elemento regulador que confiere especificidad de tapetum.

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
k
kInt. Cl. : C12N 15/82
11 Número de publicación:
7
51
ESPAÑA
k
2 188 658
A01H 5/00
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
12
kNúmero de solicitud europea: 95917556.3
kFecha de presentación: 20.04.1995
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 757 721
kFecha de publicación de la solicitud: 12.02.1997
T3
86
86
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54 Tı́tulo: Elemento regulador que confiere especificidad de tapetum.
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73 Titular/es:
k
72 Inventor/es: Huffman, Gary A.
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74 Agente: Dávila Baz, Angel
30 Prioridad: 21.04.1994 US 230929
PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL, INC.
700 Capital Square 400 Locust Street
Des Moines Iowa 50309, US
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
01.07.2003
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
ES 2 188 658 T3
01.07.2003
Aviso:
k
k
k
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 188 658 T3
DESCRIPCION
Elemento regulador que confiere especialidad de tapetum
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Antecedentes de la invención
1. Campo de la invención
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La presente invención se refiere a nuevos elementos reguladores que confieren especificidad de tapetum
a la expresión génica. En particular, esta invención está dirigida a un elemento regulador especı́fico de
tapetum del gen SGB6 del maı́z, y al uso de dicho elemento regulador para producir plantas transgénicas
con esterilidad masculina. Además, esta invención está dirigida a un método para devolver la fertilidad
masculina en la progenie de plantas con esterilidad masculina.
2. Antecedentes
El control de la fertilidad del polen es esencial en la producción de cultivos hı́bridos. En la producción
de maı́z hı́brido, el control de la fertilidad del polen tı́picamente se consigue eliminando fı́sicamente la
inflorescencia masculina, o panı́cula, antes de que se libere el polen. La eliminación manual de la panı́cula
necesita mucha mano de obra. Aunque la eliminación mecánica de la panı́cula necesita menos mano de
obra que la eliminación manual, la eliminación mecánica es menos fiable y necesita un examen posterior
del cultivo y, posiblemente, una eliminación manual de la panı́cula correctora. Los dos métodos para
eliminar la panı́cula producen una pérdida de rendimiento.
La fertilidad del polen también puede controlarse aplicando una composición quı́mica a la planta o
al suelo para prevenir la producción de polen en plantas hembra. Véase, por ejemplo, Ackmann et al.,
patente de Estados Unidos No. 4.801.326. De acuerdo con este método, se producen semillas hı́bridas
por medio de la fertilización cruzada de las plantas hembra tratadas con polen de plantas no tratadas.
Sin embargo, la estrategia quı́mica demanda mucha mano de obra y presenta problemas potenciales por
la toxicidad de los productos quı́micos introducidos en el medio ambiente.
Otra estrategia para controlar la fertilidad se basa en el uso de un(os) gen(es) citoplásmico(s) para
la esterilidad masculina. Véase, por ejemplo, Patterson, Patente de Estados Unidos No. 3.861.079. Sin
embargo, el problema que surge con esta estrategia es que la expresión de ciertos genes citoplásmicos de
esterilidad masculina va acompañada de una mayor susceptibilidad a hongos patógenos. Por ejemplo, el
uso general de un citotipo, cmsT, condujo a una plaga epifı́tica de la Roya de la Hoja del Maı́z del Sur a
principios de la década de los 70. Aunque se dispone de otros citotipos cms, su uso no se ha generalizado
debido a la preocupación por una posible susceptibilidad al patógeno de la Roya de la Hoja del Maı́z del
Sur, o a otros patógenos todavı́a desconocidos.
Por lo tanto, existe la necesidad de un método para controlar la producción de polen sin recurrir a los
genes de esterilidad masculina naturales o a los métodos manuales, mecánicos y quı́micos tradicionales.
Sumario de la invención
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Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar un método para producir plantas
de maı́z con esterilidad masculina usando un vector de expresión que altere la función de las células del
tapetum de las anteras.
Otro objeto de esta invención es proporcionar un elemento regulador del ADN que confiera expresión
génica especı́fica para el tapetum.
Estos y otros objetos se consiguen, de acuerdo con una realización de la presente invención, proporcionando una molécula de ADN aislada, donde la molécula de ADN comprende una secuencia de nucleótidos
seleccionada entre el grupo compuesto por (a) SEC ID NO: 1, (b) una secuencia de nucleótidos que tiene
una similitud de secuencia sustancial con la SEC ID NO: 1; y (c) fragmentos de (a) o (b), donde la
molécula de ADN es un elemento regulador especı́fico para el tapetum.
De acuerdo con otra realización de la presente invención, se ha proporcionado un vector de expresión
que comprende un elemento regulador especı́fico para el tapetum. Dicho vector de expresión puede incluir
un promotor que está bajo el control del elemento regulador especı́fico para el tapetum. Un ejemplo de
un tipo de promotor es una molécula de ADN que se selecciona entre el grupo compuesto por (a) SEC
ID NO: 2; (b) una secuencia de nucleótidos que tiene una similitud sustancial de secuencia con la SEC
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ID NO: 2; y (c) fragmentos de (a) o (b), donde la molécula de ADN es un promotor de un gen especı́fico
para la antera, que se expresa durante las etapas de desarrollo desde la meiosis hasta la fase de cuartete.
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De acuerdo con una realización adicional de la presente invención, se ha proporcionado un vector de
expresión que comprende un gen foráneo, donde la expresión del gen foráneo está bajo el control de un
elemento regulador especı́fico para el tapetum, y donde el producto del gen foráneo altera la función de
las células del tapetum.
De acuerdo con una realización adicional de la presente invención, se ha proporcionado un método
de uso de dicho vector de expresión para producir una planta con esterilidad masculina, que comprende
la etapa de introducir un vector de expresión en células vegetales embrionarias, donde el gen foráneo del
vector de expresión se selecciona entre el grupo formado por un gen estructural, un gen sin sentido, un
gen de ribozima y un gen de secuencia de guı́a externa.
De acuerdo con una realización adicional de la presente invención, se ha proporcionado un método de
uso de un elemento regulador especı́fico para el tapetum para producir una planta hı́brida con fertilidad
masculina, que comprende las etapas de:
(a) producir una primera planta progenitora con esterilidad masculina que comprende un vector de
expresión que comprende un elemento regulador especı́fico para el tapetum, un promotor y un
primer gen foráneo, donde el elemento regulador especı́fico para el tapetum junto con el promotor
controlan la expresión del primer gen foráneo, y donde el producto del primer gen foráneo altera la
función de la células del tapetum;
(b) producir una segunda planta progenitora que comprende un vector de expresión que comprende
un elemento regulador especı́fico para el tapetum, un promotor y un segundo gen foráneo, donde
el elemento regulador especı́fico para el tapetum junto con el promotor controlan la expresión del
segundo gen foráneo; y
(c) realizar una fertilización cruzada de la primera planta progenitora con la segunda planta progenitora
para producir una planta hı́brida,
donde las células del tapetum de la planta hı́brida expresan el segundo gen foráneo, y donde el producto del segundo gen foráneo previene la alteración de la función del tapetum mediante el producto del
primer gen foráneo, produciéndose de esta manera una planta hı́brida con fertilidad masculina.
Breve descripción de los dibujos
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La Figura 1 presenta estrategias usadas para subclonar y secuenciar la región cadena arriba del
clon SGB6 del tapetum de la antera del maı́z. Se subclonaron fragmentos de ADN de SGB6 en
R
R
KS+ o pBluescript
SK+ (Stratagene Cloning Systems; La Jolla, CA).
pBluescript
La Figura 2 presenta estudios sobre la inducción de la actividad luciferasa transitoria en tejido de
antera mediante una serie de deleciones 5’ en SGB6.
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La Figura 3 presenta estudios sobre la inducción de la actividad luciferasa transitoria en tejido de
antera mediante una serie de deleciones 5’ en SGB6.
La Figura 4 presenta estudios sobre la inducción de la actividad luciferasa transitoria en tejido de
antera mediante una serie de deleciones 3’ en SGB6 en la que se fusionaron fragmentos de ADN cadena
arriba de SGB6 con el promotor nuclear de SGB6.
La Figura 5 presenta estudios sobre la inducción de la actividad luciferasa transitoria en tejido de
antera mediante fragmentos de ADN de SGB6 cadena arriba que contenı́an deleciones internas.
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La Figura 6 presenta estudios sobre la inducción de la actividad luciferasa (LU) mediante un plásmido
de control o por plásmidos de ensayo que contenı́an el elemento regulador especı́fico para el tapetum de
94 pares de bases (“Caja de Especificidad de la Antera de SGB6”), o porciones del mismo. El plásmido
de control contenı́a un promotor 35S de CaMV, una región lı́der ’ no traducida del Virus del Mosaico
del Tabaco (TMV), el primer intrón del gen de la alcohol deshidrogenasa 1 (ADH1) de maı́z, y el gen de
la luciferasa. Todos los plásmidos contenı́an una región de procesamiento de transcrito 3’ procedente del
gen del Inhibidor de la Proteinasa de patata II (PinII) fusionado cadena abajo del gen de la luciferasa.
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La Figura 7 presenta estudios sobre la inducción de la actividad luciferasa en anteras, coleóptilos,
raı́ces y en una suspensión embrionaria de maı́z mediante un plásmido de control o mediante plásmidos
de ensayo.
5
La Figura 8 presenta estudios sobre la inducción de la actividad luciferasa en las anteras mediante el
elemento regulador especı́fico para el tapetum de 94 pares de bases (Caja de Especificidad de la Antera
de SGB6), mediante un promotor de un gen especı́fico para la antera que se expresa durante las etapas
de desarrollo desde la meiosis hasta la fase de cuartete (Promotor G9), o por una combinación de la Caja
de Especificidad de la Antera de SGB6 y un Promotor G9.
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La Figura 9 presenta la secuencia de nucleótidos del promotor G9 de 289 pares de bases [SEC ID NO:
2].
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
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1.Definiciones
En la descripción que se presenta a continuación, se usan comúnmente varios términos. Las siguientes
definiciones se proporcionan para facilitar la comprensión de la invención.
