ESTUDIO DE LA CINÉTICA DE GELIFICACIÓN DE SISTEMAS WPI/DEXTRANO CONJUGADOS MEDIANTE REACCIÓN DE MAILLARD. INFLUENCIA DEL TIEMPO DE REACCIÓN Spotti, María Juliaa,c*; Perduca, Martinaa,b,c; Santiago, Lilianab; Rubiolo, Ameliab; Carrara, Carlosb b Grupo de Biocoloides, Instituto de Tecnología de Alimentos, Facultad de Ingeniería Química, Universidad Nacional del Litoral, 1° de mayo 3250 (3000), Santa Fe, Argentina. a Facultad de Ingeniería, Universidad de la Cuenca del Plata, Lavalle 50 (3400), Corrientes, Argentina c Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas * juliaspotti@yahoo.com.ar Resumen Se evaluaron las propiedades reológicas de soluciones mixtas y glicosiladas obtenidas con un aislado de proteína de suero (WPI) y dextrano (DX) (15-25 kDa), en condiciones de gelificación de las proteínas. Las proteínas glicosiladas se obtuvieron a 2, 5 y 9 días a 60 °C, y a una humedad relativa del 63%. Como indicadores de la reacción de Maillard se evaluó el cambio de color mediante el sistema CIE Lab (a*, b* y L*) y los grupos amino libres. Las determinaciones reológicas se realizaron en un reómetro oscilatorio dinámico de platos paralelos. La cinética de gelificación se llevó a cabo a una frecuencia de 1 Hz y una deformación de 0,01%. El programa térmico comprendió calentamiento desde 25 °C hasta 90 °C, mantención a 90 °C, enfriamiento a 25 °C y mantención a 25 °C. Los resultados de color mostraron que el parámetro a* fue el que presentó mayor variación, aumentando hacia el rojo a mayores tiempos de reacción. El parámetro b* presentó la misma tendencia que a*, pero hacia el amarillo. Hubo una disminución de los grupos aminos libres con respecto al WPI a medida que aumentaban los días de glicosilación. En los ensayos reológicos se observó que en los sistemas conjugados el tiempo de gelificación (cruce de G´ y G´´) aumentó con respecto al sistema mixto (WPI/DX sin glicosilar). El sistema mixto presentó aumento en el valor de G´ a 25°C con respecto al control (WPI), mientras que en los sistemas conjugados G´ disminuyó con los días de glicosilación. Palabras clave: Reacción de Maillard; Reología; WPI; Dextrano. Introducción La glicosilación o reacción de Maillard es una reacción de condensación entre un extremo carbonilo reductor de un carbohidrato y una amina primaria de una proteína que usualmente toma lugar en los procesos térmicos de alimentos. La reacción de Maillard ocurre naturalmente en determinadas condiciones de temperatura y actividad de agua. Los mecanismos de la reacción son complejos y en las últimas etapas se forma una amplia gama de productos, entre ellos los que se conocen como melanoidinas que dan el típico color marrón-rojizo (1; 2; 3). Debido a la unión covalente de una cadena de ázucar, las propiedades funcionales de las proteínas (solubilidad, estabilidad térmica y propiedades emulsionantes) pueden ser modificadas después de la reacción (4; 5; 6; 7). Es por esto que algunos años atrás se comenzó a estudiar la utilización de la reacción de Maillard en la síntesis controlada de derivados conjugados de proteínas para generar nuevos compuestos con propiedades funcionales mejoradas (8; 9; 10). Las propiedades de las proteínas conjugadas dependieron tanto de la conformación de la proteína como de las características del polisacárido (hidrofobicidad, viscosidad, longitud de cadena y número de uniones) (11; 12). Se pudo demostrar que los conjugados tuvieron mejores propiedades emulsionantes (13; 14), espumantes (15), solubilidad proteica (16) y estabilidad al