PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES PARA DIAGNÓSTICO DE LEPTOSPIRA CANICOLA EN CANIDOS DOMESTICOS. M.V Esteban Chuquipoma Guevara Especialidad en Laboratorio Clínico Veterinario INTRODUCCIÓN. En estos últimos años la población canina domestica ha ido incrementando, la introducción y crianza de los canidos como mascotas ha tomado auge por la gran variedad de razas y las facilidades actuales para adquirirlas. Este auge no solo se evidencia en las grandes ciudades sino también en pequeñas poblaciones, pero las proyecciones futuras de esta población como así mismo su estabilidad dependen en gran medida del control de las enfermedades infecciosas que las puedan afectar. Leptospira canícola, es el agente causal de una enfermedad altamente contagiosa que afecta a canidos de todas las edades produciendo una muy alta mortalidad. Los que sobreviven a la infección pueden convertirse en portadores que, en cualquier momento, pueden infectar animales susceptibles. Por lo tanto, es de importancia contar con métodos que permitan identificar la bacteria en animales infectados con el objeto de considerar las medidas adecuadas y así evitar su propagación y reducir la mortalidad. Leptospira canícola es una bacteria Gram negativa del orden de los espiroquetales, ya ha sido detectado en Perú e incluso caracterizado bioquímicamente. La membrana celular de Leptospira presenta lipoproteínas que actúan como antígenos de la membrana externa también existe una flagelina periplásmica que actúa también como antígeno. OBJETIVO. El objetivo de esta investigación está dirigida a la creación de anticuerpos monoclonales para la detección de los antígenos bacterianos de pared celular de Leptospira canícola. MATERIALES Y METODOS. Inmunización Se utilizaron preparaciones puras de antígeno, evitando de esta manera el peligro de competencia antigénica, luego se inocularon vía subcutánea a conejos en forma de emulsión a intervalos de dos semanas para asegurar una buena estimulación y amplificación de los clones de linfocitos B específicos para el antígeno de interés “(Harlow y Lane, 1988”), luego se obtuvo el bazo del animal inmunizado. Fusión Luego de la suspensión de células esplénicas previamente purificados se obtuvieron linfocitos B lo cuales se mezclaron con un número apropiado de células de mieloma, las cuales se mantuvieron creciendo exponencialmente in vitro. Posteriormente se fusiono a 37º la mezcla de células en un pequeño volumen de polietilenglicol (PEG) y se mezcló suavemente por espacio de uno a tres minutos. En estas condiciones, las membranas de algunas de las células se fusionan, uniéndose los citoplasmas y formándose los hibridomas. El PEG luego se elimina por lavado y las células fusionadas se siembraron en microplacas de cultivo (“Yokoyama, 1992”). El proceso de fusión es muchas veces muy ineficiente: en general, menos del 1% de las células terminan fusionándose (“Johnstone y Thorpe, 1987; Harlow y Lane, 1988”). Esto trae como consecuencia que se requiera de un número de células relativamente alto para el proceso de fusión (un bazo de ratón contiene del orden de 101 células). En algunas circunstancias es posible enriquecer la población de linfocitos B específicos para el antígeno, lo cual se logra asociando el antígeno a una fase sólida y utilizando procedimientos de aislamiento como separación inmunomagnética (“Ossendorp et al., 1989 Lundkvist et al., 1993”) o roseteo con glóbulos rojos recubiertos con el antígeno de interés (“Myers et al., 1986”). De tenerse el equipo necesario, en los casos en los que se dispone de pocas células, es preferible realizar la fusión mediante el proceso denominado electrofusión, el cual resulta mucho más eficiente (“Foung, 1990”). Selección La mezcla de células obtenidas estuvo formada por esplenocitos, células de mieloma, esplenocitos fusionados entre sí, células de mieloma fusionadas entre sí y además por los hibridomas linfocito B-célula de mieloma, de tal manera que se procedió a seleccionar solamente el crecimiento de los hibridomas, eliminando a las células mielomatosas. Esto se obtuvo con el llamado medio HAT y el fundamento en que se basa es el siguiente: Las células eucariotas disponen de dos vías para la síntesis del ADN. Una es la llamada "vía principal o de novo" y la otra es la "vía de rescate", en la cual se requiere la enzima hipoxantina-guanina-fosforibosiltransferasa (“Harlow y Lane, 1988”). La clave de la selección está en que las células de mieloma que se utilizan para la fusión son deficientes en la enzima HGPRT, es decir, que sintetizan su ADN únicamente