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Un gen estructural es una secuencia de ADN que se transcribe a ARN mensajero (ARNm), que después
se traduce a una secuencia de aminoácidos caracterı́stica de un polipéptido especı́fico.
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Un promotor es una secuencia de ADN que dirige la transcripción de un gen estructural. Tı́picamente,
un promotor se localiza en la región 5’ de un gen, próximo al sitio de inicio de la transcripción de un gen
estructural. Si un promotor es un promotor inducible, entonces la velocidad de transcripción aumenta
en respuesta a un agente inductor. Por el contrario, la velocidad de transcripción no se regula por un
agente inductor si el promotor es un promotor constitutivo.
Un promotor nuclear contiene secuencias de nucleótidos esenciales para la función del promotor, incluyendo la caja TATA y el inicio de la transcripción. Por esta definición, un promotor nuclear puede tener
una actividad detectable o no en ausencia de secuencias especı́ficas que pueden potenciar la actividad o
conferir una actividad especı́fica de tejido. Por ejemplo, el promotor nuclear de SGB6 está formado por
aproximadamente 37 nucleótidos en la dirección 5’ del sitio del inicio de la trascripción del gen SGB6,
mientras que el promotor nuclear 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV) está formado por
aproximadamente 33 nucleótidos en la dirección 5’ del sitio de inicio de la transcripción del genoma de
35S.
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Un elemento regulador especı́fico para el tapetum es una secuencia de ADN que dirige un nivel mayor
de transcripción de un gen asociado en el tejido del tapetum en las anteras que en algunos o todos los
demás tejidos de una planta. Por ejemplo, el gen SGB6, descrito en este documento, se expresa en células
del tapetum. El elemento regulador especı́fico para el tapetum del gen SGB6 puede dirigir la expresión
de un gen foráneo en el tejido de las anteras, pero no en el tejido radicular o en el tejido de coleóptilo.
De esta manera, el elemento regulador especı́fico para el tapetum de 94 pares de bases del gen SGB6 se
denomina “Caja de Especificidad para la Antera de SGB6”.
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Un operador es una molécula de ADN que se localiza en la dirección 5’ de un gen estructural y que
contiene una secuencia de nucleótidos que es reconocida y se une a una proteı́na represora. La unión de
una proteı́na represora con su operador afı́n ocasiona la inhibición de la transcripción del gen estructural.
Por ejemplo, el gen LexA codifica una proteı́na represora que se une al operador de LexA.
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Una molécula de ADN aislada es un fragmento de ADN que no está integrado en el ADN genómico
de un organismo. Por ejemplo, el elemento regulador especı́fico para el tapetum es un fragmento de ADN
que se ha separado del ADN genómico de una planta de maı́z endogámica. Otro ejemplo de una molécula
de ADN aislada es una molécula de ADN sintetizada quı́micamente que no está integrada en el ADN
genómico de un organismo.
Un potenciador es un elemento regulador del ADN que puede aumentar la eficacia de la transcripción,
independientemente de la distancia o la orientación del potenciador con respecto al sitio de inicio de la
transcripción.
ADN complementario (ADNc) es una molécula de ADN de una sola cadena que se forma a partir de
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un molde de ARNm por la enzima transcriptasa inversa. Tı́picamente, se emplea un cebador complementario a porciones de ARNm para el inicio de la transcripción inversa. Los especialistas en la técnica
pueden usar también el término “ADNc” para referirse a una molécula de ADN bicatenaria formada por
tal molécula de ADN monocatenaria y su cadena de ADN complementaria.
5
El término expresión se refiere a la biosı́ntesis de un producto génico. Por ejemplo, en el caso de un
gen estructural, la expresión implica la transcripción del gen estructural a ARNm y la traducción del
ARNm en uno o más polipéptidos.
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Un vector de clonación es una molécula de ADN, tal como un plásmido, cósmido, o bacteriófago,
que tiene la capacidad de replicarse de forma autónoma en una célula hospedadora. Los vectores de
clonación tı́picamente contienen uno o un pequeño número de sitios de reconocimiento de endonucleasas
de restricción en los que pueden insertarse secuencias de ADN foráneo de una manera determinable sin
perder una función biológica esencial del vector, ası́ como un gen marcador que es adecuado para uso en
la identificación y selección de las células transformadas con el vector de clonación. Los genes marcadores
tı́picamente incluyen genes que proporcionan resistencia a tetraciclina o a ampicilina.
Un vector de expresión es una molécula de ADN que comprende un gen que se expresa en una
célula hospedadora. Tı́picamente, la expresión del gen está controlada por ciertos elementos reguladores,
incluyendo promotores constitutivos o inducibles, elementos reguladores especı́ficos para el tejido, y potenciadores. Se dice que dicho gen está “unido operativamente” a los elementos reguladores.
En la presente descripción, un gen foráneo se refiere a una secuencia de ADN que está unida operativamente al menos a un elemento regulador heterólogo. Por ejemplo, cualquier otro gen que no sea el gen
estructural SGB6 se considera un gen foráneo si la expresión de ese gen está controlada por un elemento
regulador especı́fico para el tapetum del gen SGB6.
Un hospedador recombinante puede ser cualquier célula procariota o eucariota que contiene un vector
de clonación o un vector de expresión. Esta expresión incluye también las células procariotas o eucariotas
que se han sometido a ingenierı́a genética para contener el (los) gen(es) clonado(s) en el cromosoma o
genoma de la célula hospedadora.
Una planta transgénica es una planta que tiene una o más células vegetales que contienen un vector
de expresión.
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En los eucariotas, la ARN polimerasa II cataliza la transcripción de un gen estructural para producir
ARNm. Una molécula de ADN puede diseñarse para contener un molde de ARN polimerasa II en el que
el ARN transcrito tenga una secuencia complementaria a la del ARNm especı́fico. El transcrito de ARN
se denomina ARN sin sentido y una secuencia de ADN que codifica el ARN sin sentido se denomina gen
sin sentido. Las moléculas de ARN sin sentido son capaces de unirse a moléculas de ARNm, dando como
resultado una inhibición de la traducción de ARNm.
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Una ribozima es una molécula de ARN que contiene un centro catalı́tico. El término incluye enzimas
de ARN, ARN autorreparadores, y ARN autoescindibles. Una secuencia de ADN que codifica una ribozima se denomina gen de ribozima.
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Una secuencia de guı́a externa es una molécula de ARN que dirige la ribozima endógena, RNasa P,
a una especie particular de ARNm intracelular, ocasionando la escisión del ARNm por la RNasa P. Una
secuencia de ADN que codifica una secuencia de guı́a externa se denomina gen de secuencia de guı́a
externa.
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Se considera que dos moléculas de ácido nucleico tienen una similitud de secuencia sustancial si sus
secuencias de nucleótidos comparten una similitud de al menos un 50 %. Las similitudes de las secuencias
pueden determinarse, por ejemplo, usando el programa FASTA (Genetics Computer Group; Madison,
WI). De forma alternativa, las similitudes de las secuencias pueden determinarse usando BLASTP (Basic
Local Alignment Search Tool) del Experimental GENIFO(R) BLAST Network Service. Véase Altschul
et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990). Véase también Pasternark et al., “Sequence Similarity Searches,
Multiple Sequence Alignments, and Molecular Tree Building,” en METHODS IN PLANT MOLECULAR
BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick et al. (eds.), páginas 251-267 (CRC Press, 1993).
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2. Aislamiento de un Elemento Regulador de un Gen Especı́fico para el Tapetum
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El uso de la ingenierı́a genética para realizar una alteración en la expresión fenotı́pica de una planta
de una forma especı́fica para un tejido es bien conocido en la técnica. Una estrategia para controlar la
producción de polen es manipular la expresión de genes en el tapetum. El tapetum es una capa de células
que rodea a las células microsporógenas en las anteras y proporciona nutrientes, tales como azúcares
reductores, aminoácidos y lı́pidos a las microsporas en desarrollo. Reznickova, C.R. Acad. Bulg., Sci.
31:1067 (1978); Nave et al., J. Plant Physiol. 125:451 (1986); Sawhney et al., J. Plant Physiol. 125:467
(1986). Las células del tapetum producen también β(1,3)-glucanasa (“calasa”) que promueve la liberación
de microsporas. Mepham et al., Protoplasma 70:1 (1970). Por lo tanto, existe una delicada relación entre
el tapetum y las células microsporógenas, y es probable que cualquier alteración en la función del tapetum
dé como resultado granos de polen disfuncionales. De hecho, se sabe que las lesiones en la biogénesis
de tapetum producen mutantes con esterilidad masculina. Kaul, “Male Sterility in Higher Plants,” en
MONOGRAPHS ON THEORETICAL AND APPLIED GENETICS, Vol. 10, Frankel et al. (eds.),
páginas 15-95 (Springer Verlag, 1988). De esta manera, puede inducirse un fallo en la transformación de
las microsporas en granos de polen maduros usando una molécula de ADN recombinante que comprenda
un gen capaz de alterar la función del tapetum bajo el control de secuencias reguladoras especı́ficas para
el tapetum.
En la técnica se conocen promotores y genes especı́ficos para las anteras. Véase, por ejemplo, McCormick et al., “Anther-Specific Genes: Molecular Characterization and Promoter Analysis in Transgenic
Plants,” en PLANT REPRODUCTION: FROM FLORAL INDUCTION TO POLLINATION, Lord et
al. (eds.), páginas 128-135 (1989); Scott et al., Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO
92/11379 (1992); van der Meer et al., The Plant Cell 4:253 (1992). Sin embargo, no existen principios
generalmente aceptados ni criterios estructurales para reconocer las secuencias de ADN que confieren especificidad para las anteras, especialmente especificidad para el tapetum, a la expresión génica en el maı́z.
Por consiguiente, no es posible aislar un elemento regulador especı́fico para el tapetum directamente de
una biblioteca genómica de maı́z seleccionando una secuencia consenso que confiera una expresión génica
especı́fica para el tapetum.