calor que las proteínas precursoras (5). Las proteínas de suero son obtenidas como el sub-producto del suero de quesería. Representan el 20% del total de las proteínas de leche y están compuestas de -lactoglobulina ( -lg) (50%), lactoalbúmina (20%), seroalbúmina (BSA), inmunoglobulinas y proteínas menores (17; 18, 19). Las proteínas de suero son muy usadas en la industria alimentaria por su alto valor nutricional y sus buenas propiedades funcionales (emulsificante, gelificante, espumante, etc) (20). Los dextranos son polisacáridos compuestos principalmente por una cadena lineal de residuos de glucosa unidos por enlaces -1,6. Han sido usados para conjugar proteínas, ya que son de naturaleza reductora y al ser neutros se inhibe la formación de complejos electrostáticos. La estructura de los dextranos es muy flexible cuando está en solución acuosa, lo que lo hace incapaz de formar un gel. Esta propiedad es apropiada para estudios de gelificación de proteínas. La gelificación térmica de proteínas globulares, como las proteínas de suero, está basada en la desnaturalización y agregación de las moléculas, provocada por el cambio conformacional inducido por el calor. Los geles térmicos formados están estabilizados por los nuevos puentes disulfuro intra e intercatenarios que se forman en la desnaturalización-agregación. La gelificación y el tipo de gel formado depende de muchos factores, tales como la fuerza iónica, pH, temperatura, tiempo de calentamiento, así como el tipo y la concentración de proteína (21; 22). Por otro lado, el comportamiento de gelificación puede ser modificado por la presencia de polisacáridos y por su unión covalente a las proteínas mediante la Reacción de Maillard. Sin embargo, hay muy pocos trabajos orientados a estudiar la influencia de esta reacción en la gelificación de proteínas. Es por esto, que el objetivo del presente trabajo fue investigar el efecto de la reacción de Maillard en las propiedades reológicas del WPI. Materiales y Métodos 2.1. Materiales. Se utilizó un aislado de proteínas de suero lácteo (WPI) provisto por Davisco Foods Internacional Inc. (Minnesota, Estados Unidos). La composición centesimal informada del mismo es: 97,9% de proteínas en base seca, 0,2% de grasa, 1,9% de cenizas y 4,8% de humedad. El dextrano (DX) de 15-25 kDa fue obtenido de Sigma-Aldrich. 2.2. Obtención de Conjugados WPI-DX. Para obtener las soluciones glicosiladas, se mezcló WPI (12% p/p) y DX (7.2 % p/p). A estas soluciones se le agregó azida de sodio al 0,2% como bactericida, y se reguló a pH 7,0. Luego se liofilizaron las mezclas WPI/DX, y los polvos resultantes se colocaron 2, 5 o 9 días a 60°C y 0,63 de aw, obteniendo los polvos conjugados. Para obtener las soluciones glicosiladas, se reconstituyeron las soluciones a su concentración original con agua ultrapura. Las soluciones mixtas se obtuvieron mezclando WPI y DX en la misma concentración que las glicosiladas. En todos los casos se uso WPI al 12% p/p como control. Todas las muestras se conservaron a 4°C hasta su uso. 2.3. Determinación de color de los polvos conjugados. En el ensayo se utilizó un colorímetro triestímulo Minolta modelo 508d, que aplica el sistema CIELAB, definido en coordenadas rectangulares (L*, a*, b*). Se utilizó un iluminante de 65º, y un ángulo de observador de 10º. A los polvos conjugados obtenidos en el punto anterior (previo tamizado con malla ASTM 40 (420 m)) se les evaluaron los parámetros: L* (luminosidad), a* (+ rojo, - verde) y b* (+ amarillo, - azul). 