Proteínas: Métodos para su Estudio

Proteínas:
Métodos para su
Estudio
Propiedades Espectroscópicas
• Todos los aminoácidos
absorben luz en la región
infraroja
• Sólo Phe, Tyr, & Trp absorben
UV
• Absorbancia a 280 nm es un
buen diagnóstico para
aminoácidos
Medida de absorbancia en un espectofotómetro
Separación de Aminoácidos
• Mikhail Tswett, botánico ruso, separó
pigmentos coloreados de plantas por
‘cromatografía’
• Existen muchos métodos cromatográficos
para separar mezclas de aminoácidos
– Cromatografía de intercambio iónico
– Cromatografía líquida de alta performance
(HPLC)
Cromatografía en columna
Cromatografía de Partición / Tamiz molecular
Mezcla de proteínas es añadida a
la columna la cual contiene un
polímero
Moléculas de proteínas se separan en
base a tamaño; las más grandes es
añadida a la columna la cual cpasan
más libremente y aparecen en las
primeras fracciones
Cromatografía de Intercambio Ionico
Perlitas del polímero
tienen grupos cargados
positiva (int. aniónico) o
negativas (int. catiónico)
Mezcla de proteínas es
añadida a columna con
intercambiador (cat)
Proteínas se mueven por la columna a velocidades determinadas por su carga neta al pH
que se está usando. En el intercambiador catiónico, las proteínas con mayor carga
negativa se moverán más rápido y eluirán antes
Intercambiador catiónico:
La resina tendrá carga
negativa e intercambiará
cationes (p. ej. Na+) por un
aminoácido cargado
positivamente
p.ej. Carboximetil celulosa
Muestra
Conteniendo
varios aa.
Columna
conteniendo
resina de
intercambio
catiónico
Elución separa
aa en bandas
discretas
Cromatografía de Afinidad
Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones denaturantes
(SDS-PAGE)
Luego de la tinción : con nitrato de plata o Azul de Coomassie
Determinación de peso molecular aprox.de una proteína (Mr)
Isoelectroenfoque : Separación de proteínas en base a su
punto isoeléctrico
Primer paso para la electroforesis de proteínas en 2
dimensiones
Frederick Sanger terminó la secuencia de la insulina bovina en
1953: una década de trabajo y muchos investigadores para un
péptido de 51 residuos
Determinando la Secuencia
Una Estrategia de Ocho Pasos
• 1. Si hay más de una cadena
polipeptídica, separarlas.
• 2. Romper (reducir) puentes disulfuro
• 3. Determinar composición de c/ cadena
• 4. Determinar residuos N- y C-terminal
• 5. Cortar c/cadena en fragmentos
pequeños y determinar su secuencia
Determinar la Secuencia
Una Estrategia de Ocho Pasos
• 6. Repetir paso 5, usando procedimiento
de corte diferente para generar un
juego diferente de fragmentos
• 7. Reconstruir la secuencia de la proteína
a partir de la secuencia de fragmentos
que se sobreponen
• 8. Determinar las posiciones de los
puentes disulfuro
Paso 1:
Separación de cadenas
• Interacción entre subunidades
depende de fuerzas débiles
• Separación es llevada a cabo con :
- pH extremo
- 8M urea
- 6M guanidina HCl
- concentración alta de sales
(generalmente sulfato de amonio)
Paso 2:
Corte de Puentes Disulfuro
• Oxidación de Acido Perfórmico
• Agentes reductores Sulfhidrílicos
- mercaptoetanol
- ditiotreitol o ditioeritritol
- para prevenir recombinación, seguir con
agente alquilante como iodoacetato
Paso 3: Determinar composición
de aminoácidos
1. Hidrólisis química de todos los
enlaces peptídicos con HCl 6N,
110 ºC x 24 h
2. Cromatografía de intercambio
iónico
3. Aminoácidos + compuesto
fluorescente/coloreado es
eluido de columna de
intercambio iónico
4. Intensidad de señal es
proporcional a concentración
del aminoácido
Paso 4:
Identificar residuos N- y C-terminal
