Concurso: Proyecto Química ORT del Genoma Humano Subsidios a la Investigación en: Bioquímica Molecular y Genética Año 2015 REGULACIÓN DE LA MUERTE CELULAR PROGRAMADA DE UNA LÍNEA CELULAR TUMORAL (MEG01) Directora del Proyecto: Dra. Paola D’Atri Lugar del trabajo: Laboratorio Trombosis Experimental Instituto de Medicina Experimental (CONICET-Academia Nacional de Medicina) Pacheco de Melo 3081 - Ciudad Autónoma de Buenos Aires INTRODUCCIÓN Desde el embrión hasta el organismo adulto fisiológicamente sano, millones de células mueren de manera programa en un proceso denominado Apoptosis. Este fenómeno no tiene lugar de forma aleatoria sino que se trata de un proceso activo, genéticamente bien definido, en el que las células están destinadas a morir en un tiempo determinado. La apoptosis es un proceso fisiológico que controla el normal desarrollo y funcionamiento de los organismos multicelulares, ya que interviene en la embriogénesis, la homeostasis tisular y los procesos inmunes [1]. Alteraciones en este proceso pueden contribuir a una gran variedad de enfermedades, incluyendo cáncer, autoinmunidad y desórdenes degenerativos [2]. La muerte celular puede ocurrir básicamente por dos mecanismos diferentes, necrosis o apoptosis. Estos difieren tanto en sus características morfológicas y moleculares como en las consecuencias que ocasionan al tejido circundante. Durante el proceso de apoptosis las células sufren cambios metabólicos y morfológicos como el encogimiento celular, la fragmentación de la membrana plasmática, condensación del núcleo y fragmentación nuclear. Se produce además, disrupción de la arquitectura del citoesqueleto, la célula se contrae y se liberan fragmentos celulares envueltos por membrana, conocidos como cuerpos apoptóticos que rápidamente son ingeridos por macrófagos u otras células fagocíticas [3]. Debido a que el fraccionamiento celular mediante liberación de cuerpos apoptóticos no induce liberación de citoquinas no desencadena una concomitante respuesta inflamatoria [4, 5]. La necrosis, a diferencia de la apoptosis, puede ser clasificada como una forma violenta o catastrófica de muerte celular que ocurre como consecuencia de un daño traumático o mediante la exposición a toxinas, es decir, es un proceso pasivo, desregulado y disparado por un estímulo no fisiológico. Este proceso no requiere de energía en forma de ATP ni de la síntesis de ácidos nucléicos o proteínas. Morfológicamente se observa hinchazón y falla mitocondrial, así como también disfunción de la membrana plasmática, pérdida de la homeostasis y ruptura celular con la consecuente liberación del contenido intracelular. Este fenómeno conduce hacia la muerte a células vecinas y al mismo tiempo se atraen macrófagos y demás células inflamatorias al área necrosada [5, 6]. Figura 1: Diferencias entre el proceso de necrosis y el de apoptosis. Vías y moléculas que participan en la apoptosis. El proceso apoptótico puede ser desencadenado tanto por señales intracelulares como extracelulares las cuales convergen en una maquinaria común de destrucción celular que es activada enzimaticamente por cisteínoproteasas. El desmantelamiento celular se traduce en proteólisis de constituyentes celulares vitales, degradación del ADN y fagocitosis de la célula afectada por células vecinas [7]. Cuando las señales de muerte o ligandos de muerte (death ligands, DL) son reconocidas por receptores de muerte (death receptors, DR) que se expresan en la membrana plasmática de alguno tipos celulares, se habla de apoptosis extrínseca. Recibida la señal, estos receptores inician en segundos una cascada de señalización molecular en la que juegan un papel fundamental un grupo de enzimas proteolíticas denominadas caspasas que ejecutan la muerte de la célula en pocas horas. Los DR pertenecen a la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNF), caracterizados por poseer un dominio intracelular llamado dominio de muerte (death domain, DD). Los DR caracterizados hasta el momento son, el receptor de TNF-1 (TNFR1), Fas, DR3, DR4 y el DR5 que son activados por sus respectivos ligandos pertenecientes a la superfamilia del TNF. La activación del DD promueve el reclutamiento de la procaspasa-8 activándola. La caspasa-8 es una caspasa iniciadora que tiene la capacidad de clivar a otras caspasas conocidas como caspasas efectoras. Las caspasas efectoras clivan más de 40 sustratos, todos ellos componentes estructurales de la célula, de