IOTest® HLA-B27-FITC/ HLA-B7-PE REF A07739 50 determinaciones; 1 mL 20 µL / determinación IOTest Anticuerpos Conjugados IVD ESPAÑOL Especificaciones del componente 1 Especificaciones del componente 2 Especificidad Clon Hibridoma Inmunógeno HLA-B27 HLA-ABC-m3 NS1 x Balb/c Antígeno HLA-B27 parcialmente purificado, extraído de la línea Bordin (HLA-B27+) HLA-B7 BB7.1 NS1 x Balb/c Antígeno HLA-A2, B7 parcialmente purificado, obtenido por deslaminación de la papaína Inmunoglobulina Especie Origen Purificación IgG2a Ratón Ascitis Cromatografía IgG1 Ratón Ascitis Cromatografía Fluorocromo λ de excitación Pico de emisión Isotiocianato de fluoresceína (FITC) R Ficoeritrina (PE) 488 nm 488 nm 525 nm 575 nm PBS pH 7,2 que contiene 2 mg / mL de BSA y 0,1% NaN3 Tampón APLICACIÓN Esta mezcla de anticuerpos conjugados a fluorocromos permite la identificación y la numeración de las poblaciones celulares que expresan el antígeno HLA-B27 presentes en las muestras biológicas humanas por citometría de flujo. El papel del anticuerpo monoclonal de especificidad HLA-B7 consiste en poner de relieve la presencia de este antígeno, principal causa de reacción cruzada del clon que reconoce el antígeno HLA-B27 (1, 2). No utilizar para la determinación del grupo tisular HLA-B. PRINCIPIO Esta determinación se basa en la capacidad de los anticuerpos monoclonales específicos de unirse a células leucocitarias mediante los determinantes antigénicos que éstas expresan en la superficie. El marcaje específico de los leucocitos se realiza incubando la muestra con el reactivo IOTest. Los eritrocitos son eliminados a continuación por lisis, y los leucocitos, no afectados por esta etapa, son analizados por citometría de flujo. El citómetro de flujo mide la dispersión de la luz y la fluorescencia de las células. Permite acotar la población de interés dentro de una ventana electrónica, definida en un histograma que correlaciona la dispersión lateral de luz ("Side Scatter" o SS) con la dispersión frontal de luz (“Forward Scatter” o FS). También pueden utilizarse como apoyo para la fase de creación de una ventana electrónica otros histogramas que combinen dos de los distintos parámetros disponibles en el citómetro en función de la aplicación elegida por el usuario. La fluorescencia de las células así acotadas se analiza para distinguir los eventos con tinción positiva de los eventos no marcados. En esta determinación, contrariamente a la gran mayoría de las otras determinaciones de citometría, el fenotipado HLA-B27 se afirma comparando las intensidades de fluorescencia de la muestra probada con relación a las intensidades de fluorescencia de muestras certificadas HLA-B27+ y HLA-B27–. EJEMPLOS DE APLICACIÓN CLÍNICA Los antigenos HLA-B27 y HLA-B7 pertenecen al grupo de reacciones cruzadas B7 (CREG HLAB7). Entre los otros antígenos HLA-B pertenecientes al CREG HLA-B7, podemos mencionar B42, B22 (subdividido en B54, B55 y B56), B40 (subdividido en B60 y B61), así como B41, B47 y B13 (3). El anticuerpo monoclonal HLA-ABC-m3 reconoce el antígeno HLA-B27. Se cruza con el antígeno HLA-B7 (4) y puede igualmente fijarse, pero de manera menos afinada, en los otros antígenos de CREG HLAB7. El anticuerpo monoclonal BB7.1 reconoce el antígeno HLA-B7 (5, 6). Aunque es muy específico, se cruza con el antígeno HLA-B42 (2). Los antígenos HLA-B27, entre los que se encontraron (7) 15 alelos (B*2701-15), y HLAB7, entre los que se encontraron (7) 11 alelos (B*0702-12), se manifiestan respectivamente en un 7% y un 22% de los individuos de la población caucasiana (8, 9). Esta mezcla permite la caracterización de la especificidad HLA-B27 en el alotipo HLA de