Procesamiento de los frotis de Papanicolaou en el Laboratorio de

Procesamiento de los frotis de
Papanicolaou en el Laboratorio de
Citopatología
Carlos Zamorano1 & Julieta Sepúlveda1
1
Licenciado en Tecnología Médica, U. de Concepción, Concepción, Chile
Introducción
La
detección
del
cáncer
cervicouterino en etapas tempranas es
fundamental para evitar complicaciones
posteriores o incluso la muerte por esa
patología. Por esto es que se ha
implementado en Chile el programa de
pesquisa de cáncer de cuello uterino, el
cual,
mediante
la
técnica
de
Papanicolaou
(PAP)
realiza
un
screening citológico en la población
femenina en busca de la detección de
lesiones precursoras al cáncer.
En
el
Laboratorio
de
Citopatología es donde se realiza todo el
procesamiento
del
frotis
de
Papanicolaou (PAP), desde su recepción
hasta el diagnóstico pasando por una
serie de etapas de identificación de la
muestra,
ingreso
al
sistema
computacional, tinción y observación al
microscopio de la citología para
detectar estructuras y cambios celulares
que orienten al diagnóstico.
En este artículo se abordara, de
forma general, como se realiza el
procesamiento de los frotis de PAP en
el Laboratorio de Citopatología para
obtener el diagnóstico citológico.
Descripción del laboratorio y su
funcionamiento
El Laboratorio de Citopatología
puede estar ubicado dentro de un
complejo Hospitalario, dentro del
Servicio de Anatomía Patológica de un
Hospital o en alguna consulta privada.
Por lo general, se encuentra dividido en
2 secciones o etapas: (1) “recepción,
identificación y tinción de muestras” y
(2) “microscopía”.
El proceso comienza en la etapa
de “recepción, identificación y tinción
de muestras” donde la secretaría recibe
las muestras, realiza el ingreso de las
fichas de las pacientes a un sistema
computacional (ej. Cito-Expert, AniTa),
le asigna un número o folio y se indica
la existencia de antecedentes previos
cuando estos existan. Luego, las
láminas son debidamente rotuladas por
el Técnico Paramédico, o por alumnos
en práctica. Los frotis de las pacientes
provienen del mismo Hospital, de
Consultorios y/o de otros centros de
Salud y se obtienen extrayendo células
del cuello uterino mediante la técnica de
Papanicolaou,
por
Médicos
especializados en Ginecología u
Obstetras.
Es fundamental llevar un
registro diario de la cantidad de
exámenes recibidos y organizar las
solicitudes agrupándolas por lugar de
proveniencia, código y fecha de ingreso.
Esto será de utilidad para identificar los
casos que presenten algún problema, ya
sea, de rotulación, pérdida de muestras,
láminas en mal estado (quebradas), etc.
Una vez identificadas las
láminas o portaobjetos el Tecnólogo
Médico
de
la
mención
de
Morfofisiopatología y Citodiagnóstico
realiza el proceso de tinción de
Papanicolaou, ya sea, de forma
automatizada o manual.
Posteriormente el Citotecnólogo
realiza el screening citológico, y en
conjunto con el Médico especializado
en Patología o Citopatólogo, se
determina
el
diagnóstico
para
posteriormente ingresarlos en el sistema
computacional. Finalmente se entregan
los informes de diagnósticos a su
consultorio u hospital respectivo para
informar al Médico y paciente sobre la
situación.
De esta forma se lleva a cabo el
funcionamiento óptimo del Laboratorio
de Citopatología permitiendo el
diagnóstico oportuno, tanto de los casos
negativos como positivos, y la
derivación de estos últimos a la Unidad
de Patología Cervical.
Proceso de recepción e identificación
de muestras
El proceso de recepción de
muestras es el primer paso dentro de la
cadena y comienza al recibir las
muestras de exámenes PAP de los
distintos consultorios y/o hospitales de
la región y/o comuna. Estos exámenes
son entregados al personal encargado
del transporte de biopsias y citologías y
una vez recibidos, por la secretaria en el
Laboratorio de Citopatología, estos se
ingresan al sistema computacional
registrando los datos que se requieran
de la paciente.
A continuación se toman los
exámenes, se revisa que la cantidad
entregada coincida con lo recibido y se
identifica la unidad muestra-solicitud
revisando que cada solicitud traiga la
muestra rotulada de forma clara y
legible y que los portaobjetos vengan
adjuntos a la ficha que le corresponde.
Luego se procede a foliar las solicitudes
de examen con un número único para
que
ingresen
al
sistema
de
almacenamiento de datos.
