Estados excitados que producen fluorescencia y fosforescencia

ESPECTROSCOPÍA LUMINISCENTE:
Existen tres tipos de métodos ópticos relacionados entre sí llamados:
fluorescencia y fosforescencia molecular y quimioluminiscencia. En todos ellos,
las moléculas de analíto se excitan para dar una especie cuyo espectro de
emisión suministra información para el análisis cualitativo y cuantitativo
Los métodos se conocen colectivamente como procedimientos luminiscentes
moleculares.
La fluorescencia y la fosforescencia se parecen en que la excitación se consigue
mediante la absorción de fotones. Como consecuencia, con frecuencia se alude a
los dos fenómenos con el término más general de fotoluminiscencia.
La fluorescencia se diferencia de la fosforescencia en que las transiciones
electrónicas responsables de la fluorescencia no conllevan un cambio en el espín
del electrón. Como consecuencia, la fluorescencia presenta una vida corta
cesando la luminiscencia casi inmediatamente (10-5S).
Por el contrario, las emisiones de fosforescencia están acompañadas por un
cambio en el espín del electrón, que hace que la radiación se mantenga durante
un tiempo fácilmente detectable, después de haber acabado la irradiación – a
menudo varios segundos después o más. En la mayoría de los casos, la emisión
fotoluminiscente, tanto si es de fluorescencia como de fosforescencia, es de
mayor longitud de onda que la radiación utilizada para su excitación.
Uno de los aspectos más atractivos de la luminiscencia es su inherente
sensibilidad, con límites de detección que suelen ser de uno a tres órdenes de
magnitud inferiores a los encontrados en la espectroscopia de absorción. Los
límites de detección características son del orden de partes por billón.
Debido a su alta sensibilidad, los métodos luminiscencia cuantitativos suelen
sufrir serios efectos de interferencia procedentes de la matriz de la muestra.
Por esta razón las medidas luminiscentes se suelen combinar con las
extraordinarias técnicas de cromatografía y electroforesis.
En general los métodos luminiscentes se aplican menos que los métodos de
absorción en los analitos cuantitativos debido a que el número de especies que
absorben radiación ultravioleta / visible es mucho mayor que el de especies que
presentan fotoluminiscencia tras la absorción de radiación en esta región del
espectro.
Teoría de la Fluorescencia y de la Fosforescencia
La fluorescencia tiene lugar en sistemas gaseosos, líquidos y sólidos, tanto
sencillos como complejos.
El tipo más sencillo de fluorescencia es el que presentan los vapores atómicos
diluidos. Por ejemplo:
Los electrones 3s de los átomos de sodio vaporizados pueden ser excitados al
estado 3p mediante la absorción de radiación de longitudes de onda de 5 896 a
5 890 Å.
Después de 10-8 a 10-5 s, los electrones vuelven al estado fundamental emitiendo
radiación de estas mismas longitudes de onda en todas las direcciones.
Este tipo de fluorescencia, en la cual la radiación absorbida es reemitida sin
cambio de frecuencia, se conoce como radiación de resonancia o fluorescencia
de resonancia.
Estados excitados que producen fluorescencia y fosforescencia
Para diferenciar entre los fenómenos de fotoluminiscencia se requiere una
revisión del spín del electrón y de los estados excitados singulete / triplete.
- Espín del electrón:
El principio de exclusión de Pauli establece que en un átomo no puede haber
dos electrones con los cuatro números cuánticos iguales. Esta restricción
requiere que no haya más de dos electrones en un orbital, y además, los dos
deben tener los estados de espín opuestos. Cuando esto ocurre, se dice que
los espines están apareados. Debido al apareamiento de espines, la mayoría
de las moléculas no presentan un campo magnético neto y se dice, por tanto,
que son diamagnéticas, es decir, no son atraídas ni repelidas por campos
magnéticos permanentes.
Por el contrario, los radicales libres, que contienen electrones desapareados,
tienen un momento magnético y, consecuentemente, son atraídos cuando se
encuentran en un campo magnético; por ello, se dice que los radicales libres
son paramagnéticos
- Estados excitados singulete/triplete
Un estado electrónico molecular en el cual todos los espines de los electrones
están apareados se llama singulete y cuando la molécula se expone a un
campo magnético no se produce un desdoblamiento de niveles de energía.