por la vía principal. Esta vía principal puede ser bloqueada por la adición de la droga aminopterina (“Hudson y Hay, 1989”). De manera que, si al medio de cultivo en el que crece el producto de fusión se añade aminopterina, las células mielomatosas no fusionadas o fusionadas entre sí morirán, ya que serán incapaces de sintetizar ADN. Si consideramos ahora las células híbridas, éstas tienen la capacidad de crecimiento tumoral heredada de las células mielomatosas, pero también tienen el gen que codifica la enzima HGPRT, heredado de los linfocitos normales, pudiendo sintetizar ADN por la vía de rescate. De esta forma, en presencia de Hipoxantina-AminopterinaTimidina (HAT) las únicas células con capacidad de crecimiento, "seleccionadas" gracias a un fenómeno de complementación génica, son las híbridas. Existe aún otro evento de selección, el cual está destinado a identificar y aislar, del total de híbridos producidos, a los hibridomas productores de los anticuerpos de interés. La identificación se logra con un método apropiado para la evaluación de los sobrenadantes de cultivo y el aislamiento se realiza mediante el clonamiento. Evaluación de los sobrenadantes de cultivo Luego de diez días post-fusión, en cada pozo de cultivo crecieron varios híbridos, cada uno produciendo un anticuerpo distinto y era necesario aislarlos para obtener anticuerpos de una sola especificidad. Para determinar en cuáles cultivos se encuentran los anticuerpos con la especificidad deseada, y por ende las células productoras de los mismos, se realizaron ensayos de evaluación o "screening" en los sobrenadantes de cultivo, para esto se utilizó pruebas de aglutinación debido a que el antígeno es de pared. Clonamiento Se procedió a obtener células idénticas por replicación a partir de una sola. El método que se utilizó para esto consistió en sembrar suspensiones celulares a gran dilución de manera que en un volumen dado pueda haber en promedio de ninguna a unas pocas células, para evitar la dificultad de este método llamado de dilución al límite (“Harlow y Lane, 1988”), se utilizó células nodriza (fibroblastos) las cuales proveyeron la ayuda necesaria para el crecimiento a baja densidad (“James y Bell, 1987”). RESULTADOS y DISCUSION. Luego de haber superado todos los inconvenientes se logrado obtener el hibridoma productor del anticuerpo deseado, como resultado de la fusión se obtuvieron un total de 285 hibridomas de los cuales sólo 122 fueron secretores, estos últimos, 32 sobrenadantes dieron positivos. el próximo paso es su cultivo a escala para obtener el anticuerpo en las cantidades deseadas. La producción a mediana escala de los anticuerpos se puede efectuar inoculando el hibridoma correspondiente en la cavidad peritoneal de ratones singénicos a la línea de mieloma utilizada para la fusión y haciéndolo crecer como un tumor mielomatoso, obteniéndose el anticuerpo en forma de líquido ascítico (Gavilondo, 1990). A otra escala de producción, el cultivo se puede hacer en botellas rotatorias, en fibras huecas o en fermentadores especiales diseñados para tal fin (Freshney, 1987; Corrigan, 1988; Lubiniecki, 1990). Para aplicaciones clínicas el anticuerpo debe estar caracterizado tanto química como funcionalmente y con un alto grado de pureza (Sullman, 1989; Lucas, 1989; Ronneberger, 1989). Otro aspecto de importancia para la producción es el almacenaje de los hibridomas. Esto se logra mediante congelamiento en tanques especiales de nitrógeno líquido, en los cuales las células son congeladas cuando se encuentran creciendo en fase exponencial y con un alto ponerle de viabilidad. (Daggett y Simione, 1987). Bibliografía. 1. Carrol K., E. Prosser y R. O'Kennedy (1990): Parameters involved in the in vitro immunization of tonsilar lymphocytes: Effects of rIL-2 and muramyl dipeptide. Hybridoma 9:81. 2. Corrigan A.H. (1988): Biotechnology 6:784. Large-scale in vitro, current status. 3. Castaño JC, Martínez AR, Marcet R, Sarracent J. Producción de anticuerpos monoclonales contra las proteínas mayoritarias de la membrana p30 (SAG 1) y p22 (SAG 2) de Toxoplasma gondii. Revista de Investigaciones Universidad del Quindío 2003;4:97-106. 4. Daggett P.M. and F.P. Simione (1987): Cryopreservation manual, Nalge Company. 5. De la Peña-Moctezuma A, Bulach DM, Adler B. Genetic differences among the LPS biosynthetic loci of serovars of Leptospira interrogans and Leptospira borgpetersenii. FEMS Immunol Med Microbiol 2001; 31: 73-81. 6. Espinoza, J.C., C. Cisternas, F. Cifuentes R. Enriquez, J. kuznar. 1996. 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