clase I en los pacientes que padecen afecciones inflamatorias de las articulaciones sacroiliacas e intervertebrales. Esta evidencia ayuda al diagnóstico de la espondilitis anquilosante, entre las cuales un 90% de las personas que la padecen manifiestan el antígeno HLA-B27, en comparación con 7% de la población normal (10 – 13). CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD Los anticuerpos conjugados en forma líquida se conservan entre 2 y 8°C en un lugar protegido de la luz, antes y después de abrir el frasco. Estabilidad del frasco cerrado: véase la fecha de caducidad del reactivo indicada en el frasco. Estabilidad del frasco abierto: el reactivo es estable durante 90 días. PRECAUCIONES 1. No utilizar el reactivo después de la fecha de caducidad. 2. No congelar. 3. Esperar que esté a la temperatura ambiente (18 – 25°C) antes de utilizarlo. 4. Minimizar el tiempo de exposición a la luz. 5. La contaminación microbiana de los reactivos puede generar resultados erróneos. 6. Las soluciones de anticuerpo que contienen azida sódica (NaN3) deben manipularse con precaución. No ingerir y evitar todo contacto con la piel, las mucosas y los ojos. Por otra parte, en medio ácido, la azida sódica puede formar un ácido hidrazoico potencialmente peligroso. Si fuera necesario eliminar el reactivo, se recomienda diluirlo en un gran volumen de agua antes de verterlo en las canalizaciones, para evitar la acumulación de azida sódica en los sistemas metálicos de conducción y los riesgos de explosión. 7. Toda muestra de sangre debe considerarse como potencialmente infecciosa y manipularse con las precauciones de uso (en particular; utilización de guantes, bata y gafas protectoras). 8. No pipetear nunca con la boca y evitar todo contacto de las muestras con la piel, las mucosas y los ojos. 9. Los tubos de sangre y el material desechable que se hayan empleado durante la 19 / 25 manipulación deben desecharse en contenedores específicos para la incineración. MUESTRAS Esta determinación puede practicarse tanto en sangre entera como en células separadas por gradiente de densidad. Las muestras de sangre venosa deben recogerse en tubos estériles que contengan una sal de EDTA como anticoagulante. No se recomienda el uso de otro anticoagulante. Las muestras se conservan a temperatura ambiente (18 – 25°C) sin agitación. Antes de efectuar el análisis de la muestra, se recomienda homogeneizarla mediante agitación suave. Las muestras deben analizarse en las 24 horas siguientes a su obtención. METODOLOGÍA MATERIAL NECESARIO NO SUMINISTRADO • Tubos de recogida de muestra y material necesario para el procesamiento de las muestras. • Pipetas automáticas y puntas desechables para volúmenes de 20,100 y 500 µL. • Tubos de hemólisis de plástico. • Microesferas de calibración: Fluoroesferas TM Flow-Set (Ref. 6607007). • Reactivo de lisis de los eritrocitos con etapa de lavado después de la lisis. Por ejemplo: Solución de Lisis IOTest 3 (Ref. A07799). • Reactivo de fijación: Solución de Fijación IOTest 3 (Ref. A07800). • Control isotípico: Mezcla de IgG2a-FITC y de IgG1-PE, ambos de ratón. • Reactivo de ajuste de las compensaciones: Mezcla de anticuerpos monoclonales CD8FITC y CD4-PE. TM • Sangre de control: IMMUNO-TROL Control Cells (Ref. 6607077). • Tampón (PBS: fosfato sódico 0,01 M; cloruro sódico 0,145 M; pH 7,2). • Centrífuga. • Mezclador automático (Tipo Vórtex). • Citómetro de flujo. PROCEDIMIENTO Las respuestas clínicas dadas por esta determinación se basan en la intensidad de fluorescencia; puesto que éstas dependen con mucho de los ajustes de compensación, es indispensable prever con cada serie de análisis un tubo para la verificación de estos ajustes. Para esta verificación, consulte el párrafo: AJUSTES DEL CITÓMETRO. Para cada muestra analizada, además del tubo problema, se debe incluir un tubo control en el que se incubarán las células con el control isotípico. A07739CE_D 2005-11-14 1. En cada tubo problema, dispensar 20 µL de la solución de anticuerpos conjugados IOTest específica y en cada tubo control, la cantidad necesaria de control isotípico. 