manera tal que la célula es “desarmada”. En el proceso de desarme celular las caspasas inactivan proteínas que protegen a la célula de la apoptosis activando nucleasas que fragmentan el ADN. Además destruyen moléculas que regulan la estructura del citoesqueleto celular haciendo que la célula pierda su forma y el contacto con células vecinas, se desarma el núcleo y se suprime la reparación y replicación celular. Todo este proceso produce cambios en la membrana celular como la exposición de fosfatidilserina, un lípido que en células normales se encuentra en la cara interna de la bicapa lipídica, y que sirve como “etiqueta” para aquellas células que deben ser fagocitadas. Finalmente la célula se fragmenta formando cuerpos apoptóticos que contienen parte del citoplasma celular y que son fagocitados por los macrófagos [7]. El proceso apoptótico puede desencadenarse no solo por la vía extrínseca, sino que también puede dispararse por señales de estrés celular detectadas en el citoplasma de la célula en lo que se conoce como apoptosis intrínseca. Dentro de los estímulos que activan esta vía se encuentran el daño al ADN, el estrés oxidativo, una sobrecarga de Ca2+ citoplasmático y estrés del retículo endoplasmático entre otros. En la apoptosis desencadenada por esta vía juega un papel muy importante la mitocondria y la familia de proteínas Bcl-2. La superfamilia de las proteínas Bcl-2 está constituida por miembros anti- y pro-apoptóticos claves en la regulación de la muerte celular programada. El balance entre los miembros de pro- antiapoptóticos en el citoplasma celular define el destino final de la célula, de esta manera, cuando predominan los miembros anti- por sobre los pro-apoptóticos la célula sobrevive, en caso contrario la célula muere por apoptosis [8]. En el proceso de apoptosis por vía mitocondrial la activación de caspasas se da posteriormente a la activación de los miembros pro-apoptóticos de la familia bcl-2 que promueven la permeabilidad de la membrana mitocondrial. La pérdida de la integridad de la membrana mitocondrial detiene la síntesis de ATP y promueve la liberación de proteínas mitocondriales como el citocromo c y APAF1 al citoplasma de la célula. Estas dos moléculas forman en presencia de ATP una estructura conocida como Apoptosoma que recluta a la procaspasa iniciadora -9. La activación de la caspasa9 desencadena la cascada de activación de caspasas efectoras como la caspasa-3 resultando en la ejecución del proceso de muerte. En algunos tipos celulares, la vía extrínseca puede conectarse con la vía intrínseca a través de uno de los miembros pro-apoptoticos de la familia bcl-2 llamado Bid que al ser clivado por la caspasa-8 se genera un fragmento permeabilizador de la mitocondria [9]. Figura 2: Distintos mecanismos que conducen a apoptosis. La apoptosis inducida vía receptores de muerte involucra el reclutamiento de proteínas adaptadoras, la activación de caspasa-8 (iniciadora) y la subsiguiente activación de caspasas efectoras como la caspasa-3. En la muerte celular inducida por estrés se produce la liberación de citocromo-c desde la mitocondria. El cit-c se une al APAF-1 y procaspasa-9 conformando el apoptosoma que promueve la autoactivación de la caspasa-9, quien a continuación activa a la caspasa-3. Apoptosis y cáncer En la mayoría de los procesos patológicos los mecanismos moleculares son desregulados y pueden estar en un estado hiper-activado o excesivamente inhibido. Una de las patologías donde la apoptosis se encuentra inhibida o bloqueada es el cáncer. Normalmente la muerte celular programada elimina a las células que no realizan un correcto ciclo celular o tienen un grosero daño a nivel de su ADN. Sin embargo en muchos tumores se han identificados mutaciones en las proteínas antiapoptóticas, que las hacen hiperactivas, o en proteínas pro-apoptóticas que las hacen menos efectivas, permitiendo la proliferación celular por sobre la detención del ciclo y la subsecuente apoptosis celular. Cuando esto ocurre, la progenie de estas células llevará la misma anomalía y seguirá proliferando sin control. OBJETIVO El objetivo de este proyecto de investigación es evaluar el efecto de factores extrínsecos e intrínsecos en el gatillo del proceso apoptótico en una línea celular tumoral Meg-01. TÉCNICAS A EMPLEAR Cultivo de la línea tumoral Meg-01 La línea celular Meg-01 fue establecida a partir de las células de médula ósea de un paciente con leucemia mielógena