2.4. Detección de grupos amino libres mediante la técnica del O-ftaladialdehído. Las muestras se diluyeron hasta el 0.8 % p/p de WPI equivalente. A 1 ml de muestra y se le agregó 100 l de 2-mercaptoetanol y 100 l de SDS al 20%. Luego, las muestras fueron incubadas 5 min a 90°C. El reactivo de OPA se preparó según Sun y col. (23). A 100 l de muestra tratada se le agregó 2 ml de reactivo de OPA y se incubó 2 min a 35°C. Como patrón se utilizó L-leucina (0.54mM). Se midió su absorbancia a 340 nm con un espectrofotómetro Genesis V (Milton Roy). Para calcular la disminución en los grupos amino libres de las muestras glicosiladas se tomó como referencia (100%) el WPI control. 2.5. Reología Dinámica oscilatoria. Las determinaciones se realizaron en un reómetro oscilatorio dinámico Phaar Physica MCR 300 con esfuerzo de corte controlado, utilizando un sistema de platos parelelos (PP30/S) con un gap de 1 mm. La temperatura del plato inferior fue controlada mediante un sistema Peltier y un baño termostatizado (Viscotherm VT2, Phaar Physica). Para realizar cinética de gelificación se utilizó una frecuencia de 1 Hz y una deformación de 0.01% (región viscoelástica lineal). La rampa de temperatura utilizada fue un aumento desde una temperatura inicial de 25 °C hasta 90 °C a una velocidad de 5 °C/min, se mantuvo a 90 °C durante 10 minutos, se disminuyó la temperatura de 90 °C a 25 °C a una velocidad de 25 °C/min y por último se mantuvo otros 10 minutos a 25 °C. Durante las mediciones se registró la evolución del módulo elástico (G’) y el módulo viscoso (G’’) en función del tiempo y la temperatura. Luego se determinó el el “punto gel”, es decir el punto de cruce entre el módulo viscoso (G’’) y el elástico (G’) donde se da la transición de una estructura viscosa a una viscoelástica durante el calentamiento. Luego de la medición y antes de sacar la muestra del sistema, se realizó un barrido de frecuencia a una deformación de 1 %, entre 0,01 y 10 Hz. La dependencia del módulo elástico con la frecuencia da información sobre el tipo de estructura que presenta el gel (24). 2.7. Análisis estadístico. Las determinaciones se hicieron al menos por triplicado y los resultados se presentan como la media error estándar. Se aplicó ANOVA de una variable para determinar diferencias significativas entre las distintas condiciones de ensayos (Statgraphics Centurion XV). Resultados y Discusión El cambio en los grupos amino libres es comúnmente usado para estimar el progreso de la reacción de Maillard. En la Figura 1 se muestran la cuantificación de los grupos amino libres tomando como referencia el WPI control. En la misma puede observarse que hay una disminución de estos grupos conforme aumentan los días de reacción. El sistema conjugado que presentó menos grupos aminos libres fue el conjugado de 9 días. Esto es esperable teniendo en cuenta que a mayor tiempo de reacción, más progreso tiene la misma. Resultados similares fueron encontrados por Wooster y Augustin (25). Figura 1. Cuantificación de grupos aminos libres para los sistemas WPI/DX conjugados según los días de reacción, tomando como 100% de grupos amino libres al WPI control. Los parámetros de color Cielab de los sistemas WPI no incubado (0 días), incubado (2, 5 y 9 días) y WPI/DX conjugados (2, 5 y 9 días) se muestran en la Figura 2 A, B y C. Podemos observar que los parámetros a* (A) y b* (B) de los sistemas WPI/DX conjugados aumentan a medida que aumentan los días de reacción, siendo el aumento mayor para el conjugado de 9 días. Sin embargo, los parámetros a* y b* de los