• Analisis N-terminal :
– Método de Sanger: utiliza 1-fluoro-2,4
dinitrobenzeno (FDNB) que marca 1er aa. e
hidroliza el resto del polipéptido
– Método de Edman = Fenilisotiocianato
derivados son Feniltiohidantoínas (o derivados
PTH)
Se marca extremo N-terminal, se hidroliza
este residuo y se repite
Degradación de Edman
Paso 4:
Identificar residuos N- y C-terminal
• Análisis C-terminal
– Análisis enzimático (carboxipeptidasa)
– Carboxipeptidasa A corta cualquier residuo en
extremo carboxilo excepto Pro, Arg, y Lys
– Carboxipeptidasa B (pancreas de cerdo) sólo
actúa en Arg y Lys del extremo C-terminal
Pasos 5 y 6:
Fragmentación de las cadenas
• Fragmentación Enzimática
– tripsina, quimiotripsina, clostripaina,
proteasa de Staphylococcus
• Fragmentación Química
– Bromuro de cianógeno
Fragmentación Enzimática
• Tripsin - corta en lado C de Lys, Arg
• Quimiotripsina – lado C de Phe, Tyr, Trp
• Clostripaina - como tripsina, pero ataca a las
Arg más que a las Lys
• Proteasa de Staphylococcus
– Lado C de Glu, Asp en buffer fosfato
– Específico para Glu en buffer acetato o
bicarbonato
Fragmentación Química
Bromuro de Cianógeno
• CNBr actúa sólo en residuos de metionina
• CNBr es útil porque proteínas generalmente
tienen pocos residuos de Met
• Se genera un péptido con una homoserina
lactona C-terminal (producto de la reacción
de la Met con CNBr)
Corte por Bromuro de Cianógeno
Paso 7:
Reconstruyendo la Secuencia
• Usar dos o más agentes fragmentadores
en experimentos separados
• Secuenciar todos los péptidos producidos
(generalmente por degradación de
Edman)
• Comparar y alinear péptidos con
secuencias que se sobrepongan para
determinar la secuencia de la cadena
polipeptídica original
Reconstruyendo la Secuencia
Comparar corte por tripsina y proteasa de
Staphylococco en un péptido típico :
• Corte por Tripsina :
A-E-F-S-G-I-T-P-K
L-V-G-K
• Proteasa de Staphylococcus:
F-S-G-I-T-P-K
L-V-G-K-A-E
Comparamos:
L-V-G-K A-E-F-S-G-I-T-P-K
L-V-G-K-A-E F-S-G-I-T-P-K
• Secuencia Correcta:
L-V-G-K-A-E-F-S-G-I-T-P-K
Ejemplo de péptido de 38 residuos que es secuenciado
FDNB:
FluoroDiNitroBenceno
Naturaleza de las Secuencias de
Proteínas
• Secuencias y composición reflejan la
función de la proteína
• Proteínas de membrana tienen más
residuos hidrofóbicos, mientras que las
proteínas fibrosas pueden tener secuencias
atípicas
• Proteínas homólogas de diferentes
organismos tienen secuencias homólogas
• e.g., citocromo c está altamente conservado
Espectrometría de masas
Muestra ionizada en vacío→en campo eléctrico/magnético
Medida de relación masa/carga (m/z)
Las especies separadas difieren en 1 unidad en su masa (más grande
hacia la derecha)
Después de la hidrólisis proteolítica de una proteína, solución
es inyectada en el MS
Sólo un péptido entra al análisis
Péptido es fragmentado y se mide m/z de cada fragmento
Péptido de 10 residuos.
Diferentes picos difieren en 1 residuo en tamaño
Secuencia: Phe-Pro-Gly-Gln-(Ile/Leu)-Arg (misma masa)
PREGUNTAS POR RESOLVER
1. Buscar ejemplos de resinas de intercambio aniónico y
catiónico
2. Revisar la estructura de los agentes reductores de
puentes disulfuro
3. Cómo reacciona la ninhidrina con los aminoácidos; qué aa.
produce un derivado de diferente color y por qué?
4. Qué aminoácidos se destruyen por el tratamiento con
ácido a 100 ºC utilizado para determinar la composición
de aminoácidos de una proteína
5. Qué ventaja tiene la degradación de Edman sobre la de
Sanger
6. Revisar las técnicas de difracción de rayos X y espectros
de resonancia magnética nuclear (NMR)