2. Añadir a cada tubo 100 µL de la muestra que debe probarse. Mezclar suavemente en el Vórtex. 3. Incubar 15 a 20 minutos a temperatura ambiente (18 – 25°C) y en un lugar protegido de la luz. 4. Proceder, si es necesario, a la lisis de los eritrocitos según las recomendaciones del reactivo de lisis utilizado. Por ejemplo, si se desea utilizar la Solución de Lisis IOTest 3 (Ref. A07799), añadir 2 mL de este reactivo a su concentración de trabajo (1X). Mezclar inmediatamente en el Vórtex e incubar 10 minutos a temperatura ambiente y en un lugar protegido de la luz. Si la muestra no contiene eritrocitos, remplazar la lisis por 2 mL de PBS. 5. Centrifugar 5 minutos a 300 x g y a temperatura ambiente. 6. Eliminar el sobrenadante por aspiración. 7. Resuspender el botón celular en 3 mL de PBS. 8. Repetir la etapa 5. 9. Eliminar el sobrenadante por aspiración y resuspender el botón celular en: − 0,5 mL o 1 mL de Solución de Fijación IOTest 3 (Ref. A07800) a su concentración de trabajo (1X), si las preparaciones − deben conservarse más de 2 horas y menos de 24 horas,0,5 mL o 1 mL de PBS sin formaldehído si las preparaciones se analizan antes de 2 horas. párrafo: METODOLOGÍA/PROCEDIMIENTO, en la que, en primer lugar, se omite el tubo para el control isotípico y, en segundo lugar, el volumen de anticuerpo utilizado es el preconizado por el fabricante de la mezcla para 100 µL de sangre. AJUSTE DE LOS FOTOMULTIPLICADORES Analizar el tubo control de la sangre HLA-B27– B7– y ajustar las señales FITC y PE (amplificadas logarítmicamente) para que las intensidades de fluorescencia en un histograma biparamétrico FITC versus PE, acondicionado en los linfocitos, estén en la primera década como se ilustra en el histograma de la figura 1. Analizar el tubo problema de la sangre HLAB27– B7– y verificar que el histograma obtenido sea parecido al de la figura 2. Ajustar los cuadrantes para que el 98% de la población linfocitaria esté en el cuadrante 3. Figura 4 : Tubo problema de sangre HLA-B27– B7+ AJUSTES DEL CITÓMETRO Este procedimiento de ajuste del citómetro debe hacerse solamente en su totalidad durante la primera utilización del reactivo. En cambio, el ajuste de las compensaciones que allí se describe debe hacerse de nuevo antes de cada serie de análisis. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS NECESARIAS PARA LOS AJUSTES Tubos para las sangres de tipaje HLA conocido Preparar para cada una de estas 4 muestras un tubo problema y un tubo control según el procedimiento de marcaje del párrafo: METODOLOGÍA/PROCEDIMIENTO. Caso de la muestra HLA-B27–B7+ Analizar el tubo control de la sangre HLA-B27– B7+. El histograma obtenido debe ser comparable al de la figura 1. Analizar el tubo problema de la sangre HLAB27– B7+. El histograma obtenido debe ser comparable al de la figura 4. Figura 1 : Tubo control de sangre HLA-B27– B7– ADVERTENCIA: De todos modos, las preparaciones deben conservarse entre 2 y 8°C en un lugar protegido de la luz. MATERIAL NECESARIO NO SUMINISTRADO Para una primera utilización de este reactivo, el ajuste del citómetro sólo puede hacerse en sangres cuyo fenotipo HLA se conoce perfectamente. Proporcionarse las siguientes muestras de sangre: • Una sangre