Luego de que las muestras
fueron recibidas e identificadas se les
aplica la tinción de PAP y las fichas son
ingresadas
en
el
programa
computacional registrando los datos
completos de las pacientes. Finalmente
una vez que los exámenes han sido
analizados por microscopía se ingresa el
diagnóstico de cada paciente en el
programa computacional, se imprime el
informe para ser entregado al servicio
correspondiente y se registra la entrega
en un libro de “salida de informes”.
Proceso de Tinción y montaje de
frotis de Papanicolaou
El proceso de tinción se puede
dividir en 4 etapas principales:
1) Fijación
2) Coloración de núcleos
3) Coloración de citoplasmas
4) Aclaramiento
La fijación se realiza al
momento de la toma de muestra del
Papanicolaou aplicándole Alcohol por
Spray (CitoSpray) evitando una fijación
inadecuada por exceso o falta de esta.
Además, es fundamental que el tiempo
entre la toma de muestra y fijación sea
el mínimo posible (menos de 5
segundos).
La coloración nuclear se realiza
mediante la aplicación de Hematoxilina
de Harris, la cual, es un colorante
alcohólico basófilo.
La tinción citoplasmática se
realiza mediante colorantes alcohólicos
los cuales tiñen de forma diferencial
cada tipo celular de la muestra debido a
la existencia de una diferencia en la
afinidad electroestática por las proteínas
que tiene cada colorante. Además, la
diferencia en los tamaños moleculares
de los colorantes determina la tinción
diferencial de los citoplasmas según el
grado de diferenciación celular. El
Orange G, tiñe citoplasmas de células
maduras bien diferenciadas con
hiperqueratosis
las
que
poseen
queratinas de alto peso molecular
generando una coloración orangeofílica.
El colorante EA-50 es una mezcla de
colorantes que tiñen el citoplasma y está
compuesto por la Eosina, Verde luz y
Contacto: carlzamorano@udec.cl
Pardo Bismarck. La eosina posee mayor
afinidad electroestática desplazando al
Orange G, por lo que, tiñe los
citoplasmas de todas las células pero
finalmente son las superficiales e
intermedias las que poseen coloración
eosinófila o acidófila. El verde luz tiñe
el citoplasma de las células menos
diferenciadas ya que poseen una matriz
permeable quedando finalmente las
células basales y parabasales teñidas de
azul (basófilas o cianófilas). El Pardo
Bismarck tiene afinidad por la tinción
de la mucina, por lo que, es el
citoplasma de las células endocervicales
las que se tiñen con este colorante.
El aclaramiento es el paso final
de la tinción donde se produce la
transparencia celular, para lo cual, se
utiliza xilol como solución aclaradora.
Finalmente las muestras se
montan por medio de la unión del
portaobjeto y el cubreobjeto con una
resina, la cual, es un medio de montaje
soluble en el agente aclarante y debe
tener un índice refracción que coincida
con ambos. De esta forma se obtiene
una muestra cubierta y protegida contra
el arrugamiento, secado del material
celular y oxidación de la muestra. Con
esto se logra una imagen lo más
transparente posible permitiendo la
observación en el microscopio.
El protocolo de tinción tiene
variaciones
en
los
tiempos,
concentraciones y volúmenes de los
reactivos según el Laboratorio donde se
aplique pero se basa en los fundamentos
explicados anteriormente. En la práctica
por lo general se usan los siguientes
pasos:
1) Lavado en agua corriente:
utilizado para hidratar y limpiar
las muestras, y darle cierto
carácter acuoso. Es importante
estilar bien las muestras para
evitar la dilución y pérdida de
capacidad de tinción del
colorante utilizado en el paso
siguiente.
2) Hematoxilina
de
Harris:
utilizado para realizar la tinción
nuclear de las células del frotis.
3) Lavado en agua corriente:
utilizado para eliminar los
excesos de colorante que queden
en las muestras. Es importante
estilar bien las muestras para
evitar diluir y, por lo tanto,
disminuir la concentración del
reactivo del paso siguiente.
4) Agua ácida o Alcohol ácido:
utilizado para realizar una
diferenciación de la coloración
nuclear por la Hematoxilina,
proceso llamado “Coloración
regresiva”. Es importante que las
inmersiones sean rápidas para
evitar una disminución excesiva
de la tinción nuclear.
5) Alcohol 95%: utilizado para
darle carácter alcohólico a las
muestras para que reaccionen
con el colorante del siguiente
paso. Es importante estilar bien
las muestras para evitar la
dilución de los Alcoholes y la
pérdida de capacidad de tinción
del colorante utilizado en el paso
siguiente.
6) Orange G: colorante alcohólico
que tiñe el citoplasma de color
anaranjado, el cual tiene
afinidad electroestática con las
proteínas, de todas las células en
una
primera
instancia.
Finalmente son las células
escamosas
superficiales
queratinizadas las que obtienen
una tinción orangeofílica.
