Secuencia de Aminoácidos en las Proteínas • Es característica para cada proteína Tema 7 • Es codificada por una secuencia de nucleótidos del DNA SECUENCIACIÓN PEPTÍDICA • Por lo tanto, es una forma de información genética • Se lee desde el amino terminal al carboxilo terminal Etapas para el conocimiento de una secuencia peptídica (I) Estrategia en 8 pasos: 1.- Aislamiento y purificación de la proteína 2.- Determinación de la masa molecular 3.- Comprobar si posee más de una cadena Etapas para el conocimiento de una secuencia peptídica (II) 6.- Determinar la composición y la secuencia de estos péptidos mas pequeños 7.- Solapamiento o superposición de péptidos 4.- Separación de las cadenas 5.- Escisión de las cadenas en péptidos mas pequeños 8.- Hidrólisis total 1 Determinación de la estrategia de secuenciación Paso 1 Paso 2 2.- Determinación de la masa molecular (Mr) 1.- Aislamiento y purificación de la proteína Métodos indirectos • Dialisis • Filtración a través de geles • Ultracentrifugación • Otras técnicas ( según Mr; pI; carga; etc.) • Ultracentrifugación • Electroforesis (PAGE-SDS) Métodos directos • Espectrometría de masas Paso 3 3.- Comprobar si posee más de una cadena y calcular su número • Identificación del grupo N-terminal a) Reactivo de Sanger b) Cloruro de dansilo c) Cloruro de dabsilo d) Reactivo de Edman Fred Sanger desarrolló métodos de secuenciación de proteínas, por la secuencia de la insulina (1953) recibió el Premio Nobel de Química en 1958 2 Reactivos para identificar NH2 terminales 2,4-dinitrofluorbenceno NO2 NO2 F FDNB Después de la hidrólisis Sanger COOH NO2 R Amarillo, se extrae con cloroformo (los demás productos de hidrólisis ionizados no se extraen) NO2 Cloruro de dimetilaminonaftalen-5-sulfonilo C H NH DNS-Cl Cloruro de dansilo Después de la hidrólisis CH3 CH3 CH3 N O S Cl O CH 3 Análogo a FDNB pero fluorescente (detecta cantidades mínimas) COOH N O R S NH C H O Reactivo de Edman 3 Paso 4 ClH 6M 4.- Separación de las cadenas Sanger • La interacción entre las subunidades depende de fuerzas débiles • La separación se lleva a cabo con: - pH extremos Edman - urea 8 M - clorhidrato de guanidina 6 M - alta concentración de sales, fundamentalmente sulfato amónico Paso 4 a) Rotura de puentes disulfuro Residuos de ác.cisteico Ác.perfórmico • Agentes que reducen puentes disulfuro: - β- mercaptoetanol - ditiotreitol o ditioeritritol - para evitar recombinaciones, añadir un agente alquilante como iodoacetato β-mercaptoetanol Ác. yodoacético • Oxidación con ácido perfórmico S-carboximetil derivado 3 bromopropilamina 4 Paso 4 Paso 5 b) Rotura de atracciones electrostáticas 5.- Escisión de las cadenas en péptidos mas pequeños • Cromatografía de intercambio iónico A.- Métodos químicos • Bromuro de cianógeno • Hidroxilamina. Hidrólisis de .....Asn-Gly...... c) Rotura de interacciones hidrofóbicas B.- Métodos enzimáticos • Tripsina • Agentes desnaturalizantes • Termolisina • Quimotripsina • Clostripaina • Proteasa del Staphylococcus 5 A.- Fragmentación Química • Bromuro de cianógeno B.- Fragmentación Enzimática • Tripsina : ruptura de enlace peptídico por lado carboxilico de Rn=Lys o Arg. Rn+1≠ Pro Tripsina • Termolisina: lado amino de Rn= Val, Leu, Ile,Phe, Trp, Tyr, Met(Voet). Rn-1≠ Pro • Quimotripsina: lado carboxílico de Rn= Phe, Trp, Tyr. Rn+1≠ Pro • Clostripaina: igual que tripsina, pero ataca más a lado Cde Arg que de Lys • Proteasa estafilocócica: - lado C- de Glu y Asp en tampón fosfato - específico para Glu en tampón acetato ó bicarbonato 6 Paso 6 6.