARN del
VIH-1 para generar ADNc; (3) la amplificación del ADNc, con iniciadores
complementarios específicos (“primers”) que definen una secuencia altamente
conservada del gen gag del VIH-1, y la detección del amplicón con sondas de tipo
Taqman se realiza simultáneamente. Además, dispone de un estándar interno de
cuantificación llamado QS que se coloca en la muestra en que se desea cuantificar la
carga viral. El QS es ARN no infeccioso, con regiones de unión a iniciadores idénticas a
las del ARN del VIH-1 y una región exclusiva de unión a sonda que permite distinguir el
producto amplificado del QS del producto amplificado procedente del VIH-1. El
analizador COBAS Taqman calcula la concentración del VIH-1 en las muestras de la
prueba, comparando la señal procedente de la amplificación del VIH-1 con la señal del
QS para cada muestra y control. El QS compensa los efectos de inhibición que
pudieran producirse y controla los procesos de preparación y amplificación para
permitir la determinación cuantitativa exacta de ARN del VIH-1 en cada muestra.
Actualmente se está evaluando un nueva versión de esta prueba desarrollada por
Roche, se trata de la prueba COBAS® TaqMan HIV-1 v 2.0. Esta versión se
caracteriza por utilizar iniciadores que flanquean regiones del gen gag y del extremo
altamente repetitivo (long terminal repeat, LTR). Esto le permite aumentar el rango de
amplificación de 20 - 10.000.000 copias/ml. Este ensayo demostrado una mejora en la
sensibilidad respecto a la versión anterior, una aceptable precisión [6]
RealTime HIV type 1 (HIV-1) assay (Abbott Diagnostics)
RealTime HIV type 1 (HIV-1) assay es una prueba también automatizada que permite
la cuantificación del ARN del VIH-1 en muestras de plasma de pacientes infectados, en
un rango de 40 a 10.000.000 copias/mL. Detecta y cuantifica la carga viral de un amplio
grupo de virus, grupo M (subtipos A – H), el grupo O y el grupo N [7]. La extracción de
los ácidos nucleicos puede realizarse de forma automatizada con el instrumento
m2000sp. Los iniciadores y las sondas van dirigidos a reconocer la integrasa, una
región muy conservada del gen pol. La sonda que utiliza consiste en un fragmento de
ADN de doble cadena con diferentes tamaños. El fragmento largo de la cadena es
complementario a una región del ADNc objeto de amplificación y lleva unida una
molécula fluorescente. El fragmento corto contiene la molécula de extición, el
“quencher”. Cuando el ADNc está presente se produce la hibridación del ADNc con el
fragmento largo de la sonda y se genera una señal que es detectada por el analizador
m2000rt.
®
VERSANT HIV-1 RNA 1.0 kPCR Assay (Siemens Healthcare Diagnostics)
Se trata de un ensayo para la cuantificación del ARN de VIH-1 en muestras de plasma
de pacientes infectados por VIH-1, en un rango de 37 – 11.000.000 copias/mL y que
ha sido validado para la cuantificación de los virus del grupo M (subtipos A-G), los virus
recombinados de los tipos AE y AG, y los virus del grupo O [8]. La extracción de los
ácidos nucleicos ARN y ADN de las muestras de plasma se realiza mediante un
sistema basado en bolas magnéticas en un proceso automatizado que permite analizar
96 muestras en 2 horas y 45 minutos (Hamilton STARlet instrument). Antes de iniciar la
transcripción inversa del ARN vírico a ADNc se procede a la degradación del posible
ADN contaminante presente en la muestra utilizando el enzima uracil N glycosylase. La
transcripción inversa del ARN y la amplificación de una región muy conservada de la
integrasa en gen pol del ADNc se realizan simultáneamente a partir del ARN del virus y
de un estándar interno de cuantificación mediante el proceso de PCR a tiempo real, de
forma automatizada (Agilent MX3005 Instrument). Las posibles mutaciones en el gen
de la integrasa que pudieran contener los virus no afectarían a la detección y
cuantificación de la carga viral [9,10].