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El nuevo elemento regulador especı́fico para el tapetum de la presente invención se descubrió cadena
arriba de las secuencias de ADN que codifican el gen SGB6 de maı́z, como se describe más adelante. El
elemento regulador se obtuvo aislando moléculas de ADNc que codifican genes especı́ficos para el tapetum
y después usando los ADNc como sondas para identificar los genes correspondientes en una biblioteca
genómica adecuada.
A. Aislamiento de Moléculas de ADNc que Codifican Genes Especı́ficos para el Tapetum.
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La primera etapa en la construcción de una biblioteca de ADNc que contiene genes especı́ficos para
tapetum es aislar el ARN total a partir del tejido de las anteras. Preferiblemente, la fuente de tejido
de las anteras son panı́culas de dos a seis pulgadas (aproximadamente de cinco a quince centı́metros) de
longitud que contienen tejido de tapetum en diversas etapas de desarrollo, incluyendo las etapas en las
que el tapetum juega un papel crı́tico en la liberación de microsporas. Más preferiblemente, la fuente
de tejido de las anteras son panı́culas de dos a seis pulgadas de longitud de la lı́nea de maı́z endogámica
B73.
El ARN total puede prepararse a partir de las panı́culas usando técnicas bien conocidas para los especialistas en la técnica. En general, las técnicas de aislamiento de ARN deben proporcionar un método
para lisar células vegetales, un medio para inhibir la degradación dirigida por la RNasa de ARN, y un
método para separar el ARN de los contaminantes de ADN, proteı́nas, y polisacáridos. Por ejemplo, el
ARN total puede aislarse a partir de panı́culas congelando el tejido vegetal en nitrógeno lı́quido, moliendo
el tejido congelado con un mortero y su mano para lisar las células, extrayendo el tejido molido con una
solución de fenol/cloroformo para retirar las proteı́nas, y separando el ARN de las impurezas que quedan
por precipitación selectiva con cloruro de litio. Véase, por ejemplo, Ausubel et al., (eds.), CURRENT
PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, en las páginas 4.3.1-4.3.4 (1990). Véase también Sharrock
et al., Genes and Development 3:1745 (1989).
De forma alternativa, el ARN total puede aislarse de las panı́culas extrayendo el tejido molido con isotiocianato de guanidinio, extrayendo con disolventes orgánicos, y separando el ARN de los contaminantes
usando centrifugación diferencial. Véase, por ejemplo, Strommer et al., “Isolation and characterization of
Plant mRNA,” en METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick
et al. (eds.), páginas 49-65 (CRC Press, 1993).
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Para construir una biblioteca de ADNc, debe aislarse poli(A) + ARN a partir de una preparación de
ARN total. El poli(A) + ARN puede aislarse a partir del ARN total usando la técnica convencional de
cromatografı́a en oligo (dT)-celulosa. Véase, por ejemplo, Strommer et al., supra.
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Las moléculas de ADNc bicatenarias se sintetizan a partir de poli(A) + ARN usando técnicas bien
conocidas para los especialistas en la técnica. Véase, por ejemplo, Ausubel et al., supra, en las páginas
5.5.2-5.6.8. Además, pueden usarse kits disponibles en el mercado para sintetizar moléculas de ADNc
bicatenarias. Por ejemplo, dichos kits están disponibles en GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD), Clontech
Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Promega Corporation (Madison, WI) y Stratagene Cloning Systems
(La Jolla, CA).
Existen diversos vectores de clonación adecuados para la construcción de una biblioteca de ADNc
de panı́culas. Por ejemplo puede prepararse una biblioteca de ADNc en un vector derivado de un bacteriófago, tal como un vector gt10. Huynh et al., “ Constructing and Screening cDNA Libraries in gt10
and gt11” en DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I, Glover (ed.), páginas 49-78 (IRL Press, 1985).
De forma alternativa, pueden insertarse moléculas de ADNc bicatenarias en un vector plasmı́dico, tal
R
(Stratagene Cloning Systems; La Jolla, CA), o en otros vectores disponibles
como un vector pBluescript
en el mercado. También pueden obtenerse vectores de clonación adecuados en la American Type Culture
Collection (Rockville, MD).
Para amplificar las moléculas de ADNc clonadas, la biblioteca de ADNc se inserta en un hospedador
procariota, usando técnicas convencionales. Por ejemplo, la biblioteca de ADNc de panı́cula puede introducirse en células E. coli DH5 competentes, que pueden obtenerse en GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD).
Puede usarse una detección diferencial para aislar clones de ADNc que codifican genes especı́ficos para
las anteras a partir de la biblioteca de ADNc. Por ejemplo, pueden sintetizarse sondas de ADNc monocatenarias en presencia de nucleótidos radiactivos usando poli(A)+ARN aislado a partir de panı́culas o de
plántulas. Se aı́slan para análisis posteriores los clones de ADNc que hibridan con la sonda de ADNc de
panı́cula, pero no con la sonda de ADNc de plántula. La técnica de detección diferencial es bien conocida
para los especialistas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sargent, “Isolation of Differentially Expressed
Genes” en GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, Berger et al. (eds.), páginas 423-432
(Academic Press, 1987); Tedder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:208 (1988).
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La estrategia básica para obtener clones de ADNc especı́ficos para tapetum puede modificarse construyendo una biblioteca de ADNc reducida enriquecida en clones de ADNc especı́ficos para las anteras.
Hedrick et al., Nature 308:149 (1984). Por ejemplo, puede prepararse un ADNc bicatenario con extremos
EcoRI a partir de ARN de panı́cula y mezclarse con un exceso de 50 veces de fragmentos de ADNc pequeños de extremos romos preparados a partir de ARN de plántulas. La mezcla de los ADNc se calienta
para fundir el ADNc bicatenario, se deja que hibriden los ADNc monocatenarios, y se insertan moléculas
de ADNc bicatenarias en el sitio EcoRI de un vector de clonación. En estas condiciones, las únicas
moléculas de ADNc que tienen probabilidad de regenerar fragmentos bicatenarios con un sitio EcoRI en
cada extremo son los ADNc que no tienen fragmentos complementarios en el ADNc de plántula. Ausubel
et al., supra, en las páginas 5.8.9-5.8.15.
Los clones de ADNc pueden analizarse usando una diversidad de técnicas tales como análisis de restricción, análisis de Northern, e hibridación in situ.
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B. Aislamiento de Genes Especı́ficos para Tapetum a Partir de una Biblioteca Genómica
La metodologı́a descrita anteriormente puede usarse para aislar clones de ADNc que codifican
proteı́nas que se expresan en el tejido de las anteras, pero no en el tejido de las plántulas. Los clones de ADNc se usan como sondas para aislar los genes correspondientes de una biblioteca genómica.
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Una biblioteca de ADN genómico puede prepararse por medios bien conocidos en la técnica. Véase,
por ejemplo, Slightom et al., “Construction of Clone Banks,” en METHODS IN PLANT MOLECULAR
BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick et al. (eds.), páginas 121-146 (CRC Press, 1993). Una
fuente preferida de ADN genómico de plantas es el ADN de maı́z. El ADN genómico puede aislarse a
partir de tejido de maı́z, por ejemplo, lisando tejido vegetal con el detergente Sarkosyl, digiriendo el lisado
con proteinasa K, eliminando los desechos insolubles del lisado por centrifugación, precipitando los ácidos
nucleicos del lisado usando isopropanol, y purificando el ADN resuspendido en un gradiente de densidad
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de cloruro de cesio. Ausubel et al., supra, páginas 2.3.1-2.3.3.
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Es posible obtener fragmentos de ADN adecuados para la producción de una biblioteca genómica por
el fraccionamiento aleatorio del ADN o por la digestión parcial de ADN genómico con endonucleasas de
restricción. Véase, por ejemplo, Ausubel et al., supra, en las páginas 5.3.2-5.4.4, y Slightom et al., supra.
Los fragmentos de ADN genómico pueden insertarse en un vector, como un vector de bacteriófago o
cósmido, de acuerdo con técnicas convencionales tales como el uso de la digestión con enzimas de restricción para proporcionar extremos adecuados, el uso de tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar el
acoplamiento indeseable de moléculas de ADN, y la unión con ligasas adecuadas. Se describen técnicas
para dicha manipulación en Slightom et al.,supra, y son bien conocidas en la técnica. Véase también
Ausubel et al., supra, en las páginas 3.0.5-3.17.5.
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De forma alternativa, una biblioteca genómica de maı́z puede obtenerse en el mercado. Preferiblemente, dicha biblioteca es una biblioteca genómica EMBL3 obtenida por la digestión parcial por Sau3A
de ADN genómico aislado de la lı́nea de maı́z endogámica W22 (Clontech Laboratories, Inc.; Palo Alto,
CA).
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Una biblioteca que contiene clones genómicos se selecciona con uno o más clones de ADNc especı́ficos
para anteras usando técnicas convencionales. Véase, por ejemplo, Ausubel et al., supra, páginas 6.0.36.6.1; Slightom et al., supra; Raleigh et al., Genetics 122:279 (1989).
C. Identificación de un Elemento Regulador Especı́fico para el Tapetum
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Es posible analizar clones genómicos usando una diversidad de técnicas tales como análisis de restricción, análisis de Southern, análisis de extensión de cebadores, y análisis de la secuencia de ADN. Por
ejemplo, puede usarse el análisis de extensión de cebadores o el análisis de protección de nucleasa S1 para
localizar el supuesto sitio de inicio de la transcripción del gen clonado. Ausubel et al., supra, páginas
4.8.1-4.8.5; Walmsley et al., “Quantitative and Qualitative Analysis of Exogenous Gene Expression by the
S1 Nuclease Protection Assay,” en METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 7: GENE TRANSFER AND EXPRESSION PROTOCOLS, Murray (ed.), páginas 271-281 (Humana Press Inc. 1991).
Sin embargo, el análisis estructural per se no puede llevar a la identificación de un elemento regulador
especı́fico para el tapetum asociado con el gen clonado debido a que no se ha desarrollado un modelo
para las secuencias reguladoras especı́ficas para el tapetum del maı́z. De este modo, el elemento regulador
debe identificarse usando un análisis funcional.
