RESULTADOS Inmunización de Ratones de la Cepa C3H/HeJ con la Proteína PE_PGRS33 de M. tuberculosis Para inducir una respuesta inmune celular in vivo y estimular las células T de los ratones, éstos se inmunizaron con la proteína PE_PGRS33 en cada cojinete plantar. Posteriormente, se llevó a cabo la extracción de los 10 ganglios linfáticos poplíteos; y se observó un aumento en su tamaño, indicando la presencia de activación celular. Se obtuvieron 118 millones de células de nódulo linfático, cantidad que se esperaba, ya que lo estimado son 10 millones de células, por cada ganglio linfático activado. Las células obtenidas se incubaron in vitro en presencia de 1 µM de la proteína PE_PGRS33. Fusión Celular de las Células de Nódulo Linfático de Ratón C3H/HeJ con las Células de Timoma BW5147 α-βPara la generación de los hibridomas de células T, después de la estimulación in vitro con la proteína PE_PGRS33, se llevó a cabo la fusión celular de las células de nódulo linfático del ratón, con las células BW5147α-β-; las cuales, carecen del receptor de células T y por lo tanto no tienen especificidad. 26 La proporción de células que se utilizaron fueron 25 millones de células de nódulo linfático y 75 millones de las células tumorales BW5147α-β-; las cuales se fusionaron con polietilenglicol 1500 al 50%, el cual permitió la fusión de ambas membranas celulares. Posteriormente, las células se colocaron en 10 placas de cultivo de 96 pozos para su expansión; 5 placas a una concentración de 5 x105 células/mL y 5 placas a 2.5 x105 cel/mL. Para la expansión celular se utilizó el medio selectivo HAT. El medio HAT permite solamente el desarrollo de las células híbridas, y no de las células tumorales. Para que las células proliferen, se necesita la síntesis de ácidos nucleicos, mediante una de las dos vías que existen: la vía clásica o “de novo”y la vía alterna; donde ésta última utiliza la enzima Hipoxantina Guanidina Fosforribosil Transferasa (HGPRT). Las células tumorales carecen de tal enzima, por lo que no pueden utilizar la hipoxantina ni la timidina del medio, pero tampoco pueden utilizar la vía “de novo”” porque es bloqueada por la aminopterina. En cambio, los hibridomas si proliferan, porque conservan la enzima HGPRT proveniente de las células T de ratón. Para verificar la actividad del medio selectivo HAT, se realizó una curva de proliferación de las células tumorales BW5147 α-β- en medio HAT y se comprobó que estas células, no sobrevivieron después de 48 horas (Figura 3). 27 Concentración (cel/mL) 120000 100000 Células BW5147/mL 80000 60000 40000 20000 0 0 24 48 72 Tiempo (hr) Figura 3. Curva de proliferación de las células BW5147α-β- en medio HAT. Las células BW5147α-β- no sobrevivieron en medio HAT después de 48 horas, confirmando la actividad del medio selectivo. 28 Selección de los Hibridomas Generados Después de la Fusión Celular A partir del décimo día después de la fusión celular, se seleccionaron los primeros hibridomas de células T; los cuales a consecuencia de la proliferación, provocaron el viraje del pH del medio HAT y por lo tanto un cambio en su color; lo cual permitió la selección de las células con mayor facilidad. Una vez seleccionados los hibridomas, éstos se colocaron en placas de cultivo de 48 pozos con medio HT para expandirlas y restaurar la vía de “novo” para la síntesis de ácidos nucleicos. La selección de los hibridomas se llevó a cabo en 12 días, a partir del día 10 después de la fusión, hasta el día 21, y se obtuvieron un total de 169 hibridomas (Tabla 1). El 40% de los hibridomas generados (68) no sobrevivieron debido a diferentes causas, entre ellas la inestabilidad celular y los cambios en diferentes medios de cultivo. Por otra parte, la morfología de los hibridomas de células T es muy característica, ya que presentan una forma irregular y son de mayor tamaño que las células T. Los hibridomas generados en este proyecto, concuerdan con éstos rasgos (Figura 4). 