Por otro lado, el estado fundamental para un radical libre, es un estado
doblete, porque el electrón impar puede tomar dos orientaciones en un
campo magnético, lo que comunica ligeras diferencias de energía al sistema.
Cuando uno de los electrones de una molécula es excitado a un nivel de
energía superior, se forma un estado singulete o triplete. En el estado
singulete excitado, el espín del electrón promocionado continua apareado con
el electrón del estado fundamental; sin embargo, en el estado triplete los
espiones de los dos electrones se han desapareado y, por tanto, están
paralelos. Estos estados pueden representarse como sigue, donde las flechas
representan la dirección del espín.
Velocidades de absorción y de emisión
La velocidad a la cual se absorbe un fotón de radiación es enorme, el
proceso requiere del orden de 10-15 a 10-14 s. Por otro lado, la emisión
fluorescente, tiene lugar a una velocidad significativamente más lenta. El
tiempo de vida del estado excitado se relaciona inversamente con la
absortividad molar del pico de absorción correspondiente al proceso de
excitación. Por tanto, para absortividades molares comprendidas entre 103
y 105, los tiempos de vida del estado excitado son de 10-9 a 10-7s. Para
sistemas débilmente absorbentes, donde la probabilidad del proceso de
transición es más pequeña, los tiempos de vida pueden ser tan largos como
de 10-6 a 10-5 s. Como se ha señalado, la velocidad promedio de una
transición triplete a singulete es menor que la correspondiente transición
singulete a singulete. Por ello, la emisión fosforescente requiere tiempos
comprendidos entre 10-4 y 10s o superiores
Una molécula excitada puede volver a su
estado fundamental mediante una
combinación de varias etapas mecanísticas.
Como muestran las flechas verticales
rectas de la Figura, dos de estas etapas,
fluorescencia y fosforescencia, conllevan la
emisión de un fotón de radiación. Las otras
etapas de desactivación, indicadas por
flechas onduladas, son procesos no
radiantes. El camino más propicio hacia el
estado fundamental es aquel que minimiza
el tiempo de vida del estado excitado. Por
ello, si la desactivación por fluorescencia es
más rápida que los procesos no radiantes,
se observa tal emisión.
Por otro lado, si la desactivación no
radiante tiene una constante de velocidad
más favorable, la fluorescencia desaparece
o es menos intensa
La fotoluminiscencia está limitada a un número relativamente pequeño
de sistemas que incorporan características estructurales y ambientales
que hacen que la velocidad de los procesos de relajación desactivación
no radiantes se ralenticen hasta el punto en el que la reacción de
emisión puede competir cinéticamente con ellos. La información
referente a los procesos de emisión es suficientemente completa para
permitir un cálculo cuantitativo de estas velocidades. Sin embargo, la
comprensión de los otros caminos de desactivación es, en el mejor de
los casos, rudimentaria; para estos procesos, sólo se pueden realizar
afirmaciones o especulaciones cualitativas sobre las velocidades y los
mecanismos.
Fosforescencia
La desactivación del estado electrónico excitado también puede incluir la
fosforescencia. Después del cruce entre sistemas a un estado triplete
excitado, la desactivación posterior puede tener lugar por conversión
interna o externa o por fosforescencia.
Una transición triplete
singulete es mucho menos probable que una
conversión singulete/singulete; como se ha dicho, el tiempo de vida medio
de un estado triplete excitado respecto a la emisión oscila entre 10-4 y 10 s
o más. Por tanto, la emisión causada por una transición de este tipo puede
persistir durante algún tiempo después que la irradiación se haya
interrumpido.
Las conversiones externas e internas compiten con tanto éxito con la
fosforescencia que este tipo de emisión se observa normalmente sólo a
bajas temperaturas, en medios altamente viscosos o por moléculas que
están adsorbidas sobre superficies sólidas.
Variables que afectan a la fluorescencia y a la fosforescencia
Tanto la estructura molecular como el entorno químico van a influir en que
una sustancia sea o no luminiscente; estos factores también determinan la
intensidad de emisión cuando tiene lugar la fotoluminiscencia.
En este apartado se consideran brevemente los efectos de algunas de estas
variables.
Rendimiento cuántico
El rendimiento cuántico, o la eficacia cuántica, de fluorescencia de
fosforescencia es simplemente la relación entre el número de moléculas
que emiten luminiscencia respecto al número total de moléculas excitadas.