La estrategia general de dicho análisis funcional implica la subclonación de fragmentos del clon
genómico en un vector de expresión que contiene un gen indicador, la introducción del vector de expresión en diversos tejidos de maı́z, y el ensayo del tejido para detectar la expresión transitoria del gen
indicador. La presencia de un elemento regulador especı́fico para el tapetum en el subclon genómico se
verifica observando la expresión del gen indicador en el tejido de las anteras y la ausencia de la expresión
del gen indicador en otros tejidos.
Los métodos para generar fragmentos de un clon genómico son bien conocidos. Preferiblemente, se
usa digestión enzimática para formar deleciones progresivas de fragmentos de ADN genómico. Véase,
por ejemplo, Ausubel et al., supra, en las páginas 7.2.1-7.2.20; An et al., “Techniques for Isolating and
Characterizing Transcription Promoters, Enhancers, and Terminators,” en METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick et al. (eds.), páginas 155-166 (CRC Press,
1993).
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Como ejemplo, la posibilidad de que el elemento regulador resida “cadena arriba”, o en la dirección 5’
del sitio de inicio de la transcripción puede ensayarse subclonando un fragmento de ADN que contenga la
región cadena arriba, digiriendo el fragmento de ADN en la dirección 5’ a 3’ o en la dirección 3’ a 5’ para
producir deleciones progresivas, y subclonando los fragmentos pequeños en vectores de expresión para la
expresión transitoria. Esta estrategia general se ilustra en el Ejemplo 1, presentado más adelante.
La selección de un vector de expresión apropiado dependerá del método de introducción del vector
de expresión en células hospedadoras. Tı́picamente, un vector de expresión contiene: (1) elementos de
ADN procariota que codifican para un origen de replicación bacteriano y un marcador de resistencia a
antibióticos para proporcionar el crecimiento y selección del vector de expresión en el hospedador bacteriano; (2) elementos de ADN eucariota que controlan el inicio de la transcripción, tal como un promotor;
(3) elementos de ADN que controlan el procesamiento de los transcriptos, tal como una secuencia de
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terminación de la transcripción/poliadenilación; y (4) un gen indicador que está unido operativamente a
los elementos de ADN que controlan el inicio de la transcripción. Los genes indicadores útiles incluyen
β-glucuronidasa, β-galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa, luciferasa, y similares. Preferiblemente,
el gen indicador es el gen de la β-glucuronidasa (GUS) o el gen de la luciferasa. Pueden encontrarse descripciones generales de vectores de expresión y genes indicadores en plantas en Gruber et al., “Vectors
for Plant Transformation”, en METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick et al. (eds.), páginas 89-119 (CRC Press, 1993). Además, los vectores de expresión de
GUS y los cassettes génicos de GUS están disponibles en Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA),
mientras que los vectores de expresión de luciferasa y los cassettes génicos de luciferasa están disponibles
en Promega Corporation (Madison, WI).
Los vectores de expresión que contienen fragmentos genómicos de ensayo pueden introducirse en protoplastos, en tejidos intactos o en células aisladas. Preferiblemente, los vectores de expresión se introducen
en tejidos intactos. Se proporcionan métodos generales para cultivar tejidos vegetales, por ejemplo, por
Miki et al., “Procedures for Introducing Foreign DNA into plants”, en METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick et al. (eds.), páginas 67-88 (CRC Press, 1993), y
por Phillips et al., “Cell/Tissue Culture and In Vitro Manipulation”, en CORN AND CORN IMPROVEMENT, 3a¯ Edición, Sprague et al. (eds.), páginas 345-387 (American Society of Agronomy, Inc. et
al. 1988). En los Ejemplos 1 y 2 se ilustran métodos para cultivar tejidos vegetales.
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Los métodos para introducir vectores de expresión en tejidos vegetales incluyen la infección directa o
el co-cultivo de tejidos vegetales con Agrobacterium tumefaciens. Horsch et al., Science 227:1229 (1985).
Gruber et al., supra, y Miki et al., supra proporcionan descripciones de sistemas vectores de Agrobacterium y métodos para la transferencia génica mediada por Agrobacterium.
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Preferiblemente, los vectores de expresión se introducen en tejidos de maı́z usando un método de
transferencia génica directo tal como la administración mediada por microproyectiles, inyección de ADN,
electroporación, y similares. Véase, por ejemplo, Gruber et al., supra; Miki et al., supra; Klein et al.,
Biotechnology 10:268 (1992). Más preferiblemente, los vectores de expresión se introducen en tejidos de
maı́z usando la administración mediada por microproyectiles con un dispositivo biolı́stico. Este método
de administración se ilustra en los Ejemplos 1 a 3 presentados más adelante.
Los métodos descritos anteriormente se han usado para identificar secuencias de ADN que regulan la
expresión génica de una forma especı́fica para el tapetum. En particular, se descubrió que un elemento
regulador especı́fico para el tapetum residı́a dentro de un fragmento de ADN de 94 pares de bases que
está definido por los nucleótidos 583 a 490 cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción de SGB6.
La secuencia de nucleótidos del elemento regulador especı́fico para el tapetum de 94 pares de bases es:
(-583) ACAGTTCACT AGATATGCAT GATCTTTAAC AATTGCTGCT
TGTCAAGTGA TCTATACGTA CTAGAAATTG TTAACGACGA
GGATTGTGCG GTTTCTTTTG GCACAAATGG CATGAACAGA
CCTAACACGC CAAAGAAAAC CGTGTTTACC GTACTTGTCT
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GTAATCCGGG ACGC (-490) [ SEC ID NO: 1].
CATTAGGCCC TGCG
De esta manera, la presente invención incluye una molécula de ADN que tiene una secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 1 y que tiene la función de un elemento regulador especı́fico para el tapetum.
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Pueden producirse variantes del elemento regulador especı́fico para el tapetum de 94 pares de bases
delecionando, añadiendo y/o sustituyendo los nucleótidos indicados en la SEC ID NO: 1 por otros nucleótidos. Dichas variantes pueden obtenerse, por ejemplo, por mutagénesis dirigida por oligonucleótidos,
mutagénesis de exploración de engarces, mutagénesis usando la reacción en cadena de la polimerasa, y
similares. Ausubel et al., supra, en las páginas 8.0.3-8.5.9. Véase también, en general, McPherson (ed.),
DIRECTED MUTAGENESIS: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1991). De esta manera, la presente edición también engloba moléculas de ADN que comprenden secuencias de nucleótidos que tienen
una similitud de secuencia sustancial con la SEC ID NO: 1 y que funcionan como un promotor especı́fico
para el tapetum.
Además, pueden realizarse análisis de deleción adicionales para localizar uno o más elementos adicionales reguladores especı́ficos para el tapetum dentro del elemento regulador especı́fico para el tapetum
de 94 pares de bases. De esta manera, la presente invención engloba también fragmentos de la molécula
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de ADN que tienen la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 1, siempre que los fragmentos de ADN
funcionen como un elemento regulador especı́fico para el tapetum.
3. Uso de un Elemento Regulador Especı́fico para el Tapetum para Controlar la Producción de Polen.
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A. Producción de Plantas con Esterilidad Masculina
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Un objeto de la presente invención es proporcionar un medio para controlar la producción de polen
usando un elemento regulador especı́fico para el tapetum. De forma importante, el elemento regulador
especı́fico para el tapetum SGB6 puede inducir la expresión de un gen heterólogo en las células del tapetum de las anteras desde la etapa de cuartete hasta la mitad de la etapa uninucleada de desarrollo.
El significado práctico de dicha temporización es que la expresión de un gen que induce la esterilidad
durante esta etapa de desarrollo alterará la maduración de la antera suficientemente pronto como para
permitir la verificación visual de la función del sistema inductor de la esterilidad en el campo. De esta
manera, los efectos del gen que induce la esterilidad serı́an evidentes en el campo de producción en una
etapa de desarrollo suficientemente temprana como para permitir la eliminación manual o mecánica de
la panı́cula de cualquier planta fértil que resulte de un fallo parcial o total del sistema de inducción de la
esterilidad.
Una estrategia general para inducir la esterilidad masculina es construir un vector de expresión en
el que el elemento regulador especı́fico para el tapetum esté unido operativamente a una secuencia de
nucleótidos que codifica una proteı́na capaz de alterar la función de las células del tapetum. Las proteı́nas
capaces de alterar la función del tapetum incluyen proteı́nas que inhiben la sı́ntesis de macromoléculas
que son esenciales para la función celular, enzimas que degradan macromoléculas que son esenciales para
la función celular, proteı́nas que alteran la biosı́ntesis o el metabolismo de hormonas vegetales, y proteı́nas
que inhiben una función especı́fica de las células del tapetum.
Por ejemplo, puede construirse un vector de expresión en el que el elemento regulador especı́fico para el
tapetum esté unido operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica un inhibidor de la sı́ntesis
de proteı́nas. La toxina diftérica, por ejemplo, es un inhibidor bien conocido de la sı́ntesis de proteı́nas
en eucariotas. Las moléculas de ADN que codifican el gen de la toxina diftérica pueden obtenerse en la
American Type Culture Collection (Rockville, MD), ATCC No. 39359 o ATCC No. 67011.
De forma alternativa, puede conseguirse la alteración de la función del tapetum usando secuencias
de ADN que codifican enzimas capaces de degradar una macromolécula biológicamente importante. Por
ejemplo, Mariani et al., Nature347 :737 (1990), han demostrado que la expresión en el tapetum de la
RNasa-T1 de Aspergillus oryzae o una RNasa de Bacillus amyloliquefaciens, denominada “barnasa” inducı́a la destrucción de las células del tapetum, produciendo infertilidad masculina. Quaas et al., Eur.
J. Biochem. 173:617 (1988), describen la sı́ntesis quı́mica de la RNasa-T1, mientras que la secuencia de
nucleótidos del gen de barnasa se describe en Hartley, J. Molec. Biol. 202:913 (1988).