29 Tabla I. Hibridomas de células T seleccionados después de la fusión. 1a 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Total 1b 0 6 4 4 6 0 0 2 0 0 0 1 23 2 3 7 7 4 2 0 0 0 0 0 0 1 24 3 2 3 5 1 0 3 0 0 1 0 1 1 17 4 2 6 4 6 3 0 0 0 0 0 0 2 23 5 4 5 5 5 2 0 0 0 1 1 1 1 25 6 0 2 2 1 0 0 0 1 0 0 0 0 6 7 0 7 0 1 2 0 0 0 0 0 0 0 10 8 4 0 5 4 0 1 0 0 1 0 0 0 15 9 2 1 4 3 0 0 1 0 0 1 0 1 13 10 1 0 5 2 3 0 1 0 0 0 0 1 13 Total 18 37 41 31 18 4 2 3 3 2 2 8 169 No. placa (a) Días de selección de los hibridomas. (b)Número de placas de cultivo de 96 pozos. Las placas de cultivo de la número 1 al 5, tienen una concentración de 5 x105 cél/mL y las placas del 6 al 10, tienen una concentración celular de 2.5 x105 cél/mL. 30 Figura 4. Morfología de los hibridomas de células T. Los hibridomas de células T generados, presentan una forma semi-redonda e irregular, como “gota de agua”. 31 Tamizaje de Hibridomas de Células T Específicos Contra la Proteína PE_PGRS33 Una vez seleccionados los hibridomas y que se expandieron en placas de cultivo de 48 pozos, se realizó el tamizaje de los mismos, mediante un sistema de procesamiento y presentación de antígeno. Para poder evaluar si los hibridomas de células T generados reconocieron específicamente a la proteína PE_PGRS33, se estableció un sistema de presentación antigénica in vitro, utilizando como CPA a las células M12Ak.C3F6, las cuales presentan el mismo haplotipo del MHC clase II, que las células del ratón C3H/HeJ. La medición de la proliferación de las células CTLL-2, inducida por la presencia de IL-2 en el ensayo de los hibridomas de células T, nos permitió evaluar indirectamente la presencia de hibridomas específicos contra la proteína PE_PGRS33, mediante el ensayo con MTT. Se realizaron 16 tamizajes, evaluando todos los hibridomas de células T obtenidos, y se compararon los cambios morfológicos de las CTLL-2 con el sobrenadante de los hibridomas, con los cambios en los controles positivos (CTLL-2 + IL-2) y controles negativos (CTLL-2 + medio de cultivo) (Figura 5). En base ha este criterio, se seleccionaron dos hibridomas, en los cuales fue muy evidente la diferencia entre el pozo con células CTLL-2 y la proteína y el pozo sin proteína. Estos hibridomas fueron el 3C2 y el 2F9. Además, se encontraron otros hibridomas, el 2B6, 3F8 y 7E7, cuyos sobrenadantes con la IL-2 indujeron una mayor proliferación de las CTLL-2, en el ensayo de MTT. En la Figura 6, se muestra un resultado representativo, de la proliferación de las células CTLL-2, debido a la activación de los hibridomas específicos (2B6, 3F8 y 7E7) e hibridomas autorreactivos, así como los hibridomas que no se activaron (Figura 6). 32 a) b) Figura 5. Morfología de las Células CTLL-2 en presencia y ausencia de IL-2. a) Control positivo de células CTLL-2. b) Control negativo. 33 Proliferación CTLL-2 D.O. 570-655 nm 1.4 0.5 μM PE_PGRS33 1.2 0.0 μM PE_PGRS33 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Positivo Negativo 3F8 7E7 2B6 Hibridomas específicos 4E8 10F4 Hibridomas autorreactivos 4G10 6G6 5D4 Hibridomas inespecíficos Hibridomas de Células T Figura 6. Ensayo de proliferación de las células CTLL-2. En la figura se muestran 3 hibridomas específicos contra la proteína PE_PGRS33 (3F8, 7E7, 2B6), 2 hibridomas autorreactivos (4E8, 10F4) y 3 hibridomas inespecíficos (4G10, 6G6, 5D4). Se utilizaron como controles internos: células CTLL-2 más IL-2 (1:150) (Positivo) y células CTLL-2 más medio D5F (Negativo). La línea basal indica el valor de la D.O. del control negativo 0.230. 