entera de fenotipo HLA-B27+ B7–. • Una sangre entera de fenotipo HLA-B27+ B7+. • Una sangre entera de fenotipo HLA-B27– B7+. • Una sangre entera de fenotipo HLA-B27– B7–. Figura 3 : Tubo problema de sangre HLA-B27+ B7– Figura 2 : Tubo problema de sangre HLA-B27– B7– AJUSTE DE LAS COMPENSACIONES Analizar el tubo marcado con la mezcla CD8FITC/CD4-PE y ajustar las compensaciones de fluorescencia de tal manera que, en el histograma FITC versus PE, las medias de las intensidades de fluorescencia sean idénticas según el eje de las Y en los cuadrantes 3 y 4, e idénticas según el eje de las X en los cuadrantes 1 y 3. CONTROL DE LOS UMBRALES DE FLUORESCENCIA La población linfocitaria se encuentra a caballo entre los cuadrantes 1 y 2. Esta situación es totalmente normal, y no es necesario intentar compensarla. Traduce el hecho de que el anticuerpo monoclonal HLA-ABC-m3 se cruza con el fenotipo HLA-B7. Una fracción de los epitopos HLA-B7 está ocupada por el anticuerpo HLA-ABC-m3. También puede darse una población linfocitaria completamente contenida en el cuadrante 1. Esta corresponde al caso de que el anticuerpo monoclonal HLAABC-m3 no se cruce con los epitopos HLA-B7. Caso de la muestra HLA-B27+B7+ Analizar el tubo control de la sangre HLA-B27+ B7+. El histograma obtenido debe ser comparable al de la figura 1. Analizar el tubo problema de la sangre HLAB27+ B7+. El histograma obtenido debe ser comparable al de la figura 5. Este control se efectúa con las sangres de tipaje HLA conocido. Caso de la muestra HLA-B27+ B7– Analizar el tubo control de la sangre HLA-B27+ B7–. El histograma obtenido debe ser comparable al de la figura 1. Analizar el tubo problema de la sangre HLAB27+ B7–. El histograma obtenido debe ser comparable al de la figura 3, en el que todos los linfocitos se encuentran en el cuadrante 4. Tubo para el ajuste de las compensaciones Preparar un tubo para el ajuste de las compensaciones marcando la sangre de un donante sano o la sangre de control ImmunoTrol (Ref. 6607077) con la mezcla CD8FITC/CD4-PE siguiendo el procedimiento del Figura 5 : Tubo problema de la sangre HLA-B27+ B7+ Caso de la muestra HLA-B27– B7– Analizar el tubo control de la sangre HLA-B27– B7–. El histograma obtenido debe ser 20 / 25 A07739CE_D 2005-11-14 comparable al de la figura 1. Analizar el tubo problema de la sangre HLA-B27– B7–. El histograma obtenido debe ser comparable al de la figura 2. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Cualquier población linfocitaria contenida completamente en el cuadrante 3 puede ser considerada como HLA-B27– (y HLA-B7–). Cualquier población linfocitaria contenida completamente en el cuadrante 1 puede ser considerada como HLA-B27– (y HLA-B7+). Cualquier población linfocitaria contenida completamente en el cuadrante 4 (con la condición de que los cuadrantes se hayan colocado no sobre un control isotípico, sino sobre una muestra HLA-B27– B7–) puede considerarse como HLA-B27+. Toda población linfocitaria a caballo entre los cuadrantes 3 y 4 tiene una fuerte probabilidad de ser HLA-B27+ (y HLA-B7–). No obstante, es indispensable una prueba de confirmación por microlinfocitotoxicidad o por PCR. Toda población linfocitaria a caballo entre los cuadrantes 1 y 2 tiene una fuerte probabilidad de ser HLA-B27– (y HLA-B7+). No obstante, es indispensable una prueba de confirmación por microlinfocitotoxicidad o por PCR. Cualquier población linfocitaria contenida en los cuadrantes 2 tiene una fuerte probabilidad de ser HLA-B27+ (y HLA-B7+). No obstante, es indispensable una prueba de confirmación por microlinfocitotoxicidad o por PCR. RENDIMIENTO DE LA DETERMINACIÓN ESPECIFICIDAD La