Regeneración de plantas de Aloysia polysctachya por cultivo in vitro de lámina foliar y segmentos de entrenudos. Contreras, Marcos - Luna, Claudia - Tarragó, José - Sansberro, Pedro - Mroginski, Luis Instituto de Botánica del Nordeste - Facultad de Ciencias Agrarias - UNNE. Sargento Cabral 2131 - (3400) Corrientes - Argentina. E-mail: sansber@agr.unne.edu.ar INTRODUCCION El interés que presenta en la actualidad la industria farmacéutica por la obtención de formulaciones a partir de compuestos de origen natural, hace que el cultivo de las plantas medicinales como fuentes de agentes farmacológicos activos, constituya una alternativa de producción. En tal sentido, Aloysia polystachya (Gris.) Mold. (Verbenaceae) adquiere un marcado interés económico debido a que sus hojas contienen derivados terpénicos (2), los cuales hacen que las infusiones de las mismas posean propiedades tónicas carminativas y especialmente digestivas (4). Pese a su amplia distribución geográfica (1, 2), la explotación extractiva a partir de comunidades espontáneas presenta el inconveniente de la heterogeneidad tanto en la composición química como en la productividad del material (R.A. Malizia, comunicación personal) y no asegura un continuo abastecimiento del producto. Debido a ello, y con el objeto de promover el cultivo intensivo de Aloysia polystachya, es necesario contar con individuos genéticamente uniformes y con métodos que permitan la multiplicación rápida y masiva de esta especie. Con el presente trabajo, se informa acerca de un método que permite la obtención de plantas de Aloysia polystachya a partir del cultivo in vitro de porciones de lámina foliar y entrenudos. MATERIAL Y METODOS Se trabajó con plantas de Aloysia polystachya (Gris.) Mold. (“burrito”) que crecieron en macetas y en condiciones de invernadero. El material vegetal fue gentilmente cedido por el Establecimiento Las Marías S.A.C.I.F.A., Gdor. V. Virasoro (Ctes.). Los explantes (segmentos de tallos con 2 a 3 yemas axilares) fueron previamente desinfectados en una solución de NaOCl al 1.2 % durante 15 minutos y, finalmente enjuagados varias veces con agua destilada estéril. Posteriormente, éstos fueron cultivados en el medio basal publicado por Sansberro y Mroginski (1995) desarrollado para A. polystachya, consistente de las sales minerales y vitaminas de Murashige y Skoog (1962), diluido 4 veces (MS/4), semisólido (agar 0.65 %) y adicionado con 5 gr.l-1de sacarosa. Al cabo de 35 días de cultivo, se extrajeron porciones de hojas y segmentos de entrenudos, los cuales fueron subcultivados en un medio basal de igual composición, con o sin el agregado de ácido naftalenacético (ANA: 0, 0.1, 0.5, 1 mg.l-1) y 6-bencilaminopurina (BAP: 0, 0.1, 0.5, 1 mg.l-1). Posteriormente, los brotes regenerados a partir de ambos explantes fueron transferidos a un medio libre de reguladores del crecimiento a fin de promover el alargamiento de los tallos. Se ensayaron diferentes procedimientos para inducir el enraizamiento de los vástagos obtenidos in vitro; el que brindó los mejores resultados, consistió en el tratamiento de los vástagos con ANA 100 mg.l-1 durante 2 h, seguido por el cultivo in vitro en MS/4 con 5 gr.l-1de sacarosa. Los cultivos fueron incubados a 27±1°C y 14 hs de fotoperíodo (116 µmol.m-2.seg-1 radiación PAR) Se cultivaron 10 explantes por tratamiento, realizándose 3 repeticiones. Los resultados fueron sometidos al análisis de la variancia (ANOVA) y las comparaciones de las medias fueron