NucliSens Easy Q HIV-1 (BioMerieux Inc., Boxtel, Netherlands)
Esta prueba permite la cuantificación directa del ARN del VIH-1 a partir de muestras de
plasma y de gotas de sangre seca recogidas en papel de filtro, en un rango de 10 –
10.000.000 copias/mL, de todos los virus del grupo M (A, B, C, D, F, G, H, J) y los
recombinantes CRF01_AE and CRF02_AG [11]. La extracción de los ácidos nucleicos
(ARN y ADN) se efectúa mediante un sistema de bolas sílica que puede hacerse
automatizadamente con el instrumento NucliSENS® easyMAG®. Esta prueba, a
diferencia de las pruebas comerciales anteriormente descritas, amplifica y cuantifica a
tiempo real el ARN amplificado a partir del ARN vírico y sustituye a la prueba comercial
de primera generación Nuclisens HIV-1 QT. La amplificación del ARN la efectúa gracias
a un sistema de amplificación isotérmica diseñado por NASBA [12]. Esta prueba utiliza
horquillas marcadas o “molecular bacons”, en lugar de sondas, para detectar el
amplicón. En uno de los extremos de la horquilla contiene el fluorocromo
carboxyfluoresceine (FAM) y se une específicamente al ARN del VIH-1; el del otro
extremo contiene la molécula carboxy-X-rhodamine (ROX) y se une al estándar de
cuantificación o calibrador. La fluorescencia producida se monitoriza mediante un
sistema automatizado (NucliSens EasyQ Analyzer). La técnica de realiza en un tubo
cerrado, lo cual disminuye el riesgo de contaminación de la prueba. El tiempo necesario
es inferior a dos horas. Varios estudios han evidenciado una buena correlación con la
cuantificación mediante otros métodos de detección [13,14]..
Versant HIV-1 RNA 3.0 bDNA base-Assay (Siemens Healthcare Diagnostics Inc.,
Tarrytown, NY)
Esta prueba permite la cuantificación del ARN viral en muestras de plasma de
pacientes infectados, en un rango de 75 a 500.000 copias/ml de virus del grupo M (AG). Cuantifica directamente el ARN vírico sin la necesidad de realizar una amplificación
del ADNc, ya que se basa el la amplificación de la señal de detección [15]. Para ello,
después de efectuar la extracción de los ácidos nucleicos de las muestras de plasma
de los pacientes infectados por el VIH-1, el material se traslada a placas que contienen
un conjunto sondas de captura especiales para unirse ARN vírico. Este conjunto de
sondas de captura (> 80) están formadas por oligonucleótidos sintéticos específicos
que reconocen una amplia región del gen pol del VIH-1. Para conseguir una óptima
hibridación entre las sondas de captura y el ARN vírico se requiere un periodo de
incubación largo (overnight). Un segundo tipo de sondas, las sondas diana, se hibridan
al ARN viral y a las sondas del amplificador. Un tercer tipo de sondas, las sondas del
amplificador, se hibridan con el preamplificador, formando complejos de ADN
ramificado. Finalmente, se añaden un cuarto tipo de sondas marcadas con fosfatasa
alcalina y se incuban en un sustrato quimioluminiscente. La cantidad de señal
detectada por el analizador es proporcional a la cantidad de virus en la muestra. La
concentración de virus se establece a partir de una curva patrón definida por la emisión
de luz de la muestra, comparándola con la emisión que producen las muestras
estándares de concentraciones conocidas de virus. La inclusión de más de 80 sondas
de ácidos nucleicos que reconocen a varias zonas del gen pol permite la cuantificación
de subtipos no B dentro del grupo M.
En la Tabla 1 se resumen las características más importantes de los ensayos de
cuantificación de la carga viral que están comercializados en la actualidad.
Tabla 1. Características de los ensayos comerciales.