Para moléculas altamente fluorescentes como la fluoresceína, la eficacia
cuántica, bajo determinadas condiciones, se aproxima a la unidad. Las
especies químicas que no presentan una fluorescencia apreciable tienen
eficacias que se aproximan a cero.
INSTRUMENTOS PARA LA MEDIDA DE LA
FLUORESCENCIA Y DE LA FOSFORESCENCIA
Los distintos componentes de los instrumentos para la medida de la
fotoluminiscencia son similares a los que se encuentran en los fotómetros o
espectrofotómetros ultravioleta/visible. La siguiente gráfica muestra una
configuración característica de estos componentes en los fluorómetros y los
espectrofluorímetros. Casi todos los instrumentos de fluorescencia utilizan
ópticas de doble haz tal como se muestra, para compensar las fluctuaciones en
la potencia de la fuente.
Filtro o Monocromador
de excitación
Radiación dispersada
Muestra
Fuente
Filtro o Monocromador
de emisión
Atenuado
rdel haz
Fotomultiplicador
de la muestra
Fotomultiplicador de
referencia
Amplificador
diferencial
Dispositivo de lectura
El haz de la muestra pasa primero a través de un filtro o un monocromador de
excitación, que transmite la radiación que provocará la fluorescencia pero
excluye o limita la radiación de la longitud de onda de la emisión fluorescente.
La fluorescencia se propaga desde la muestra en todas las direcciones pero lo
más conveniente es observar la que forma un ángulo recto con el haz de
excitación; a otros ángulos, la dispersión producida en la disolución y en las
paredes de las cubetas aumenta y se pueden cometer grandes errores en la
medida de la intensidad. La radiación emitida llega a un fotodetector después
de haber pasado por un segundo filtro o monocromador que aísla la
fluorescencia para su medida.
El haz de referencia pasa a través de un atenuador que reduce su potencia a
aproximadamente la de la radiación fluorescente (normalmente la potencia se
reduce en un factor de 100 o más. Las señales procedentes del
fotomultiplicador de la muestra y del de referencia se dirigen a un amplificador
diferencial cuya salida se visualiza en un medidor o en un registro. Algunos
instrumentos de fluorescencia son de tipo nulo; esta condición se consigue con
atenuadores ópticos o eléctricos. Los instrumentos más modernos utilizan un
circuito divisor analógico o un sistema de adquisición de datos digital seguido
de tratamiento de los datos para obtener la relación entre la intensidad de la
emisión fluorescente y la intensidad de la fuente de radiación.
Espectrometría de luminiscencia molecular
Componentes de los fluorómetros y de los espectrofluorímetros
- Fuentes
En la mayoría de las aplicaciones se necesitan fuentes más intensa
que las lámparas de wolframio o hidrógeno utilizadas en las medidas
de absorción.
De hecho, la magnitud de la señal de salida y, por tanto, la sensibilidad,
es directamente proporcional a la potencia de la fuente Po
- Lámparas
La lámpara más común para los fluorómetros de filtro es la lámpara de
arco de mercurio a baja presión equipada con una ventana de sílice
fundida. Esta fuente emite líneas útiles para producir la excitación
previa a la fluorescencia a 254, 302, 313, 546, 578, 691 y 773 nm. Las
líneas individuales se pueden aislar con filtros de interferencia o
absorción adecuados. Ya que, en la mayoría de los compuestos
fluorescentes, la fluorescencia se puede inducir con distintas longitudes
de onda, al menos una de las líneas del mercurio suele resultar
adecuada.
- Láseres
Desde los comienzos de los años setenta, se utilizan también diversos
tipos de láseres como fuentes de excitación para medidas de
fotoluminiscencia.
Un particular interés tienen los láseres sintonizables de colorante que
utilizan, como sistema de bombeo, un láser de nitrógeno pulsante o un
láser de Nd:YAG.
La mayoría de los espectrofluorímetros comerciales utilizan lámparas
(ya descritas) como fuentes, por ser menos caras y menos complicadas
de uso. Sin embargo, las fuentes de láser ofrecen importantes ventajas
en determinados casos: por ejemplo, (1) cuando las muestras son muy
pequeñas como en cromatografía con microcolumnas y en electroforesis
capilar donde la cantidad de muestra es de un microlitro o menor; (2) en
los sensores de control remoto, como en la detección fluorimétrica de
radicales hidroxilo en la atmósfera de clorofila en seres vivos acuáticos,
donde la naturaleza colimada de los haces de láseres vital: o (3) cuando
se requiere una radiación de excitación altamente monocromática para
minimizar los efecto de las interferencias fluorescentes.