correspondientes WPI incubados no desarrollaron color con respecto al WPI control (WPI no incubado). Debido al aumento en los parámetros a* y b* de los sistemas WPI/DX conjugados a medida que aumentan los días de reacción, hay una disminución en la luminosidad L (C), mientras que para los sistemas WPI incubados sin DX la luminosidad permanece casi constante. El desarrollo de color marrón-rojizo indicado por los parámetros a* (+, rojo) y b*(+, amarillo) estarían indicando que se produce un avance de la reacción de Maillard. Estos resultados concuerdan con los obtenidos mediante el ensayo de OPA. Figura 2. Parámetros CIE Lab para WPI () incubado 0, 2, 5 y 9 días y sistemas WPI/DX () incubados 2, 5 y 9 días. Los reogramas obtenidos mediante reología oscilatoria con rampa de calentamiento se pueden observar en la Figura 3. En esta figura podemos apreciar la dinámica de gelificación de soluciones de WPI al 12 % p/p con o sin agregado de DX (7.2% p/p) según los días de glicosilación. El cruce de los módulos elástico (G’) y viscoso (G’’) indica el punto de gelificación; a partir del mismo se obtienen los valores de tiempo y temperatura de gelificación (tgel y Tgel, respectivamente) (26). En algunos casos se observó que la gelificación ocurría durante la etapa de calentamiento entonces pudo obtenerse la temperatura de gelificación (Tgel), sin embargo hubo casos en los que el cruce de G’ y G’’ ocurrió en la etapa de temperatura constante (90°C), entonces el parámetro obtenido fue el tiempo de gelificación (tgel) a esa temperatura. Luego del punto gel, en todos los sistemas se observa un gran incremento del valor de G' y G'' al aumentar la temperatura hasta 90 ºC, seguido por un leve aumento mientras la temperatura se mantiene a 90 °C. Durante el enfriamiento de 90 a 25 °C se observa un gran incremento en estos dos parámetros, sobre todo en G´ (Figura 3). Este incremento tiende a ser constante en el tiempo de permanencia a 25°C. El incremento de los módulos G’ y G’’ durante el enfriamiento se ha observado para muchas proteínas entre ellas para proteínas del lactosuero y de soja (27) y se debe a una reducción en la entropía, que consolida las fuerzas de atracción (puentes de hidrógeno, fuerzas de van der Waals) entre las partículas proteicas en el gel. Para mayor claridad, la evolución del módulo G´ con respecto al tiempo y la temperatura para los sistemas de WPI sin DX y con DX a los distintos días de incubación se observa en la Figura 4 A y B, respectivamente. El mayor valor alcanzado por el módulo G´ (25°C) es para el sistema WPI/DX no incubado, siendo considerablemente mayor al del sistema WPI no incubado. Estos resultados estarían indicando que la presencia de DX refuerza la red del gel. Resultados similares fueron encontrados por Tavares y col. (28) en sistemas mixtos de WPI con galactomananos (polisacáridos neutros). Por otra parte, los sistemas WPI/DX conjugados 2, 5 y 9 días tienen un valor del módulo G´ mucho menor que el WPI/DX no incubado (mixto). Así mismo, todos los sistemas de WPI a 2, 5 y 9 días de incubación tienen un valor mayor de G´ en comparación con los geles WPI/DX a esos mismos días de incubación. Todos estos resultados estarían indicando que la formación de los productos de la reacción de glicosilación disminuye la fuerza de gel. Resultados similares fueron encontrados por Sun y col. (23), donde un sistema WPI/DX de 150 Kda conjugado tuvo un valor de G´ 10 veces menor al del WPI control. Figura 3. Evolución de G´( ), G´´(O) y tan (+)durante la gelificación