34 Subclonación de los Hibridomas de Células T Específicos Contra la Proteína PE_PGRS33 Los 5 hibridomas de células T que se identificaron como específicos contra la proteína PE_PGRS33, se subclonaron con el propósito de separar las posibles clonas de células T presentes y poder identificar las clonas específicas, mediante un nuevo ensayo de hibridomas de células T. Para la subclonación, se realizó una dilución limitante. Después de la Subclonación de los hibridomas 3C2, 2F9, 3F8, 7E7 y 2B6, se obtuvieron un total de 87 subclonas de las cuales, solo se pudieron evaluar las provenientes de los hibridomas 3C2 y 2F9 (Tabla II). Las subclonas que resultaron específicas contra la proteína PE_ PGRS33 en el ensayo de proliferación de las CTLL-2 fueron: 3C2.D4, 3C2.F5, 3C2.E7, 2F9.B7 y 2F9.E7 (Figura 7). 35 Tabla II. Subclonas obtenidas de los hibridomas de células T específicos contra la proteína PE_PGRS33. Hibridomas No. de subclonas Subclonas específicas 3C2 8 3 2F9 7 2 3F8 24 N.E. 2B6 23 N.E. 7E7 25 N.E. Total 87 5 Se obtuvieron 87 subclonas de los 5 hibridomas específicos contra la proteína PE_PGRS33, de los cuales solamente se evaluaron las 15 subclonas de los hibridomas 3C2 y 2F9 mediante ensayos de proliferación de las CTLL-2. (N.E.) No Evaluado. Las subclonas de los hibridomas 3F8, 2B6 y 7E7 no se evaluaron debido a problemas con el cultivo de las CTLL-2; ya que el cultivo continuo de esta línea celular provocó la pérdida de sensibilidad y confiabilidad de la misma. 36 0.5 μM PE_PGRSS33 0.0 μM PE_PGRSS33 Proliferación CTLL D.O. 570-655 nm 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 Positivo Negativo 2F9.B7 2F9.E7 3C2.D4 3C2.F5 3C2.E7 Hibridomas de Células T Figura 7. Hibridomas específicos contra la proteína PE_PGRS33. En la figura se muestran las 5 subclonas específicas contra la proteína PE_PGRS33, provenientes de los hibridomas 2F9 y 3C2. Se utilizaron como controles internos: células CTLL-2 más IL-2 (1:150) (Positivo) y células CTLL-2 más medio D5F (Negativo). La línea basal indica el valor de la D.O. del control negativo 0.073. 37 DISCUSIÓN La importancia que tiene la respuesta inmune celular en el control de la tuberculosis, es mundialmente conocida, por lo que estudios sobre la inducción de esta respuesta contra antígenos de M. tuberculosis, son cada vez más solicitados. Para que se genere una respuesta celular eficiente contra M. tuberculosis, se necesita la activación de las células T, que tras reconocer específicamente determinantes antigénicos de la micobacteria asociados a moléculas del MHC clase II de las CPA; activan su mecanismo de transducción de señal y trascripción de genes, y codifican para la síntesis de citocinas como el IFN-γ principalmente; ya que esta citocina es de gran relevancia para erradicar la enfermedad (Boyer M y col., 1988; Van Crevel y col., 2002). El caracterizar las principales proteínas de M. tuberculosis que actúan como factores de virulencia, resulta de gran ayuda para poder identificar las proteínas candidatas, que inducen una fuerte respuesta inmune celular. Sin embargo, M. tuberculosis puede evadir la respuesta inmune celular mediante diferentes mecanismos, como lo es la expresión selectiva de genes que le confieren a la micobacteria infectar y sobrevivir dentro de los macrófagos. Algunos de los genes que se expresan preferentemente pertenecen a la familia de genes PE, en donde la mayoría de los miembros de esta familia están implicados en la replicación y sobrevivencia del bacilo en el granuloma. Se