7) Alcohol 95%: utilizado para
eliminar el exceso de colorante
de las muestras. Es importante
estilar bien las muestras para
evitar la dilución de los
Alcoholes y la pérdida de
capacidad de tinción del
colorante utilizado en el paso
siguiente.
Contacto: carlzamorano@udec.cl
8) EA-50: EA-50 es una mezcla de
colorantes con afinidad por los
citoplasmas
celulares
compuestos por la Eosina que
tiñe células superficiales e
intermedias, el Verde luz que
tiñe células basales y parabasales
y el Pardo Bismarck que tiñe
células endocervicales.
9) Alcoholes 95% y 100%: es
importante estilar bien las
muestras para evitar la dilución
de los Alcoholes, alteración del
Xilol y su pérdida de capacidad
como
mordiente.
Las
inmersiones no deben ser por
mucho tiempo debido a que
disminuyen la coloración de los
colorantes citoplasmáticos.
10) Xilol:
utilizado
para
el
aclaramiento de la muestra.
Debe cambiarse si aparece
teñido con colorantes, y
también, si tiene agua la
solución
(aspecto
lechosa
macroscópicamente) lo cual
alteraría el proceso de tinción.
El paso final del proceso
consiste en el montaje del frotis de
Papanicolaou. Para esto se le agregan
un par de gotas de medio de montaje al
cubreobjetos de vidrio y se presiona
sobre el portaobjetos, o viceversa. Hay
que evitar la formación de burbujas de
aire en la lámina que se producen por la
evaporación muy rápida del solvente o
por la
disposición irregular de la
muestra. Además, hay que tener
cuidado con el espesamiento del medio
de montaje producto de la evaporación
del solvente lo que dificulta su
aplicación. También es importante
evitar que los frotis se sequen antes de
ser montados y cubiertos con resina
porque esto produce una coloración café
en el núcleo y/o citoplasma dificultando
la posterior observación al microscopio.
Es fundamental realizar una
mantención de la batería de tinción
filtrando la Hematoxilina todos los días
y cambiándola, por lo menos una vez al
mes. También se debe filtrar
diariamente la última cubeta de xilol
para retirar material celular que se haya
desprendido o en el caso que sea
necesario reemplazarlo por reactivo
nuevo. Igual de importante es cambiar
los colorantes Orange G y EA-50, por lo
menos, cada 20 días ya que pierden su
poder de tinción progresivamente
después de este periodo. Hay que
descartar los Alcoholes de enjuague
cuando ya se encuentren sobresaturados
de colorante, por lo menos, el primer
día de cada semana y, además, cambiar
la solución de HCl 0.5% (agua ácida),
por lo menos, cada 15 días.
El rol del Citotecnólogo en el
diagnóstico
Una vez procesada la muestra en
el área u oficina de microscopía el
Tecnólogo Médico especializado en
Citología (Citotecnólogo), realiza el
screening citológico, propiamente tal,
mediante la observación célula por
célula
del
frotis
identificando
variaciones en la morfología celular,
presencia o ausencia de componentes
inflamatorios,
microoganismos,
y
cualquier característica que permita
asignar un diagnóstico ya sea de
lesiones
precursoras,
neoplasias,
inflamación, calidad de muestra, entre
otros. El informe del screening por lo
general se entrega en una nomenclatura
diagnostica que va de la A-Z donde
cada letra corresponde a ciertas
características observadas en el frotis.
Finalmente el Patólogo determina y le
asigna un diagnóstico final y en base a
eso se determina el posible tratamiento
en el caso que sea necesario.
Conclusiones
Es necesario que la muestra
circule por una serie de pasos a lo largo
del procesamiento en el Laboratorio de
Contacto: carlzamorano@udec.cl
Citopatología para poder realizar el
diagnóstico.
Es clave que el proceso se
realice de la forma más rigurosa
posible, ya que, cualquier error en
alguno de los pasos podría generar una
confusión a lo largo del procedimiento
generando la pérdida de la muestra y la
necesidad de volver a realizar el
examen. Además, es fundamental que
cada persona realice con la mayor
eficiencia posible los roles que tienen
designados.
Cada día es importante realizar
una rutina para ingresar las solicitudes y
sus
diagnósticos
al
programa
computacional para tener una base de
datos confiable y de fácil acceso.
El trabajo que se realiza en el
Laboratorio de Citopatología es
indispensable dentro del programa de
pesquisa de cáncer de cuello uterino y
es
posible
gracias
al
trabajo
multidisciplinario del equipo de salud
especializado.
Carlos Zamorano es el autor principal de este
artículo realizado con la colaboración de Julieta
Sepúlveda. Para mayor información sobre el
tema contactar al correo ubicado al pie de
página.
www.morfocitologia.blogspot.com
Contacto: carlzamorano@udec.cl