especificidad del anticuerpo monoclonal (AcMo) HLA-ABC-m3 con respecto al antígeno HLA-B27 fue estudiada por Trapani, J.A. (ET) (4) y la del AcMo BB7.1 por Brodsky, F.M. (ET) (5). LINEALIDAD Una determinación de linealidad de marcaje no tiene ninguna significación biológica, ya que en un individuo o un 100% de las células son HLAB27+ o son HLA-B27–. En cambio, este tipo de reactivo debe demostrar en los donantes HLAB27–B7– una media de la intensidad de fluorescencia (MIF) de los linfocitos, tanto frente a la especificidad HLA-B27 como a la especificidad HLA-B7, muy inferior a la obtenida en los donantes HLA-B27+ B7+. Lo que traducen los informes MIF+/ MIF–, calculados a partir de las medias de 12 determinaciones de MIF de un donante HLA-B27+ B7+ (MIF+) y de un donante HLA-B27– B7– (MIF–), de la siguiente tabla. Linfocitos Número HLA-B27+ HLA-B27– HLA-B7+ HLA-B7– 12 12 12 12 Media (MIF) 29,6 0,26 33,9 0,20 CV (%) 2,2 2,4 1,7 1,7 Informe MIF+/ MIF– 114 168 VALORES ESPERADOS No aplicable REPRODUCIBILIDAD INTRALABORATORIO Dado que la pertenencia de un sujeto al grupo de especificidad HLA B27 se basa en la medida de la intensidad de fluorescencia de cada linfocito analizado, y no en la de porcentaje de linfocitos marcados, el estudio de reproductividad intralaboratorio se refiere a la MIF de esta población. El mismo día y con el mismo citómetro, se realizaron 12 determinaciones de la MIF de los linfocitos de un donante HLA-B27+ B7+. Los resultados obtenidos se agrupan en la tabla siguiente: Linfocitos Número HLA-B27 HLA-B7 12 12 Media (MIF) 29,6 33,9 DE 0,65 0,56 CV (%) 2,2 1,7 REPRODUCIBILIDAD INTERLABORATORIO El mismo día y con la misma población blanco (linfocitos HLA-B27+B7+), se realizaron 12 determinaciones de la MIF de los linfocitos y las preparaciones se analizaron en dos citómetros diferentes. Los resultados obtenidos se muestran en las tablas siguientes: Citómetro n°1: Linfocitos Número HLA-B27 HLA-B7 12 12 Media (MIF) 29,6 33,9 DE 0,65 0,56 CV (%) 2,2 1,7 Citómetro n°2: Linfocitos Número HLA-B27 HLA-B7 12 12 Media (MIF) 23,7 15,2 DE 0,58 0,40 CV (%) 2,5 2,6 LIMITACIONES DE LA TÉCNICA 1. Los resultados de citometría de flujo pueden ser erróneos si el citómetro no se alinea perfectamente, las fluorescencias no se compensan correctamente y las ventanas de selección no se ajustan cuidadosamente. 2. Este reactivo no debe ni diluirse, ni alicuotarse, ni congelarse. No utilizar el reactivo después de la fecha de caducidad indicada en el frasco. 3. La ficoeritrina (PE) es sensible a la luz, todas las incubaciones deben hacerse en un lugar protegido de la luz. 4. Utilizar preferentemente una técnica de lisis de los eritrocitos con lavado, ya que este reactivo no ha sido optimizado para las técnicas de lisis denominadas "sin lavado". 5. Los resultados serán precisos y reproducibles en la medida en que los procedimientos utilizados sigan las instrucciones de las fichas técnicas y sean compatibles con las buenas prácticas de laboratorio. 6. Los anticuerpos conjugados de este reactivo están calibrados para ofrecer una relación señal específica/señal inespecífica óptima. 21 / 25 Por ello, es importante respetar la proporción entre el volumen de reactivo y el volumen de muestra en cada determinación. , 7. En caso de hiperleucocitosis se debe diluir la sangre en PBS hasta una concentración 9 aproximada de 5 x 10 leucocitos/L. 8. En ciertas patologías, como las insuficiencias renales graves o las hemoglobinopatías, la lisis de los eritrocitos puede ser parcial o imposible. En tales casos, se recomienda aislar las células mononucleares por gradiente de densidad (por ejemplo: Ficoll) antes del marcaje. 