COBAS®
TaqMan HIV-1
Test (Roche)
RealTime HIV
type 1 (HIV-1)
assay
(Abbott )
RealTime HIV
Plasma
(citrato y
EDTA)
VERSANT®
HIV-1 RNA 1.0
kPCR Assay
(Siemens )
kPCR
Plasma
(citrato y
EDTA)
NucliSens EQ
Plasma, sangre
seca en filtro y
tejidos
NucliSens
Easy Q HIV-1
(BioMerieux )
Versant HIV-1
RNA 3.0 Assay
(b-DNA).
(Siemens )
b-DNA
Abreviación
CAP/CTM HIV-1
Tipo de muestra
(anticoagulante)
Plasma (citrato y
EDTA)
Volumen de muestra
(mL)
0.5 -1
0,6 - 1
0.2 - 1
0.6
1
Método de extracción
(Instrumento)
Automática
(COBAS
AmpliPrep)
RNA
Automática
(m2000sp)
RNA
Automática
(Hamilton
STARlet)
ARN y ADN
Automática
(Easy Mac)
ARN y ADN
No extracción y
purificación de
ácidos nucleicos
Amplificación de
la señal bDNA
(Versant 340 y
Versant 440
molecular
systems)
pol
Método amplificación
(Instrumento)
RT-PCR Tiemporeal
(COBASTaqman)
RT-PCR
Tempo-real
(m2000rt)
kPCR
(Agilent
X3005)
PCR isotérmica
NASBA
Tempo-real
(NucliSSENS)
Regíon del genoma del
VIH-1 amplificada
gag
Pol-integrasa
Pol
gag
Sondas
Sonda Taqman
Rango de linearidad
(copias/mL)
47 – 10.000.000
Subtipos detectados
Grupo M (A-H),
CRF01_AE
Número de muestras
procesables
simultáneamente
Duración completa del
proceso (horas)
Sondas de
doble cadena
truncadas
40 –
10.000.000
Grupo M (A-D,
F-H),
CRF01_AE y
CRF02_AG, ;
Grupo O y
Grupo N
Sonda Taqman
35 –
11.000.000
Grupo M (A-D,
F-H, K),
CRF01_AE y
CRF02_AG,
CRF06_cpx;
Grupo O
Plasma
(citrato y EDTA)
Horquillas
“molecular
bacon”
10 –
10.000.000
50 –
500.000
Grupo M (A-D,
F-H, J)
Grupo M (A-D,
F-G)
bDNA
48
96
96
48
96
6
6
6
4
24
Los estudios comparativos realizados entre las diferentes pruebas comercializadas de
cuantificación muestran un alto grado de acuerdo. Las mayores discrepancias se
suelen observar en los niveles bajos de carga viral y en la detección de virus del
subtipo No-B [9,10,13,14,16]. Debido a la variabilidad biológica en un mismo sujeto a lo
largo de la enfermedad y a la relacionada con la propia técnica, las variaciones de la
carga viral superiores a 0,5 log10 se consideran clínicamente significativas.
La diversidad genética del VIH-1 representa un desafío para el desarrollo de pruebas
capaces de detectar y cuantificar de manera fidedigna a todas las variantes del virus.
En Europa y Norteamérica, la mayoría de los pacientes están infectados por el subtipo
B. En otras partes del mundo, las infecciones por subtipos no B del grupo M son más
frecuentes e incluso mayoritarias. En España, entre los años 2000 y 2009, se ha
observado un incremento de la prevalencia de los subtipos no-B y de virus
recombinados (CRF) del grupo M [17,18] . Las infecciones por los grupos O y N son
excepcionales.
Las pruebas comerciales de cuantificación de la carga viral están diseñadas para la
detección de VIH-1 del subtipo B, pero también pueden detectar otros subtipos e
incluso formas recombinantes del grupo M aunque con menor eficacia. Algunos
estudios comparativos han analizado el grado de acuerdo de las distintas pruebas
comerciales para detectar y cuantificar la carga viral en muestras de pacientes
infectados con subtipos no-B del VIH-1. Las mayores discrepancias se observaron en
las muestras portadoras del subtipo G o de la forma recombinante CFR02-AG. En los
casos en que eran detectados observaron discrepancias de > 1 log10 y de > 0,5 Log10,
cuando las pruebas eran comparadas dos a dos [16,19].