crónica en el año 1985. Estas células crecen en suspensión y tardan entre 36 y 48 horas en dividirse. Se cultivan de manera estéril con un medio de cultivo denominado RPMI 1640 en presencia de suero fetal bovino y antibióticos a 37ºC en una atmosfera de 5% de CO2. Inducción de apoptosis Se inducirá apoptosis sobre las células utilizando la citoquina TNF como promotor de la apoptosis extrínseca y un dador de óxido nítrico como inductor de apoptosis intrínseca. Como control positivo las células serán cultivadas en ausencia de suero. El porcentaje de apoptosis será evaluado a diferentes tiempos y con técnicas específicas descriptas posteriormente. Determinación de la proliferación celular Se evaluará si los inductores de apoptosis afectan la tasa de proliferación celular por recuento de las células en cámara de Neubauer. El número de células viables se determinará utilizando un colorante vital denominado azul trypan. La proliferación y viabilidad celular será cuantificada con un ensayo colorimétrico utilizando un reactivo que funciona como sustrato de la enzima fosfatasa ácida, presente y funcional en células viables, que genera un producto de color que es medido por espectrofotometría. Detección de muerte celular por microscopía de fluorescencia Para evaluar el porcentaje de apoptosis, 24 o 48 horas después de la inducción del estímulo se realizará una tinción con dos colorantes (naranja de acridina y bromuro de etidio) que permiten identificar por microscopía de fluorescencia si las células son viables, apoptóticas o necróticas. Se calculará el procentaje de células en cada estadio por recuento de al menos 100 células por tratamiento. Detección de muerte celular por citometría de flujo La apoptosis será evaluada y cuantificada por cambios en los parámetros de tamaño (parámetro FSC-H) y complejidad (SSC-H) que presentan las células a través de la utilización de un citómetro de flujo. En este equipo cada una de las células es visualizada por un láser que a través de un software acoplado genera un gráfico de puntos (como muestra la figura 3) cada uno de los cuales corresponde al tamaño y la complejidad celular de cada una de las células evaluadas. Con esta técnica se puede cuantificar y estudiar un gran número de células, generando valores estadísticamente más confiables. En el caso de inducción de apoptosis las células disminuyen en tamaño y aumentan su complejidad intracelular generando una nueva población visualizada por el citómetro (Figura 3). FIGURA 3: EVALUACIÓN DE APOPTOSIS POR CITOMETRÍA DE FLUJO. El gráfico de puntos de la izquierda muestra una población de células homogénea (viables). En el gráfico de la derecha se observa una nueva población correspondiente a las células apoptóticas delimitada por una región generada por el software. Además se evaluará por citometría de flujo la degradación del ADN celular, mediante la incorporación de un colorante que se intercala en el ADN y emite fluorescencia que puede ser captada por el citométro. El porcentaje de células apoptóticas será considerado como la cantidad de células hipodiploides, es decir, con menor fluorescencia que la observada en el pico diploide. REFERENCIAS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Kroemer, G., et al., The biochemistry of programmed cell death. Faseb J, 1995. 9(13): p. 1277-87. Barr, P.J. and L.D. Tomei, Apoptosis and its role in human disease. Biotechnology (N Y), 1994. 12(5): p. 487-93. Van Cruchten, S. and W. Van Den Broeck, Morphological and biochemical aspects of apoptosis, oncosis and necrosis. Anat Histol Embryol, 2002. 31(4): p. 214-23. Choi, B.M., et al., Nitric oxide as a pro-apoptotic as well as anti-apoptotic modulator. J Biochem Mol Biol, 2002. 35(1): p. 116-26. Kerr, J.F., A.H. Wyllie, and A.R. Currie, Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer, 1972. 26(4): p. 239-57. Hirsch, T., et al., The apoptosis-necrosis paradox. Apoptogenic proteases activated after mitochondrial permeability transition determine the mode of cell death. Oncogene, 1997. 15(13): p. 1573-81. Strasser, A., L. O´Connor, and V.M. Dixit, Apoptosis Signalling. Annu. Rev. Biochem, 2000. 69: p. 217-45. Antonsson, B. and J.C. Martinou, The Bcl-2 protein family. Exp Cell Res, 2000. 256(1): p. 507. Gross, A., et al., Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release, while BCL-XL prevents this release but not tumor necrosis factor-R1/Fas death. J Biol Chem, 1999. 274(2): p. 1156-63.