9. La evidencia de un fenotipo HLA-B27 en un paciente no significa que éste último padezca espondilitis anquilosante. Al contrario, solamente un 90% de los pacientes que la padecen son HLA-B27+. EVENTUALES INTERFERENCIAS (REACCIONES CRUZADAS) 1. El anticuerpo monoclonal HLA-ABC-m3 que reconoce el antígeno HLA-B27, se cruza con el antigeno HLA-B7 (4) y, de manera menos afinada, con los antígenos del CREG HLAB7. 2. En cambio, el anticuerpo monoclonal BB7.1, que reconoce el antígeno HLA-B7 se cruza con el antígeno HLA-B42 (2, 5). 3. La evidencia, por el presente reactivo, de una doble positividad aparente HLA-B27+ y HLA-B7+ puede ser el resultado de distintas expresiones: − la expresión heterozigota del genotipo HLAB27 / HLA-B7, − la expresión heterozigota del genotipo HLAB7 / HLA-BY o, − la expresión homozigota del genotipo HLAB7 / HLA-B7. Por lo tanto, debe practicarse una prueba de confirmación por microlinfocitotoxicidad o PCR. OTROS Véase el Anexo (APPENDIX) para la bibliografía (REFERENCES). MARCAS COMERCIALES El logotipo Beckman Coulter, COULTER, EPICS, EXPO, Flow-Set, IMMUNO-TROL, IOTest, System II, XL son marcas registradas por Beckman Coulter, Inc. FABRICADO POR: IMMUNOTECH a Beckman Coulter Company 130 avenue de Lattre de Tassigny B.P. 177 – 13276 Marseille Cedex 9 France Servicio al cliente: (33) 4 91 17 27 27 www.beckmancoulter.com A07739CE_D 2005-11-14 APPENDIX TO REF A07739 REFERENCES 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Ulrich, G., "Utilisation de la cytométrie en flux pour le phénotypage HLAB27 : étude d'une technique de double marquage HLA B7 / HLA B27", 1997, Allergie et Immunologie, 1, 29, 11-14. Colombani, J., "HLA : Fonctions immunitaires et applications médicales", 1992, Clé pour M/S. John Libbey Eurotext.,Chap 2, 3137. Lee, T.D., Zhao, T.M., Strothman, R., "First Red Cross histocompatibility workshop", 1990, The HLA system. A new approach., Chap 5,Lee Editor, 107-139. Trapani, J.A., Vaughan, H.A., Sparrow, R.L., Tait, B.D., McKenzie, I.F.C., "Description of a mouse monoclonal anti-HLA-B27 antibody HLA-ABC-m3", 1983, Hum. Immunol., 7, 205-216. Brodsky, F.M., Parham, P., Barnstable, C.J., Crumpton, M.J., Bodmer, W.F., "Monoclonal antibodies for analysis of the HLA system", 1979, Immunological Rev., 47, 1-61. Trapani, J.A., Vaughan, H.A., Tait, B.D., Mc Kenzie, I.F.C., "Immunoradiometric assay for the rapid detection of HLA-B27", 1988, Immunol. Cell. Biol., 66, 215-219. Bodmer, J.G., Marsh, S.G.E., Albert, E.D., Bodmer, W.F., Bontrop, R.E., Dupont, B., Erlich, H.A., Hansen, J.A., Mach, B., Mayr, W.R., Parham, P., Petersdorf, E.W., Sasazuki, T., Schreuder, G.M.Th., Stominger, J.L., Svejgaard, A., Terasaki, P.I., “Nomenclature for factors of the HLA System, 1998”, 1999, Human Immunology, 60, 361-395. Colombani, J., "HLA : Fonctions immunitaires et applications médicales", 1992, Clé pour M/S. John Libbey Eurotext., Chap 3, 3947. Lee, T.D., "Distribution of HLA antigens : distribution of HLA antigens in north american caucasians, north american blacks and orientals", 1990, The HLA system, a new approach.,Chap 6,John Lee Editor, 141-236. Fizet, D., "Identification de l'antigène HLA B27 par cytométrie de flux", 1989, Ann. Bilo. clin., 47, 408-411. Feltkamp, T.E.W., Khan, M.A., Lopez de Castro, J.A., "The pathogenetic role of HLA-B27", 1996, Immunol. Today, 1, 17, 5-7. Bodmer, J., "World distribution of HLA alleles and implications for disease", 1996, Ciba Foundation Symposium, 197, 233-258. Lopez-Larrea, C., Gonzalez-Roces, S., Alvarez, V., "HLA-B27 structure, function and disease association", 1996, Curr. Opin. Rheumatol., 8, 296-308. 25 / 25 A07739CE_D 2005-11-14