ha reportado, que muchos antígenos de M. tuberculosis interactúan con las células T durante la presentación de antígeno e inducen una apoptosis en las células T y en macrófagos, sugiriendo el por qué se puede dar la 38 reactivación de la TB y la persistencia del bacilo tuberculoso (latencia). La apoptosis de células T es considerada como un mecanismo regulatorio importante en la respuesta inmune y está involucrada en la pérdida de funciones efectoras durante muchas enfermedades infecciosas (Balaji y col., 2007). La proteína PE_PGRS33 que se utilizó en este estudio, representa el prototipo de la familia de genes PE, ya que presenta como ventajas el encontrarse en la superficie de la micobacteria y quedar expuesta al ambiente extracelular permitiéndole interactuar con las células del huésped (Delogu G y col., 2004; Ramakrishnan y col., 2000); presenta una secuencia de genes polimórficos, que le confieren la característica de variabilidad antigénica y así poder evadir la respuesta inmune del huésped (Cole ST y col., 1998; Gey van Pittius y col., 2006); se encuentra asociada a las cepas del complejo de M. tuberculosis; pero sobre todo, que el dominio constante amino terminal de su estructura (PE), es el responsable de la inducción de la respuesta inmune celular contra esta proteína (Delogu G y cols., 2001). Es por ello que la proteína PE_PGRS33 representa un paso crucial hacia el mejor entendimiento de la patogénesis inducida por el bacilo tuberculoso. Para poder evaluar la inducción de la respuesta inmune celular de esta proteína, en un sistema in vitro de procesamiento y presentación de antígeno, se necesitan herramientas biológicas como los hibridomas de células T; que permitan la caracterización inmunológica de la proteína y la identificación de los epítopes inmunodominantes. La gran ventaja de generar estos hibridomas, es que expresan un TCR con la especificidad de las células T activadas de ratón, y proliferan abundantemente en ausencia de factores de crecimiento o células “feeder”; por lo que son muy útiles para estudios de especificidad en el reconocimiento antigénico por el complejo MHC-TCR. 39 En este trabajo se lograron generar al menos 5 hibridomas específicos contra la proteína (3C2, 2F9, 7E7, 2B6 y 3E7), lo cual nos permitirá utilizarlas en futuras investigaciones, para identificar específicamente los epítopes o determinantes antigénicos de la proteína, responsables de la inducción de la respuesta inmune celular. Un método para identificarlos, consiste en sintetizar los péptidos utilizando técnicas de espectrometría de masas y la información disponible del genoma de M. tuberculosis; para posteriormente, evaluarlos en ensayos in vitro de inducción de la respuesta inmune o in vivo en modelos murinos. Sin embargo, esta técnica resulta costosa y consume mucho tiempo. Una alternativa más viable, es hacer uso de los algoritmos y modelos matemáticos existentes, que permiten hacer estimaciones sobre los posibles péptidos de unión a las moléculas de MHC de clase I y II de diferentes especies (Yu y col., 2002). Esta información esta disponible en programas y base de datos como el PEPTIDE CUTTER y el SYFPEITHI, en los cuales se pueden hacer análisis de los posibles sitios de corte de la proteína, por enzimas proteolíticas y predecir los ligandos óptimos del MHC, respectivamente (Ver Apéndice V y VI). De tal manera, que con las predicciones de los epítopes potenciales de células T y los hibridomas generados, podamos contribuir con la búsqueda y diseño de vacunas de nueva generación, que brinden una mayor y mejor protección, que la única vacuna existente hasta el momento, la BCG (Chaitra y col., 2005). 40