realizadas con diferencias significativas menor al 5 % de probabilidad (Tukey, Test de Comparaciones Múltiples). En todas las figuras, la barra indica el error estándar de la media (SEM). RESULTADOS Transcurridos 45 días del subcultivo, prácticamente en todos los medios ensayados se formaron brotes a partir de ambos explantes (Figs. 1 y 2), lográndose los mejores resultados cuando se cultivaron trozos de lámina foliar en medios de cultivo suplementados con ANA (0.1 mg.l-1) y BAP (0.1 mg.l-1). La capacidad de regeneración de los entrenudos fue menor en todos los tratamientos ensayados y si bien, el número de brotes Explantes que brindan brotes en % regenerados por explante fue mayor en ausencia de reguladores del crecimiento o bien, en presencia de bajas dosis de ANA (0.1 mg.l-1), éstos presentaron un crecimiento anómalo, caracterizado por una excesiva vitrificación. 100 80 ð a ANA 1 mg.l -1 60 b b 0 0.1 0.5 a ð a 40 b 20 Explantes que brindan brotes en % 0 100 80 1.0 ANA 0.5 mg.l -1 ab 60 b 40 20 Explantes que brindan brotes en % 0 0 0.1 a 100 80 a 0.5 ð 1 ANA 0.1 mg.l -1 ab 60 40 b 20 Explantes que brindan brotes en % 0 0 0.1 100 80 0.5 1.0 Sin ANA a ab 60 b 40 b 20 0 0 0.1 0.5 B AP (mg.l-1) Hojas Entrenudos 1.0 Fig. 1: Efecto que ejerce la interacción de ANA y BAP sobre la regeneración de brotes adventicios por medio del cultivo in vitro de trozos de lámina foliar y porciones de entrenudos. Letras iguales indican que las diferencias no son significativas (P>005) respecto al tratamiento control (Tukey, Test de Comparaciones Múltiples). Únicamente se detallan las comparaciones estadísticas realizadas cuando se emplearon trozos de lámina foliar. En todos los casos, la barra indica el error estándar de la media (SEM). Fig. 2: Efecto que ejerce la interacción de ANA y BAP sobre el número de brotes adventicios regenerados mediante el cultivo in vitro de trozos de lámina foliar y porciones de entrenudos. En todos los casos, la barra indica el error estándar de la media (SEM). Brotes/explante 10 8 ð ANA 1 mg.l -1 6 4 2 0 0 0 .1 Brotes/explante 10 0 .5 ð 1 .0 ANA 0.5 mg.l -1 8 6 4 2 0 0 0.1 Brotes/explante 10 0.5 ð 8 1.0 ANA 0.1 mg.l -1 6 4 2 0 0 0.1 0.5 1.0 Brotes/explante 10 8 Sin ANA 6 4 2 0 0 0 .1 0 .5 1 .0 BAP (mg.l- 1) Hojas Entrenudos El 80 ± 10 % de los vástagos brindaron raíces adventicias, las cuales se generaron a través de organogénesis directa (3), es decir que se diferenciaron directamente desde el vástago, sin la formación intermedia de callos. CONCLUSIONES Los resultados de este trabajo, muestran que es factible regenerar plantas de Aloysia polystachya mediante el cultivo de trozos de lámina foliar extraídos de brotes jóvenes provenientes del establecimiento in vitro de segmentos plurinodales. Un aspecto llamativo de este sistema desarrollado para Aloysia polystachya es la alta capacidad de regeneración de los explantes estudiados, aún en ausencia de reguladores del crecimiento vegetal, siendo necesarios mayores estudios que permitan esclarecer los mecanismos fisiológicos involucrados en dicho proceso morfogénico. BIBLIOGRAFIA CITADA 1. Botta SM (1979). Darwiniana 22: 67-107. 2. Fester G, Martinuzzi EA, Retamar JA, Ricciardi AI (1961). Academia Nacional de Córdoba: 38-40. 3. Hicks GH (1987). Can. J. Bot. 65: 1913-1920. 4. Martínez Crovetto R (1981). Fundación Miguel Lillo, Tucumán. Misc. 69: 89. 5. Murashige T, Skoog FA (1962). Physiol. Plant. 15: 473-497. 6. Sansberro PA, Mroginski LA (1995). AgriScientia 12: 83-93.