DESARROLLO DE LOS SISTEMAS DE REGENERACION in vitro Y TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DEL NARANJO DULCE cv. VALENCIA (Citrus sinensis [L.] Osbeck) BIOL. CARLOS ANTONIO DAVILA FIGUEROA DR. EUGENIO PÉREZ MOLPHE BALCH Universidad Autónoma de Aguascalientes INTRODUCCIÓN Los cítricos son los frutales más extensamente cultivados alrededor del mundo. La Naranja Dulce representa aproximadamente el 58% y 64% de la producción citrícola mundial y nacional respectivamente. El cultivo de los cítricos se enfrenta a serios problemas por lo que el incremento en la producción es críticamente dependiente de la disponibilidad de cultivares superiores. Las cruzas tradicionales como una estrategia para el mejoramiento genético de cultivares de cítricos enfrenta serias limitaciones (Conejero 2003). La Ingeniería Genética de Plantas representa una alternativa muy atractiva para el fitomejoramiento de cítricos. Para utilizar esta tecnología es necesario desarrollar antes los sistemas de regeneración y transformación para la introducción de genes útiles en cultivares específicos (Pérez-Molphe-Balch & Ochoa-Alejo 1998). OBJETIVOS El objetivo de esta investigación fue el desarrollar los sistemas de regeneración in vitro y transformación genética mediada por Agrobacterium rhizogenes del Naranjo Dulce cv. Valencia (Citrus sinensis (L.) Osbeck). MATERIALES Y MÉTODOS Para la obtención de raíces transformadas se evaluaron diferentes tiempos de cocultivo y concentraciones de acetosiringona de segmentos internodales de tallo de plántulas germinadas in vitro con A. rhizogenes cepa A4 con el plásmido ESC4, el cual contiene los genes nptII y gus. Se evaluó el efecto de las condiciones de incubación en el crecimiento de las raíces transformadas. Para la regeneración se utilizó el mismo tipo de explantes sometidos a diferentes combinaciones de reguladores del crecimiento vegetal para observar su efecto en la inducción de brotes adventicios. Con los resultados se llevó a cabo un análisis estadístico ANOVA para determinar diferencias significativas entre los tratamientos y compararlos de acuerdo a la Prueba de Comparación Múltiple Tuckey Kramer. El mejor tratamiento de organogénesis fue utilizado para la regeneración de brotes transformados. La presencia de los genes foráneos se efectuó por el ensayo histoquímico para la enzima GUS y por análisis PCR. RESULTADOS La mayor eficiencia se obtuvo al usar un preacondicionamiento de los explantes con un pulso de 45 min con AS y 72 h de cocultivo en medio suplementado con AS con 67% de los explantes con raíces transformadas con un promedio de 5.18 raíces por explante. Las raíces transformadas se desarrollan mejor bajo condiciones de fotoperíodo de 16 h en medio de selección sólido. El mejor tratamiento de organogénesis en tejidos no transformados fue con explantes heridos longitudinalmente, inoculados de manera horizontal en u medio con BA:NAA (7.5:1 mg L–1) en el cual 92% de los explantes diferenciaron brotes en un promedio de 5.13. La regeneración de brotes transformados se obtuvo en segmentos de raíz transformada cultivados en medio con 2.5 mg L–1 de BA (BA). La actividad de gus fue evidente en las raíces transformadas y los brotes y plantas regeneradas. La presencia de los genes foráneos fue confirmada por análisis PCR. CONCLUSIONES El cocultivo de 72 hrs en medio líquido probó ser suficiente para obtener la mejor eficiencia de transformación y los menores problemas para eliminar a la bacteria. La adición de AS al medio de cocultivo facilitó que Agrobacterium rhizogenes fuera más eficiente al mediar la transformación de naranja dulce y el preacondicionamiento de los explantes incrementó el número de células competentes para la transformación por explante. Los cultivos de raíces en medio sólido, bajo condiciones de iluminación continua, tienen un crecimiento más acelerado que los cultivos en medio líquido. Los genes transferidos influencian el efecto de los reguladores sobre el proceso de organogénesis. La metodología desarrollada puede ser utilizada para la introducción de genes de interés agronómico en el Naranjo Dulce. BIBLIOGRAFÍA Conejero-Tomás V (2003) Draft of International Citrus Genome Consortium. White Paper Pérez-Molphe-Balch E (2003) Genetic Transformation and Regeneration of Citrus species. In: Jaiwal Pawan K & Singh Rana P (eds) Improvement of Fruit Crops. Plant Genetic Engineering Vol. 6, SCI TECH PUBLISHING LLC, USA 2003.