inducida por calor de: una solución de WPI al 12 % p/p (A) y soluciones de WPI al 12% previamente glicosiladas 2 días (B), 5 días (C) y 9 días (D); y soluciones WPI/DX (DX al 7.2% p/p) mixtas (E) y previamente glicosiladas 2 días (F), 5 días (G), y 9 días (H). En todos los casos también se indica el perfil de temperatura (–). Los valores de G´ a 25°C y tan , así como el tiempo (t gel) y la temperatura (T gel) del punto de cruce de G´ y G´´ que fueron obtenidos de las gráficas 3 y 4 se observan en la Tabla 1. El aumento de los valores de G´ en la etapa de enfriado y mantención a 25°C (Tabla 1) da idea de la diferencia en la dureza de los geles. El G´ disminuye a medida que aumentan los días de glicosilación, es decir a medida que la reacción tiene un progreso mayor. Si bien para los sistemas WPI esta diferencia existe, es menor que para los sistemas WPI/DX. En cuanto a la tan (que da idea de la viscosidad relativa) se observa que para los sistemas WPI/DX conjugados (incubados), la viscoelasticidad relativa es menor a la del mismo sistema sin conjugar (WPI/DX no incubado). A su vez, los sistemas WPI/DX incubados presentaron menor viscoelasticidad relativa que los sistemas de WPI a los mismos días de incubación. Figura 4. Evolución de G’ durante la gelificación inducida por calor de soluciones de WPI al 12% a distintos días de glicosilación (A) y de soluciones WPI/DX con 7.2% p/p de DX a distintos días de glicosilación (B). En ambos casos: ( ) 0, ( ) 2, ( ).5 y ( ) 9 días; y (–) perfil de temperatura. En cuanto a los valores de tiempo (t gel) y temperatura (T gel) de gelificación obtenidos a partir de los reogramas se observa que para un mismo sistema, a medida que aumentan los días de glicosilación, tanto el tiempo como la temperatura a la cual se lleva a cabo la formación del gel aumentan. Este fenómeno se ve intensificado cuando el sistema está compuesto por WPI y DX, coincidiendo con que en estos sistemas el avance de la reacción de glicosilación es mucho mayor en relación a los sistemas de WPI (ver Figura1). Esto daría un indicio de que el aumento de los productos de reacción en el medio retarda la formación del gel. Tabla 1. G´ a 25°C para geles WPI al 12% con y sin agregado de DX según los días de glicosilación. Temperatura y tiempo de gelificación para soluciones de WPI al 12 %p/p y para soluciones WPI/DX al 7.2% a distintos días de glicosilación. 9 días 5 días 2 días 0 días DX Glicosilación (%p/p) G´ a 25°C a tan Tiempo gel (min) a 25°C 0.119 ± 0.009 a 12.0 ± 0.0 ab Temp gel (°C) 85 ± 0.0 a 0 3220 ± 88 7.2 16500 ± 200 c 0.111 ± 0.005 a 11.7 ± 0.3 a 83.3 ± 1.7 a 0 1185 ± 86 b 0.143 ± 0.011 ab 12.3 ± 0.3 bc 88.4 ± 0.0 b 7.2 1281 ± 44 b 0.204 ± 0.035 c 13.7* ± 0.0 d 90.0* ± 0.0 b 0 2634 ± 478 a 0.118 ± 0.001 a 12.7 ± 0.0 c 88.4 ± 0.0 b 7.2 1781 ± 61 b 0.129 ± 0.001 ab 14.2* ± 0.1 d 90.0* ± 0.0 b 0 1775 ± 430 b 0.141 ± 0.002 ab 12.7 ± 0.0 c 88.4 ± 0.0 b 7.2 1213 ± 148 b 0.165 ± 0.007 bc 14.8* ± 0.1 e 90.0* ± 0.0 b Los valores con las mismas letras no arrojaron diferencias significativas al aplicar la prueba de Duncan con 0,05.