- Filtros y monocromadores
Tanto los filtros de interferencia como los de absorción se han utilizado
en los fluorómetros para la selección de la longitud de onda del haz de
excitación y de la radiación fluorescente resultante, mayoría de los
espectrofluorímetros están equipados con al menos uno y a veces dos
monocromadores de red.
- Detectores
La señal de fluorescencia típica es de baja intensidad, por ello, para su
medida se necesitan ganancias de amplificador elevadas. Los tubos
fotomultiplicadores son los detectores más utilizados en instrumentos
de fluorescencia sensibles. Suelen trabajar en la modalidad de recuento
de fotones para mejorar la relación señal/ruido. También se utiliza, a
veces, la refrigeración de los detectores para mejorar la relación
señal/ruido. También se han propuesto, para los espectrofluorímetros,
los detectores de diodos en serie y de transferencia de carga. Este tipo
de detectores permite el registro rápido de los espectros de excitación y
de emisión y particularmente son útiles en cromatografía y en
electroforesis
APLICACIONES Y MÉTODOS FOTOLUMINISCENTES
Es inherente a los métodos fluorescentes y fosforescentes el ser aplicables a
intervalos de concentración más bajos que las medidas espectrofotométricas
de absorción y se encuentran entre las técnicas analíticas más sensibles de las
que puedan disponer los científicos. El aumento de sensibilidad surge del
hecho de que el parámetro relacionado con la concentración en fluorimetría y
en fosforimetría F se puede medir independientemente de la potencia de la
fuente Po. Por el contrario, una medida de absorbancia requiere la evaluación
de Po y de P, ya que la absorbancia, que es proporcional a la concentración,
depende de la relación entre estas dos cantidades. La sensibilidad de un
método fluorimétrico puede mejorarse aumentando Po o mediante la
amplificación adicional de la señal de fluorescencia. Por el contrario, en
espectrofotometría, un aumento en Po da lugar a un cambio proporcional en P
y, por ello, no afecta a la A. Por tanto, los métodos fluorimétricos tienen,
generalmente, sensibilidades que son de uno a tres órdenes de magnitud
superiores a los correspondientes de absorción. Por otro lado, la precisión y la
exactitud de los métodos fotoluminiscentes son habitualmente más pobres que
las de los procedimientos espectrofotométricos en un factor entre, quizás, dos
y cinco. Generalmente, los métodos fosforescentes son menos precisos que sus
correspondientes métodos fluorescentes.
Determinación fluorimétrica de especies inorgánicas
Los métodos inorgánicos fluorimétricos son de dos tipos. Los métodos directos
que conllevan la formación de un quelato fluorescente y la medida de su
emisión. Un segundo grupo, que se basa en el descenso de la fluorescencia que
resulta de la acción amortiguadora de la sustancia que va a ser determinada.
La última técnica se ha utilizado más en la determinación de aniones.
Reactivos fluorimétricos
Los reactivos fluorimétricos de más éxito en el análisis de cationes son los que
presentan estructuras aromáticas con dos o más grupos funcionales dadores que
permitan la formación de quelatos con el ion metálico. A continuación se
muestran
Determinación fluorimétrica de especies orgánicas
El número de aplicaciones del análisis fluorimétrico a especies orgánicas y
bioquímicas es impresionante.
Por ejemplo, Weissler y White han recopilado los métodos para la
determinación de más de 200 sustancias, incluyendo una amplia variedad de
compuestos orgánicos, enzimas y coenzimas, agentes medicinales, productos
naturales, esteroides y vitaminas. Es incuestionable que las aplicaciones más
importantes de la fluorimetría se encuentran en el campo del análisis de
productos alimentarios, farmacéuticos, muestras clínicas y productos naturales.
La sensibilidad y la selectividad del método hacen que sea una herramienta
particularmente valiosa en estos campos.
BIBLIOGRAFÍA
• Principio de Análisis Instrumental. SKOOG, HOLLER y NIEMAN
Quinta Edición. Mc Graw Hill.
• Análisis Instrumental. KENNETH A. RUBINSON y JUDITH F. RUBINSON
Prentice Hall. Madrid 2001.