Los genes de la RNasa-T1 y de la barnasa pueden obtenerse, por ejemplo, sintetizando los genes
con oligonucleótidos largos que se ceban mutuamente. Véase, por ejemplo, Ausubel et al., supra, en las
páginas 8.2.8 a 8.2.13. Véase también Wosnick et al., Gene 60:115 (1987). Además, las técnicas actuales
que usan la reacción en cadena de la polimerasa proporcionan la capacidad de sintetizar genes de hasta
1,8 kilobases de longitud. Adang et al., Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993); Bambot et al., PCR Methods
and Applications 2:266 (1993).
En una estrategia alternativa, la producción de polen se inhibe alterando el metabolismo de hormonas
vegetales tales como las auxinas. Por ejemplo, el gen rolB del Agrobacterium rhizogenes codifica una enzima que interfiere con el metabolismo de las auxinas catalizando la liberación de indoles libres a partir de
indoxil-β-glucósidos. Estruch et al., EMBO J. 11:3125 (1991). Spena et al., Theor. Appl. Genet. 84:520
(1992), han demostrado que la expresión especı́fica en las anteras del gen rolB en el tabaco daba como
resultado plantas con anteras arrugadas en las que la producción de polen se habı́a reducido severamente.
Por lo tanto, el gen rolB es un ejemplo de un gen que es útil para el control de la producción de polen.
Slightom et al., J. Biol. Chem. 261:108 (1985), describen la secuencia de nucleótidos del gen rolB.
También puede conseguirse el control de la producción de polen inhibiendo una función especı́fica
de las células del tapetum. Por ejemplo, las células del tapetum producen β(1,3)-glucanasa, o calasa,
que promueve la liberación de microsporas. Mephan et al., Protoplasma 70:1 (1970). Una aparición
prematura o tardı́a de la calasa durante el desarrollo del tapetum se asocia a ciertos tipos de esterilidad
masculina. Warmke et al., J. Hered. 63:103 (1972). Por lo tanto, el gen de calasa puede usarse para alte10
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rar la función de las células del tapetum. Scott et al., Publicación de Solicitud de Patente Internacional
No. WO 93/02197 (1993), describen la secuencia de nucleótidos de una calasa especı́fica para el tapetum.
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Para expresar una proteı́na que altera la función del tapetum, se construye un vector de expresión en
el que una secuencia de ADN que codifica la proteı́na está unida operativamente a secuencias de ADN
que regulan la transcripción génica de una forma especı́fica para el tapetum. Los requisitos generales de
un vector de expresión se han descrito anteriormente en el contexto de un sistema de expresión transitoria. Aquı́, sin embargo, el objetivo es introducir el vector de expresión en el tejido embrionario de la
planta de tal forma que una proteı́na foránea se exprese en una fase posterior del desarrollo en el tapetum
de la planta adulta. La estabilidad mitótica puede conseguirse usando vectores virales de plantas que
proporcionen replicación epicromosómica.
Un método alternativo y preferido para obtener estabilidad mitótica se proporciona por la integración
de secuencias del vector de expresión en el cromosoma del hospedador. Dicha estabilidad mitótica puede
proporcionarse mediante la administración por microproyectiles de un vector de expresión al tejido embrionario como se ilustra en el Ejemplo 3, presentado más adelante.
La transcripción del gen foráneo puede controlarse por un promotor de un gen especı́fico para el
tapetum o por un promotor viral, tal como un promotor del Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV),
un promotor del Virus del Mosaico de Figwort, y similares. Gruber et al., supra. Preferiblemente, el
promotor es un promotor de un gen especı́fico para el tapetum o el promotor nuclear 35S de CaMV. Más
preferiblemente, el promotor es un promotor de un gen especı́fico para el tapetum y, en particular, el
promotor nuclear de SGB6, como se describe más adelante.
De forma alternativa, la transcripción del gen foráneo puede controlarse por un promotor de un gen
especı́fico para la antera, que se expresa durante las etapas desde la meiosis hasta la fase de cuartete
del desarrollo. De este modo, la expresión del gen foráneo durante la meiosis hasta la mitad de la etapa
uninucleada puede lograrse usando un elemento regulador especı́fico para el tapetum junto con dicho
promotor, como se ilustra en el Ejemplo 4. Preferiblemente, el promotor G9 de 289 pares de bases se usa
para extender el lapso de desarrollo de la expresión heteróloga, como se describe más adelante.
Para seleccionar células transformadas, el vector de expresión contiene un gen marcador selectivo, tal
como un gen de resistencia a herbicidas. Por ejemplo, dichos genes pueden conferir resistencia a fosfinotricina, glifosato, sulfonilureas, atrazina, o imidazolinona. Preferiblemente, el gen marcador selectivo es
el gen de resistencia a fosfinotricina. Aunque el vector de expresión puede contener secuencias de ADNc
que codifican una proteı́na foránea bajo el control de un elemento regulador especı́fico para el tapetum,
ası́ como el gen marcador selectivo bajo el control de un promotor constitutivo, el gen marcador selectivo
se administra preferiblemente a las células hospedadoras en un vector de expresión de selección distinto.
En el Ejemplo 3, presentado más adelante, se ilustra dicha “co-transformación” de tejido embrionario
con un vector de expresión de ensayo que contiene un elemento regulador especı́fico para el tapetum y
un vector de expresión de selección.
En una estrategia alternativa, puede inducirse la esterilidad masculina usando un vector de expresión
en el que el elemento regulador especı́fico para el tapetum esté unido operativamente a una secuencia de
nucleótidos que codifica un ARN sin sentido. La unión de moléculas de ARN sin sentido a las moléculas
de ARNm diana ocasiona la interrupción de la hibridación de la traducción. Paterson, et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 74:4370 (1987). De esta manera, una molécula de ARN sin sentido tendrı́a una secuencia que es complementaria a la de una especie de ARNm que codifica una proteı́na que es necesaria para
la función de las células del tapetum.
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Por ejemplo, la producción de ARN sin sentido de calasa inhibirı́a la producción de la enzima calasa
que es esencial para la liberación de microsporas. Además, puede inducirse esterilidad masculina por
medio de la inhibición de la biosı́ntesis de flavonoides usando un vector de expresión que produce ARN
sin sentido para la región 3’ no traducida del gen de la chalcona sintasa A. van der Meer et al., The Plant
Cell 4:253 (1992). La clonación y caracterización del gen de la chalcona sintasa A se describe por Koes
et al., Gene 81:245 (1989), y en Koes et al., Plant Molec. Biol. 12:213 (1989).
De forma alternativa, puede construirse un vector de expresión en el que el elemento regulador especı́fico para el tapetum esté unido operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica un ribozima. Las ribozimas pueden estar diseñadas para expresar una actividad endonucleasa que está dirigida
a una cierta secuencia diana en una molécula de ARNm. Por ejemplo, Steinecke et al., EMBO J. 11:1525
(1992), consiguió hasta un 100 % de inhibición de la expresión del gen de neomicina fosfotransferasa
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en protoplastos de tabaco mediante ribozimas. Más recientemente, Perriman et al., Antisense Reseach
and Development 3:253 (1993), inhibieron la actividad cloranfenicol acetil transferasa en protoplastos de
tabaco usando un vector que expresaba una ribozima de cabeza de martillo modificada. En el contexto
de la presente invención, las moléculas de ARN diana adecuadas para las ribozimas incluyen especies de
ARNm que codifican proteı́nas esenciales para la función del tapetum, tales como ARNm de calasa.
En otra estrategia alternativa, pueden construirse vectores de expresión en los que un elemento regulador especı́fico para el tapetum dirige la producción de transcritos de ARN capaces de promover la
escisión mediada por RNasa P de las moléculas de ARNm diana. De acuerdo con esta estrategia, puede
construirse una secuencia de guı́a externa para dirigir la ribozima endógena, RNasa P, a una especie
particular de ARNm intracelular, que posteriormente se escinde por la ribozima celular. Altman et al.,
Patente de Estados Unidos No. 5.168.053. Yuan et al., Science 263: 1269 (1994). Preferiblemente, la
secuencia de guı́a externa comprende una secuencia de diez a quince nucleótidos complementaria a una
especie de ARNm que codifica una proteı́na esencial para la función del tapetum, y una secuencia de
nucleótidos 3’-NCCA, en la que N es preferiblemente una purina. Id. Los transcritos de la secuencia de
guı́a externa se unen a la especie de ARNm diana por medio de la formación de pares de bases entre
el ARNm y las secuencias de guı́a externa complementarias, promoviendo de esta manera la escisión de
ARNm por la RNasa P en el nucleótido localizado en el lado 5’ de la región de pares de bases. Id.
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De forma alternativa, los genes sin sentido, los genes de ribozima y los genes de la secuencia de guı́a
externa pueden regularse combinando un elemento regulador especı́fico para el tapetum y un promotor
de un gen especı́fico para la antera, que se expresa durante las etapas desde la meiosis hasta la fase de
cuartete del desarrollo. Preferiblemente, el promotor es el promotor G9 de 289 pares de bases.
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B. Restauración de la Fertilidad Masculina en el Hı́brido F1
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Los métodos descritos anteriormente pueden usarse para producir plantas transgénicas de maı́z con
esterilidad masculina para la producción de hı́bridos F1 en cruces dirigidos a gran escala entre lı́neas
endogámicas. Si no todas las células huevo de las plantas transgénicas con esterilidad masculina contienen el gen foráneo que altera la función del tapetum, entonces una proporción de los hı́bridos F1 tendrá
un fenotipo de fertilidad masculina. Por otra parte, los hı́bridos F1 tendrán un fenotipo de esterilidad
masculina si el gen foráneo está presente en todas las células huevo de las plantas transgénicas con esterilidad masculina porque la esterilidad inducida por el gen foráneo serı́a dominante. De esta manera,
es deseable usar un sistema de restauración de la fertilidad masculina para proporcionar la producción
de hı́bridos F1 con fertilidad masculina. Dicho sistema de restauración de fertilidad tiene una utilidad
particular cuando el producto cosechado es la semilla.