Como alternativa a las pruebas comerciales anteriormente descritas se ha evaluado
dos nuevas pruebas comerciales de bajo coste: el test ExavirLoad v2 (Cavidi) y el test
Generic HIV viral load (Biocentric). ExavirLoad v2 mide la actividad del enzima de
transcripción inversa del VIH-1 en la conversión del ARN a ADNc a partir de muestras
de plasma y la compara con una curva patrón. Generic HIV viral load (Biocentric) está
basada en la técnica de PCR a tiempo real que amplifica una región conservada de los
extremos altamente repetitivo (LTR) del VIH-1. Ambas pruebas presentaron una buena
correlación con COBAS® Amplicor assay, aunque con ExavirLoad v2 se obtuvieron
más resultados falsos positivos y algunas limitaciones en la detección de subtipos que
con Generic HIV viral load [20]
Cuantificación de la carga viral en muestras biológicas diferentes al plasma
La cuantificación de la carga viral suele realizarse en muestras de plasma, pero la
sangre no es el único compartimento anatómico donde se puede detectar el VIH-1. El
virus replica en el interior de las células y puede llegar a otros compartimentos a través
de la sangre formando reservorios de células infectadas con el virus en estado de
latencia o con replicación persistente, que en muchas ocasiones evolucionan de
manera distinta a los virus circulantes en sangre [21,22]. Las técnicas de biología
molecular han permitido la detección del VIH-1 en muestras procedentes de diferentes
lugares anatómicos como el semen, lavado vaginal, frotis, tejido linfoide y líquido
cefaloraquídeo; [23]. La cuantificación de la carga viral en este tipo de muestras no es
muy frecuente y requiere la utilización de métodos caseros y la modificación de las
pruebas comercializadas. La carga viral en estos compartimentos de puede ser un
marcador subrogado de la infecciosidad en la transmisión sexual y en la transmisión
materno-fetal, y de la eficacia del tratamiento antirretroviral.
Detección en fluidos genitales
Algunos estudios han demostrado que los niveles de la carga viral en el plasma están
correlacionados con los niveles de carga viral en el semen [24]. El semen es uno de los
principales vehículos de transmisión del VIH-1 y es frecuente determinación de la carga
viral en semen durante la reproducción asistida parejas serodiscordantes. Su análisis
requiere la preparación previa de la muestra, ya que el virus puede detectarse en el
plasma seminal y en las células no-espermatozoides, y la adaptación de la prueba
comercial. La mayor parte de estudios se han realizadoadaptando las pruenas de
primera generación COBAS® Amplicor assay y NASBA HIV-QT [25]. Este tipo de
muestras contienen sustancias inhibidoras que dificultan la detección del VIH-1 cuando
se encuentran en concentraciones muy bajas y puede dar lugar a falsos negativos. Se
ha observado que la extracción de los ácidos nucleicos mediante los métodos basados
en la sílica incrementa la sensibilidad de las pruebas comerciales [26].
En el aparato genital femenino se han observado diferencias significativas en la carga
viral en diferentes fases del ciclo menstrual. Se produce una disminución significativa
en la fase periovulatoria y un incremento por encima de las concentraciones
plasmáticas en los períodos premenstrual y menstrual, sin que se acompañe de
cambios en la viremia plasmática [27,28]. También se observa una correlación entre la
cuantificación viral en las secreciones vaginales y de cuello uterino. Se ha descrito una
cuantificación aceptable mediante b-ADN de muestras obtenidas a partir de tampones,
con cifras de carga viral similares a las registradas en el lavado cervicovaginal [29,30].
Detección y valoración en tejido linfoide
La cuantificación de la carga viral en ganglios linfáticos en pacientes que reciben
tratamiento antirretroviral de tipo TARGA ha permitido observar una disminución
significativa de la carga viral tanto en plasma como en células mononucleares de
ganglio linfático; sin embargo, en este último caso es más lenta y se produce una
menor disminución tras unas pocas semanas de tratamiento [31]. La replicación viral
puede persistir incluso a niveles elevados en el tejido linfático, a pesar de mantener una
carga viral indetectable en plasma [32,33]. En todo caso, una terapia subóptima no
consigue disminuir la carga viral a cifras indetectables en el tejido linfático [34].