- Determinar la composición y la secuencia de estos péptidos mas pequeños a) Identificación de los restos N-terminal • Determinación de restos N-terminales Tripsina Tripsina Tripsina - Reactivo de Edman: Fenilisotiocianato Los derivados tienen una naturaleza de feniltiohidantoinas (derivados PTH) b) Identificación de los restos C- terminales Paso 6 Paso 6 b) Identificación de restos C- terminales b) Identificación de restos C- terminales Métodos enzimáticos (carboxipeptidasas) Métodos químicos • Carboxipeptidasa A, rompe cualquier residuo excepto C-terminal de Pro, Lys y Arg • Hidruro de litio y aluminio: AlH4Li • Carboxipeptidasa B, solamente actúa sobre Cterminal de Arg y Lys • Carboxipeptidasa C, si es Pro y cualquier aa • Carboxipeptidasa Y (levaduras), cualquier aa • Ninguna actúa si el aa n-1 = Pro • Hidrazinolisis: H2N-NH2 - Libera el aa C-terminal y el resto de aa quedan como aminoacil-hidrazidas - Caso de que ninguna carboxipeptidasa libere el C-terminal 7 Paso 7 7.- Solapamiento o superposición de péptidos Reactivos para identificar C terminal Ordenamiento del péptido original con los datos suministrados en etapas anteriores Hidrazinolisis Ej: Comparación de la ruptura por tripsina y proteasa NH2-NH2 de staphylococcus sobre un péptido: Después de la hidrólisis COOH NH 2-NH 2 CO NH NH 2 R NH2 R C H C NH2 H El C-terminal queda libre y los demás Aminoacilhidrazida Rn-1 como hidracidas Aa libre • Acción de la Tripsina (lado C-Rn=Lys o Arg. Rn+1≠ Pro) A-E-F-S-G-I-T-P-K L-V-G-K • Acción de Proteasa del Staphylococcus (lado C- de Glu y Asp en T.F y Glu en T.A o bicarb.) F-S-G-I-T-P-K L-V-G-K-A-E Paso 7 Ejemplo: 7.- Solapamiento o superposición de péptidos • El correcto solapamiento de los fragmentos L-V-G-K A-E-F-S-G-I-T-P-K L-V-G-K-A-E F-S-G-I-T-P-K • Secuencia Correcta (péptido original): L-V-G-K-A-E-F-S-G-I-T-P-K Leu-Val-Gly-Lys-Ala-Glu-Phe-Ser-Gly-Ile-Thr-Pro-Lys 8 Paso 8 8.- Hidrólisis total Determinación de la composición en Aminoácidos • Hidrólisis total con ClH 6M. 100-110ºC/10-100h • Hidrólisis con NaOH 2M a 4M.100ºC/4-8h • Enzimática: mezcla de peptidasas para determinar Trp, Asn y Gln (destruidos por métodos químicos) LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS SUMINISTRA VARIOS TIPOS DE INFORMACIÓN 1.- Se pueden comparar secuencias de proteínas para confirmar semejanzas significativas Ej: Hb y Mb ( familia de globinas) Quimotripsina y Tripsina (serin-proteasas) 2.- Información de las vías evolutivas correspondientes. Ej: seroalbúmina 3.- Repeticiones internas. Ej: calmodulina LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS SUMINISTRA VARIOS TIPOS DE INFORMACIÓN Evolución molecular de las globinas β-globina α-globina 4.- Señales que determinan el destino de la proteína y controlan su maduración. Ej: proteínas de secreción 5.- Preparación de anticuerpos especificos para una proteína de interés. Ej: anticuerpos 6.- Preparación de sondas especificas de DNA para los genes que codifican las proteínas correspondientes Ej: genética molecular clonaje de DNA (Garret & Grisham , 1999) 9 Comparación de secuencias de citocromo c Evolución según la secuencia de los citocromos c Número de aminoácidos variantes (Garret & Grisham , 1999) Procedimientos experimentales para averiguar la conformación de las proteinas • Dicroismo circular • Cristalografía de rayos X • Espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR) •Dicroismo circular Proteínas asimétricas Ópticamente activas Carbono asimétrico • La actividad óptica se expresa en bandas de absorción • Hay coeficientes de absorción de luz polarizada circularmente a derechas o izquierdas ESPECTROS DE DICROISMO CIRCULAR 10 • Experimento de cristalografía por rayos X PROTEINA CRISTALIZADA Stryer 6ª Ed.2007 • Base de la espectroscopía de RMN Proteína en disolución La radiación de microondas puede hacer pasar estos núcleos de un estado energético a otro= RMN Es un tipo de espectroscopia Ciertos núcleos atómicos son intrínsecamente magnéticos → campos magnéticos (1H;2H; 13C; 15N) Stryer 6ª Ed.2007 Isótopos: tienen igual número atómico (número de protones en el núcleo), pero diferente número másico (suma del número de neutrones y número de protones en el núcleo). Difieren pues en el número de neutrones. Stryer 6ª Ed.2007 11 Espectro de RMN unidimensional Fin de Tema 7 Stryer 6ª Ed.2007 12