Una estrategia para la restauración de la fertilidad masculina serı́a cruzar plantas transgénicas con
esterilidad masculina con plantas transgénicas con fertilidad masculina que contienen un gen de restauración de la fertilidad bajo el control de un elemento regulador especı́fico para el tapetum. Por ejemplo,
Mariani et al., Nature 357:384-387 (1992), crossed male-fertile plants that expressed a barnase inhibitor,
designated “barstar,” with male-sterile plants that expressed barnase. Hartley, J. Mol. Biol. 202:913
(1988), describe la secuencia de nucleótidos de barstar.
De forma alternativa, la restauración de la fertilidad masculina puede conseguirse expresando ribozimas de la toxina diftérica en plantas con fertilidad masculina para neutralizar los efectos de la toxina
diftérica en plantas con esterilidad masculina. De esta manera, se puede restaurar la fertilidad masculina
en los hı́bridos F1 produciendo una planta transgénica con fertilidad masculina que sintetice una especie
particular de molécula de ARN o polipéptido para contrarrestar los efectos del gen foráneo particular
expresado en las plantas transgénicas con esterilidad masculina.
En un método alternativo para restaurar la fertilidad masculina, las plantas transgénicas con esterilidad masculina contienen un vector de expresión que comprende los siguientes elementos: un elemento
regulador especı́fico para el tapetum, un elemento regulador procariota, y un gen foráneo capaz de alterar la función del tapetum. Se producen plantas transgénicas con fertilidad masculina que expresan un
péptido procariota bajo el control de un elemento regulador especı́fico para el tapetum. En los hı́bridos
F1, el péptido procariota se une a la secuencia reguladora procariota y reprime la expresión del gen
foráneo que es capaz de alterar la función del tapetum. Una ventaja de esta estrategia para la restauración de la fertilidad es que puede usarse una forma de planta transgénica con fertilidad masculina para
proporcionar fertilidad en F1 independientemente de la identidad del gen foráneo que se usó para alterar
la función del tapetum en la planta transgénica con esterilidad masculina.
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Por ejemplo, para regular la expresión del gen de acuerdo con la presente invención puede usarse el
sistema operador gen LexA/LexA. Véase la patente de Estados Unidos No. 4.833.080 (“la patente ’080”)
y Wang et al., Mol. Cell. Biol. 13:1805 (1993). Más especı́ficamente, el vector de expresión de la planta
con esterilidad masculina contendrı́a la secuencia del operador LexA, mientras que el vector de expresión
de la planta con fertilidad masculina contendrı́a las secuencias codificantes del represor de LexA. En el
hı́brido F1, el represor LexA se unirı́a a la secuencia del operador LexA e inhibirı́a la transcripción del
gen foráneo que codifica un producto capaz de alterar la función del tapetum.
Las moléculas de ADN del operador LexA pueden obtenerse, por ejemplo, sintetizando fragmentos de
ADN que contienen la secuencia bien conocida del operador LexA. Véase, por ejemplo, la patente ‘080,
supra, y Garriga et al., Mol. Gen. Genet. 236:125 (1992). El gen LexA puede obtenerse sintetizando
una molécula de ADN que codifica el represor de LexA. Las técnicas de sı́ntesis de genes se han discutido
anteriormente y se describen secuencias génicas de LexA, por ejemplo, por Garriga et al.,supra. De forma
alternativa, pueden obtenerse moléculas de ADN que codifican el represor de LexA a partir del plásmido
pRB500, American Type Culture Collection, con el No. de acceso 67758. Los especialistas en la técnica
pueden diseñar fácilmente otras estrategias de restauración de la fertilidad masculina usando sistemas de
regulación procariotas, tales como el sistema represor lac/operón lac o el sistema represor trp/operón trp.
La presente invención, ası́ descrita en general, se comprenderá más fácilmente haciendo referencia a
los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y que no pretenden limitar la presente
invención.
Ejemplo 1
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Identificación de un Elemento Regulador Especı́fico para el Tapetum por Análisis de Deleción
El Dr. Stephen Goff (U.S Department of Agriculture; Albany, CA) proporcionó un clon genómico que
contiene un gen denominado SGB6. El clon genómico de SGB6 se habı́a aislado a partir de una biblioteca
genómica de maı́z W22 en EMBL3 (Clontech Laboratories, Inc.; Palo Alto, CA), usando ADNc de SGB6
radiomarcado como sonda. Como el gen SGB6 se expresa en el estrato del tapetum de la antera de
maı́z, se realizaron experimentos para determinar si un elemento regulador especı́fico para el tapetum se
localiza cadena arriba del gen SGB6.
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Para determinar la secuencia de nucleótidos de la región cadena arriba de SGB6, se insertó un fragmento de ADN ApaLI/SmaI de 1339 pares de bases que contenı́a la región cadena arriba en el vector
R
KS+ (Stratagene Cloning Systems; La Jolla, CA). Véase el subclon “DP1425” en la FipBluescript
gura 1. Se generaron deleciones progresivas del fragmento ApaLI/SmaI usando técnicas bien conocidas
y un kit obtenido de Stratagene Cloning Systems, Inc. En resumen, el ADN del plásmido se digirió con
BamHIo con EcoRI para producir un segmento de ADN monocatenario 5’ como punto de partida para la
digestión con la exonucleasa III. El ADN del plásmido se digirió también con SacI o KpnI para generar un
segmento de ADN monocatenario 3’ para proteger el ADN del vector de la digestión por la exonucleasa
III. Después de la digestión con la exonucleasa III, el ADN se digirió con nucleasa de Vigna radiata para
producir extremos romos. Se secuenciaron los subclones que contenı́an las deleciones progresivas por el
método didesoxi de terminación de cadena de Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463 (1977),
usando un Secuenciador ABI (Applied Biosystems, Inc.; Foster City, CA).
50
La función del supuesto elemento regulador especı́fico para el tapetum del gen SGB6 se caracterizó
por análisis de deleción. Se construyeron plásmidos de deleción de acuerdo con técnicas bien conocidas,
usando la digestión con exonucleasa III y nucleasa de Vigna radiata. Véase, por ejemplo, Ausubel et al.,
supra. La Figura 2 muestra los plásmidos de deleción obtenidos por este método.
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También se obtuvieron plásmidos de deleción clonando fragmentos de la supuesta región reguladora
que se habı́an sintetizado usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La Figura 3 muestra
una serie de deleciones 5’ con puntos finales en incrementos de 50 pares de bases desde el nucleótido -633
al -33. La Figura 4 muestra una serie de deleciones 3’ con puntos finales en incrementos de 50 pares de
bases desde el nucleótido -589 al -139.
La función de los plásmidos de deleción se ensayó con un ensayo de expresión transitoria usando
luciferasa (LU) como gen indicador. Para estos estudios, se aislaron anteras de maı́z de las panı́culas de
Z. mays W22 r-g Stadler a diversas etapas de desarrollo. Se fijó una antera de cada flósculo con Solución
de Farmer (3:1; V/V; etanol/ácido acético glacial) para determinar la etapa. Berlyn et al. BOTANICAL
MICROTECHNIQUE AND CYTOCHEMISTRY, página 32 (The Iowa State University Press 1976). Se
13
ES 2 188 658 T3
cultivaron en placas dos anteras de cada flósculo en medio de maduración de panı́cula, como describe
Pareddy et al., Crop Sci. J. 29: 1564 (1989), que se habı́a solidificado con agar GelRite al 0,5 % (Scott
Laboratories, Inc.).
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35
Se introdujo ADN plasmı́dico en tejido de anteras bombardeando el tejido con partı́culas de tungsteno de 1,8 µ recubiertas con ADN. En resumen, se precipitaron 10 µg de ADN en un volumen de 10 µl
sobre aproximadamente 750 µg (50 µl) de partı́culas de tungsteno lavadas con ácido nı́trico añadiendo
50 µl de cloruro cálcico 2,5 M y 2,0 µl de espermidina 0,1 M. La mezcla se sometió a ultrasonidos y las
partı́culas se sedimentaron por centrifugación, se lavaron en etanol y se resuspendieron en 60 µl de etanol
por ultrasonidos. Se dejaron secar alı́cuotas de 10 microlitros en discos de macrosoporte para bombardear
con la pistola de partı́culas de helio PDS-1000 (Bio-Rad Laboratories; Hercules, CA), usando discos de
fractura de 1000 PSI. Después del bombardeo con las partı́culas, el tejido de antera se incubó a 27◦C en
la oscuridad durante un periodo de 16 a 24 horas.
En los extractos de proteı́nas de tejido de anteras se ensayó la presencia de actividad luciferasa usando
técnicas convencionales. Véase, por ejemplo, De Wet et al., Mol. Cell. Biol. 7:725 (1987). En resumen,
se extrajo la proteı́na soluble del tejido de la antera moliendo el tejido con hielo en 100 ı̀l de tampón
de trituración (KPO4 50 mM, EDTA 10 mM, y ditiotreitol 2 mM; pH 7,8). Se retiraron los desechos
insolubles centrifugando la mezcla durante 5 minutos a velocidad máxima en una microcentrı́fuga refrigerada. Tı́picamente, una alı́cuota de extracto de planta de 20 µl se incubó con 200 µl de tampón de
ensayo (Tricina 25 nM, MgCl2 15 mM, ATP 5 mM, y albúmina de suero bovino a una concentración de
500 µg/ml) y 100 µl de luciferina 500 µM (sal de potasio). Se midió la luz de salida con un luminómetro
analı́tico Monolight 2010.
Los resultados de estos estudios demostraron que un fragmento de ADN que contiene la región cadena
arriba de SGB6 puede inducir la expresión transitoria de la luciferasa en las anteras en la etapa de cuartete y hasta la mitad de la etapa uninucleada del desarrollo de las anteras. Por el contrario, se detectó
poca o ninguna actividad luciferasa en las anteras premeióticas. Además, los resultados demostraron
que un fragmento de ADN que contiene los nucleótidos -735 a -489 cadena arriba del sitio de inicio de
la transcripción de SGB6 en combinación con el promotor nuclear de SGB6 (es decir, los primeros 37
nucleótidos cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción) pueden inducir un alto nivel de expresión
de luciferasa en el tejido de las anteras. Véase la Figura 4. Finalmente, los resultados mostrados en la
Figura 3 indican que un elemento regulador está localizado en los nucleótidos -583 a -483.