El tejido linfoide asociado a intestino (GALT, “gut-associated lymphoid tissue”) está muy
implicado en la patogénesis del VIH-1. A diferencia del tejido linfoide de otros
compartimentos anatómicos, el GALT se encuentra de una de entrada del virus en las
etapas iniciales de la infección y en él reside gran número de linfocitos T-CD4 memoria
fuente de replicación del VIH-1, y lo convierte en un gran reservorio de virus. La
infección masiva del GALT conduce a la disfunción de la mucosa favoreciendo la
translocación bacteriana, a cual a su vez contribuye a la activación generalizada de la
respuesta inmune sistémica y a la progresión de la enfermedad. Algunos estudios han
demostrado que la supresión de la carga viral en GALT suele ser más lenta que en
sangre periférica y que no llega a ser completa, lo cual contribuye a la falta de
recuperación de la población de células T-CD4 en este tejido. El inicio del tratamiento
antirretroviral en las fases tempranas de la infección puede tener un efecto más rápido
y duradero en la supresión de la replicación viral en GALT que el inicio del tratamiento
durante la infección crónica y contribuir en la restauración de la población de células TCD4 [35].
La determinación de la carga viral en este tipo de muestras es complicada porque
requiere la realización de una biopsia y porque requiere la modificación de las pruebas
comerciales o caseras. Recientemente se ha publicado que la detección de ARN/ADN
de VIH-1 y de ARN mensajero de células TCD4 en muestras de heces de pacientes
VIH-1 en la fase crónica de la infección es posible, sugiriendo que este tipo de
muestras podría ser útil para el estudio de la pérdida de células T-CD4 del GALT
asociada a la patogéneis del VIH-1 [36].
Detección y valoración líquido cefalorraquideo
La infección del sistema nervioso central por VIH-1 se produce desde las etapas
iniciales de la infección del paciente. La carga viral en el líquido cefalorraquideo (LCR)
esta correlacionada la disfunciones neurocognivas y a la demencia por SIDA [37,38].
Cuantificación de la carga Pro-viral de VIH-1
Tras la infección, el VIH-1 inicia ciclo vital con la transcripción inversa del ARNv a ADN
en el citoplasma formando un complejo de pre-integración (CPI) poco estable. En el
núcleo el CPI se integra en el ADN de la célula huésped de forma estable dando lugar
al provirus. La cuantificación del ADN proviral puede ser útil como medida del
reservorio celular del virus, como marcador de eficacia de la terapia antirretroviral, del
diagnostico precoz de la primoinfección en adultos y en hijos nacidos de madres
seropositivas, y como marcador predictivo de la progresión de la enfermedad [39-42].
El ADN vírico puede encontrarse de diferentes formas en el interior de la célula; como
cadena de ADN simple, de cadena doble lineal, de cadena doble circular o de cadena
doble integrado en el núcleo. Algunos estudios defienden que las formas circulares son
poco estables e indicativas de infección reciente; otros estudios, si embargo, sugieren
que estas formas no son tan inestables y que su número se diluye a medida que la
célula se divide [43,44]. Se han desarrollado diferentes métodos para la cuantificación
del ADN viral (recientemente revisado por Beloukas A y cols [45]). Algunos de estos
métodos están basados en PCR a tiempo real caseros que amplifican una región entre
los 2LTR, o regiones entre el LTR y el gen celular alu, otros se basan en
modificaciones de pruebas comerciales de primera generación como COBAS amplicor
[41,46-48]. En cualquier caso suelen referir las copias de ADN viral a la concentración
de DNA total (microgramos de DNA) o al número de células (106 T-CD4+ o 106 PBMCs
“Periferal Blood Mononuclear Cells”). El rango de copias de ADN proviral en muestras
clínicas obtenido en diferentes estudios empleando diferentes métodos suele estar
entre 2 log10 y 3,5 log10, según el método empleado [45].
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