Ejemplo 2
Caracterización del Elemento Regulador Especı́fico para el Tapetum de 94 Pares de Bases
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Tras la identificación de una región cadena arriba de aproximadamente 100 pares de bases implicada
en la expresión de alto nivel de genes en el tejido de las anteras, se generaron fragmentos de ADN que
contenı́an deleciones internas usando los plásmidos de deleción 5’ y 3’ descritos anteriormente. La Figura
5 muestra que los fragmentos de ADN que contenı́an deleciones internas, o bien no tenı́an la región de
100 pares de bases completa o carecı́an de porciones de la región de 100 pares de bases. Una comparación
de los resultados obtenidos con los plásmidos DP4989 y DP4999 indicó que existe un elemento regulador
en la región que se extiende desde aproximadamente el nucleótido -588 al nucleótido -489.
La región reguladora de SGB6 se caracterizó adicionalmente sintetizando un fragmento de ADN de
94 pares de bases que contenı́a los nucleótidos -583 a -490, fusionando el fragmento de 94 pares de bases
cadena arriba del promotor nuclear de SGB6, e insertando el fragmento de ADN resultante en un vector
de luciferasa. Véase la Figura 6. Se construyeron vectores adicionales con múltiples copias de la región
de 94 pares de bases, con la región de 94 pares de bases colocada en orientación inversa con respecto al
promotor, y con porciones de la región de 94 pares de bases que abarcaban 32 o 45 pares de bases del
centro de la región de 94 pares de bases. Un plásmido de control contenı́a el promotor 35S de CaMV, la
región lı́der Ù’ no traducida del Virus del Mosaico del Tabaco, y el primer intrón del gen ADH1 de maı́z,
que se fusionó con el gen de la luciferasa. Todas las construcciones contenı́an una región de procesamiento
de transcritos 3’ procedente del gen del Inhibidor de Proteinasa II (PinII) de la patata.
Como se muestra en la Figura 6, las construcciones que contienen el fragmento de 94 pares de bases
fusionado al promotor nuclear de SGB6 pueden inducir la expresión génica. La expresión génica se aumentó doblando o cuadruplicando el número de copias del fragmento de 94 pares de bases cadena arriba
del promotor nuclear de SGB6. Además, la inserción del fragmento de 94 pares de bases en la orientación
inversa indujo también la expresión génica. De esta manera, los resultados indican que el fragmento de
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94 pares de bases induce la expresión génica de una forma independiente de la posición y la orientación,
que son las caracterı́sticas de un potenciador.
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Se realizaron experimentos para determinar si un plásmido que contiene el elemento regulador de 94
pares de bases puede inducir la actividad transitoria de la luciferasa en los coleóptilos, raı́ces o tejido
embrionario. Se obtuvieron coleóptilos y raı́ces esterilizando las superficies de plántulas B73 con lejı́a al
20 %, aclarando las plántulas dos veces con agua destilada estéril, y dejando que las plántulas absorbieran
agua durante un periodo de una a tres horas. Las plántulas germinaron en la oscuridad a 28◦ C durante
48 horas. El embrión germinado y el escutelo se escindieron de las semillas y se cultivaron en medio de
Murashige y Skoog que contenı́a 0,5 mg/l de zeatina y agar GelRite al 0,3 %. Los tejidos se bombardearon
con partı́culas de tungsteno recubiertas con ADN como se ha descrito anteriormente y los embriones se
incubaron durante 18-20 horas a 28◦ C en la oscuridad. Se escindieron los coleóptilos y las raı́ces de las
plántulas germinadas justo antes de homegeneizar el tejido para el análisis de la luciferasa, que se realizó
de la forma descrita anteriormente.
Se mantuvieron suspensiones embrionarias a 28◦C en la oscuridad subcultivando el tejido dos veces
por semana en medio que contenı́a sales MS y 2,0 mg/l de ácido 2,4-diclorofenoxi acético. Murashige et
al., Physiol. Plant 15:473 (1962). Antes del bombardeo con partı́culas, los cultivos se homogeneizaron y
resuspendieron en medio de Murashige y Skoog que contenı́a 0,5 mg/l de zeatina, agar GelRite al 0,3 %
y manitol 0,25 M. Los cultivos se incubaron en la oscuridad a 28◦C durante 5 horas o hasta la mañana
siguiente agitando antes del bombardeo con las partı́culas. Después del bombardeo, los cultivos se transfirieron a medio que contenı́a medio base AT, prolina (700 mg/l), ácido 2,4-diclorofenoxi acético (0,75
mg/l), y agar GelRite al 0,3 %. El medio base AT está formado por los siguientes componentes (gramos/100 litros de agua); nitrato potásico (160), sulfato magnésico anhidro (12,2), sulfato amónico (170),
FeSO4 ·XH2 O (2,039), EDTA disódico (2,78), yoduro potásico (0,075), ácido bórico (0,3), MnSO4 ·H2 O
(1,0), ZnSO4 ·H2 O (0,125), Na2 ·MoO4 ·2H2 O (0,025), sulfato cúprico anhidro (0,0016), cloruro de cobalto
anhidro (0,0014), cloruro cálcico anhidro, (22,65), fosfato potásico monobásico (30,0), HCl de piridoxina
(0,05), HCl de tiamina (0,1), ácido nicotı́nico (niacina; 0,05), y glicina (0,2). Los cultivos se incubaron
durante 18-24 horas a 28◦ C en la oscuridad.
30
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Un plásmido de control que contenı́a un promotor 35S de CaMV cadena arriba del gen de la luciferasa
indujo una potente actividad luciferasa en tejido de anteras, coleóptilos, raı́ces, y suspensiones embrionarias. Véase la Figura 7. Por el contrario, los plásmidos de ensayo que contenı́an los 94 pares de bases
fusionados al promotor nuclear de SGB6 o el promotor nuclear 35S de CaMV indujeron una potente
actividad luciferasa en las anteras, pero poca o ninguna actividad luciferasa en los coleóptilos, raı́ces, o
suspensiones embrionarias. De esta manera, el elemento regulador de 94 pares de bases puede regular la
función del promotor de SGB6 o de un promotor heterólogo de forma especı́fica para las anteras.
Ejemplo 3
40
Expresión In Vivo de un Gen Indicador Controlado por el Elemento Regulador Especı́fico para el Tapetum
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Se examinó la función de la región reguladora de SGB6 produciendo plantas de maı́z transgénicas que
contenı́an un vector de expresión GUS controlado por secuencias reguladoras especı́ficas para el tapetum.
Los vectores contenı́an también una región de procesamiento de la transcripción 3’ noscadena abajo del
gen indicador GUS. Las plantas transgénicas se obtuvieron por bombardeo de partı́culas de un cultivo
de suspensión embrionaria de maı́z GS2 (Pioneer Hi-Bred International, Inc.; Des Moines, IA) o por
tejido de callo obtenido de Hi-II, una variedad patentada de maı́z (Pioneer Hi-Bred International, Inc.).
El cultivo de GS2 se mantuvo en un medio que contenı́a sales MS y 2 mg/ml de ácido 2,4-diclorofenoxi
acético. El tejido del callo se mantuvo en medio sólido que contenı́a sales N6 [Chu et al., Sci. Sin. 18:659
(1975)], 1 mg/ml de ácido 2,4-diclorofenoxi acético, prolina 25 mM, y agar GelRite al 0,2 %.
Antes del bombardeo con partı́culas, el tejido embrionario se suspendió durante cuatro horas en el
medio descrito anteriormente con manitol 0,25 M y después se transfirió a discos de papel de filtro estériles
3MM, humedecidos con 0,5 ml del medio. Tı́picamente, los tejidos se bombardeaban a 650 PSI (4481,59
kPa) con partı́culas de tungsteno de 1,8 µ lavadas con ácido precipitadas con 0,1 a 10 µg de ADN, como
se ha descrito anteriormente. En estos experimentos, las partı́culas de tungsteno estaban recubiertas con
una mezcla 1:1 de un plásmido de ensayo y un plásmido de selección. El plásmido de ensayo contenı́a una
construcción SGB6-GUS, mientras que el plásmido de selección contenı́a el gen de fosfinotricin-N-acetil
transferasa fusionado a un promotor 35S de CaMV. La selección se realizó usando el medio descrito anteriormente, solidificado con agar GelRite al 0,2 % y que contenı́a 3 mg/ml de Bialaphos (fosfinotricina).
15
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La actividad GUS se midió usando una técnica convencional. Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387
(1987).
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El plásmido de ensayo introducido en GS2, pPHP2125, contenı́a la región 5’ de SBG6 desde el nucleótido -1047 al nucleótido +100, que se fusionó con el gen indicador GUS. Los resultados de estos
experimentos demostraron que la región reguladora de SGB6 puede inducir la expresión del gen GUS en
el estrato del tapetum de la antera de una planta transgénica. Por el contrario, la región reguladora de
SGB6 no indujo la expresión del gen GUS en las hojas o las raı́ces de las plantas transgénicas. No se
observó la expresión del gen GUS en las anteras de las plantas control transformadas únicamente con el
vector de expresión del gen de resistencia a fosfinotricina.
El plásmido de ensayo introducido en el tejido Hi-II, pPHP5390, contenı́a la región 5’ de SGB6 desde
el nucleótido -735 al nucleótido -489, la región promotora nuclear de SGB6 desde el nucleótido -37 al
nucleótido +100, y el gen indicador GUS. Los resultados indicaron que la región reguladora de SGB6
puede inducir la expresión del gen GUS en las anteras Hi-II de las plantas transgénicas. No se observó la
expresión del gen GUS en las anteras de las plantas control transformadas únicamente con el vector de
selección del gen de resistencia a la fosfinotricina.
Ejemplo 4
20
El Uso de un Promotor G9 para Extender el Lapso de Desarrollo de la Expresión del Gen Especı́fico para
el Tapetum
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Para extender el lapso de desarrollo de la expresión del gen especı́fico para el tapetum, se obtuvieron
secuencias promotoras a partir de un gen especı́fico para la antera, denominado “G9”, que se expresa
durante las etapas desde la meiosis a la fase de cuartete del desarrollo. Las secuencias promotoras de G9
se aislaron usando los métodos generales descritos anteriormente. En resumen, se obtuvo ADNc de G9
mediante la técnica de hibridación substractiva usando una biblioteca de ADNc de escapo de mazorca de
maı́z y una biblioteca de ADNc de panı́cula de maı́z en la que las anteras más maduras estaban en meiosis.
El ADNc de G9 se usó como sonda para aislar el clon genómico de G9. Se determinó la orientación de
las secuencias genómicas correspondientes al clon de ADNc de G9 y se secuenció la región cadena arriba
del gen G9.
Los estudios realizados con secuencias cadena arriba de G9 fusionadas a un gen indicador de luciferasa
indicaron que el promotor G9 induce la expresión génica en las anteras durante la meiosis y hasta la etapa
de cuartete del desarrollo. Véase la Figura 8. Los análisis de deleción identificaron un fragmento de 289
pares de bases que se extiende desde el inicio de la traducción hasta 192 nucleótidos cadena arriba de la
supuesta caja TATA y que contiene el promotor de G9. La secuencia de nucleótidos del promotor de G9
de 289 pares de bases se presenta en la Figura 9 [SEC ID NO: 2].
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45
Se construyó un vector de expresión que comprendı́a los siguientes elementos en secuencia: el elemento regulador especı́fico para el tapetum de 94 pares de bases (“Caja de Especificidad para la Antera
de SGB6”), el promotor de G9 de 289 pares de bases, y el gen de la luciferasa. El vector de expresión se
introdujo en el tejido de antera y se analizó la expresión transitoria del gen de la luciferasa como se ha
descrito anteriormente.
50
Como se demuestra en la Figura 8, la combinación del elemento regulador especı́fico para el tapetum y el promotor de G9 extendieron el lapso de desarrollo de la expresión del gen de la luciferasa. La
construcción quimérica reguladora proporcionó la expresión génica especı́fica para el tapetum durante la
meiosis y hasta la mitad de la etapa uninucleada del desarrollo.
55
Aunque lo anterior se refiere a realizaciones preferidas particulares, se entenderá que la presente invención no se limita a las mismas. A los especialistas habituales en la técnica se les ocurrirán que pueden
realizarse diversas modificaciones en las realizaciones descritas y que se pretende que dichas modificaciones estén dentro del alcance de la presente invención, que se define por las siguientes reivindicaciones.
60
Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en esta memoria descriptiva indican el
nivel de experiencia de los especialistas en la técnica a la que corresponde la invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en el presente documento como referencia en la misma
medida que si se indicara especı́fica e individualmente que cada publicación o solicitud de patente individual se incorpora como referencia en su totalidad.
16
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REIVINDICACIONES
5
1. Una molécula de ADN aislada, donde dicha molécula de ADN comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo compuesto por (a) la SEC ID NO: 1, y (b) fragmentos de (a), donde
dicha molécula de ADN es un elemento regulador especı́fico para el tapetum.
2. La molécula de ADN de la reivindicación 1, donde dicha molécula de ADN consta de la secuencia
de nucleótidos de la SEC ID NO: 1.
10
3. Un vector de expresión que comprende un elemento regulador especı́fico para el tapetum de la
reivindicación 1.
4. El vector de expresión de la reivindicación 3, que comprende además un promotor, donde la función
de dicho promotor está bajo el control de dicho elemento regulador especı́fico para el tapetum.
15
20
5. El vector de expresión de la reivindicación 4, en el que dicho promotor se selecciona entre el grupo
compuesto por el promotor nuclear de SGB6, que consta de aproximadamente 37 nucleótidos en la dirección 5’ del sitio de inicio de la transcripción del gen SGB6, y el promotor nuclear 35S de CaMV.
6. El vector de expresión de la reivindicación 5, en el que dicho promotor es el promotor nuclear de
SGB6, como se define en la reivindicación 5.
7. El vector de expresión de la reivindicación 4, en el que dicho promotor es una molécula de ADN
aislada seleccionada entre el grupo compuesto por:
25
(a) la SEC ID NO.: 2;
(b) una secuencia de nucleótidos que tiene una similitud de secuencia sustancial con la SEC ID NO:
2; y
30
(c) fragmentos de (a) o (b),
donde dicha molécula de ADN es un promotor de un gen especı́fico para la antera, que se expresa durante
las etapas desde la meiosis hasta la fase de cuartete del desarrollo.
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8. El vector de expresión de la reivindicación 4, que comprende además un gen foráneo, donde dicho
gen foráneo está unido operativamente a dicho promotor.
9. El vector de expresión de la reivindicación 8, en el que el producto de dicho gen foráneo altera la
función de las células del tapetum.
10. Un método de uso del vector de expresión de la reivindicación 9 para producir una plantacon
esterilidad masculina, que comprende la etapa de introducir dicho vector de expresión en células vegetales
embrionarias, donde dicho gen foráneo se selecciona entre el grupo compuesto por un gen estructural, un
gen sin sentido, un gen de ribozima y un gen de secuencia de guı́a externa.
11. El método de la reivindicación 10, en el que dicho gen estructural codifica una proteı́na seleccionada entre el grupo compuesto por la toxina diftérica, RNasa-T1 de Aspergillus oryzae, barnasa y calasa.
50
12. El método de la reivindicación 10, en el que el producto de dicho gen sin sentido se selecciona
entre el grupo compuesto por ARN de calasa sin sentido y ARN de chalcona sintasa A.
13. El método de la reivindicación 10, en el que dicho gen de ribozima comprende secuencias de
nucleótidos de calasa.
55
60
14. El método de la reivindicación 10, en el que dicho gen de secuencia de guı́a externa comprende
secuencias de nucleótidos de calasa.
15. El método de la reivindicación 10, en el que dichas células vegetales embrionarias son células
embrionarias de maı́z.
16. Una planta transgénica que comprende el vector de expresión de la reivindicación 9.
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17. Un método para producir una planta con esterilidad masculina, que comprende la etapa de:
5
10
(a) construir un vector de expresión que comprende un elemento regulador especı́fico para el tapetum,
un promotor, y un gen foráneo, donde dicho elemento regulador especı́fico para el tapetum comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo compuesto por (i) la SEC ID NO:
1, y (ii) fragmentos de (i),
donde dicho elemento regulador especı́fico para el tapetum junto con dicho promotor controlan la
expresión de dicho gen foráneo, y donde el producto de dicho gen foráneo altera la función de las células
del tapetum, produciéndose de esta manera una planta con esterilidad masculina.
18. El método de la reivindicación 17, que comprende además la etapa de:
(b) introducir dicho vector de expresión en células vegetales embrionarias.
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19. Un método de uso de un elemento regulador especı́fico para el tapetum para producir una planta
hı́brida con fertilidad masculina, que comprende las etapas de:
(a) producir una primera planta progenitora con esterilidad masculina que comprende un vector de
expresión que comprende el elemento regulador especı́fico para el tapetum de la reivindicación 1,
un promotor, y un primer gen foráneo, donde dicho elemento regulador especı́fico para el tapetum
junto con dicho promotor controlan la expresión de dicho primer gen foráneo, y donde el producto
de dicho primer gen foráneo altera la función de las células del tapetum;
(b) producir una segunda planta progenitora que comprende un vector de expresión que comprende
dicho elemento regulador especı́fico para el tapetum, un promotor y un segundo gen foráneo, donde
dicho elemento regulador especı́fico para el tapetum junto con dicho promotor controlan la expresión
de dicho segundo gen foráneo; y
(c) realizar una fertilización cruzada de dicha primera planta progenitora con dicha segunda planta
progenitora para producir una planta hı́brida,
donde las células del tapetum de dicha planta hı́brida expresan dicho segundo gen foráneo, y donde el
producto de dicho segundo gen foráneo previene la alteración de la función del tapetum por el producto
de dicho primer gen foráneo, produciéndose de esta manera una planta hı́brida fértil.
35
20. El método de la reivindicación 19, en el que dicho primer gen foráneo codifica barnasa y dicho
segundo gen foráneo codifica un inhibidor de barnasa.
40
21. El método de la reivindicación 19, en el que dicho producto de dicho primer gen foráneo es la
toxina diftérica y dicho producto de dicho segundo gen foráneo es una ribozima de la toxina diftérica.
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
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LISTA DE SECUENCIAS
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
5
(i) SOLICITANTE: PIONEER HI-BREAD INTERNATIONAL, INC.
(ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ELEMENTO REGULADOR QUE CONFIERE ESPECIFICIDAD DE TAPETUM
10
(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
(iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
(A) DESTINATARIO: Foley & Lardner
15
(B) CALLE: 3000 K Street, N.W., Suite 500
(C) CIUDAD: Washington, D.C.
20
(E) PAÍS: ESTADOS UNIDOS
(F) CÓDIGO POSTAL: 20007-5109
(v) FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
25
(A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible
(B) ORDENADOR: PC IBM compatible
30
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release No. 1.0, Versión No. 1.25
(vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
35
(A) NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US95/
(B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 20-ABRIL-1995
40
(viii) INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:
(A) NOMBRE: BENT, Stephen A.
(B) NÚMERO DE REGISTRO: 29.768
45
(C) NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 33229/304/PIHI
(ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
50
(A) TELÉFONO: (202) 672-5300
(B) TELEFAX: (202) 672-5399
(C) TELEX: 904136
55
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 1:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
60
(A) LONGITUD: 94 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
1
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(C) CADENA: doble
(D) TOPOLOGÍA: lineal
5
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
10
15
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 2:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 292 pares de bases
20
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
25
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
30
35
40
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