*Temperatura y tiempo obtenidos en la parte isotérmica de la curva. Los barridos de frecuencia de geles mixtos y conjugados se observan en la Figura 7. Podemos observar que todos son geles verdaderos y que hay una leve disminución de G´ a medida que aumenta la frecuencia aplicada en todos los sistemas. También se puede observar que los valores de G´ son menores en el caso de los sistemas WPI/DX conjugados con respecto al sistema WPI/DX no incubado, coincidiendo con los resultados obtenidos anteriormente. Figura 7. Barridos de frecuencia de soluciones de WPI al 12% a distintos días de glicosilación (A) y de soluciones WPI/DX con 7.2% p/p de DX a distintos días de glicosilación (B). En ambos casos: () 0, () 2, ().5 y () 9 días. Conclusiones La reacción de glicosilación se llevó a cabo en todas las condiciones estudiadas en los sistemas WPI/DX, según los ensayos de cuantificación de grupos amino libres y OPA. Esta reacción afectó en gran medida las propiedades de gelificación de estos sistemas. Mediante los ensayos de reología oscilatoria se puedo determinar que tanto el tiempo como la temperatura de gelificación se vieron afectados por la reacción de glicosilación, siendo este efecto mayor en sistemas WPI/DX. También se pudo determinar que la firmeza de los geles disminuyó a medida que aumentaba el tiempo de incubación. Agradecimientos CAI+D. PI-57283. Desarrollo de biomateriales a partir de proteínas de suero lácteas y polisacáridos. Referencias 1) AJANDOUZ, E. H., TCHIAKPE, L. S., ORE, F. D., BENAJIBA, A., & PUIGSERVER, A. (2001). Effects of pH on caramelization and Maillard reaction kinetics in fructose–lysine model systems. Journal of Food Science, 66(7), 926– 931. 2) CAILLARD, R., REMONDETTO, G. E., & SUBIRADE, M. (2009). Physicochemical properties and microstructure of soy protein hydrogels co-induced by Maillard type crosslinking and salts. Food Research International, 42(1), 98–106. 3) MASTROCOLA, D., & MUNARI, M. (2000). Progress of the Maillard reaction and antioxidant action of Maillard reaction products in preheated model systems during storage. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48(8), 3555– 3559. 4) ACHOURI, A., BOYE, J. I., YAYLAYAN, V. A., & YEBOAN, F. K. (2005). Functional properties of glycated soy 11S glycinin. Journal of Food Science, 70(4), 269–274. 5) CHEVALIER, F., CHOBERT, J.-M., GENOT, C., HAERTLÉ, T. (2001). Scavenging of free radicals, antimicrobial and cytotoxic activities of the Maillard reaction products of β-lactoglobulin glycated with several sugars. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, 5031–5038. 6) GUAN, J. J., QIU, A. Y., LIU, X. Y., HUA, Y. F., & MA, Y. H. (2006). Microwave improvement of soy protein isolate– saccharide graft reactions. Food Chemistry, 97(4), 577–585. 7) KATO, Y., AOKI, T., KATO, N., NAKAMURA, R., & MATSUDA, T. (1995). Modification of ovalbumin with glucose 6-phosphate by amino-carbonyl reaction: Improvement of protein heat stability and emulsifying activity. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 43(2), 301–305. 8) AKHTAR, M., & DICKINSON, E. (2003). Emulsifying properties of whey protein–dextran conjugates at low pH and different salt concentrations. Colloids and Surfaces. B, Biointerfaces, 31(1–4), 125–132. 9) JING, H., & KITTS, D. D. (2002). Chemical and biochemical properties of casein-sugar Maillard reaction products. Food Chemistry and Toxicology, 40(7), 1007–1015. 10) KATO A. (2002). Industrial Applications of Maillard-Type Protein-Polysaccharide Conjugates. Food Sci. Technol. Res., 8, 193–199. 11) KATO, Y., SASAKI Y, FURUTA R. KOBAYASHI K. (1990). Functional protein-polisaccharide conjugate prepared by controlled dry-heating of ovoalbumin-dextran mixtures. Agric. Biol. Chem. 54, 107-112. 12) JIMENEZ-CASTAÑO, L., VILLAMIEL, M., LOPEZ-FANDIÑO, R. (2007). Glicosilation of indivual whey proteins by Maillard reaction using dextran of different molecular mass. Food Hydrocolloids. 21, 433-443. 13) EINHORN-STOLL U., ULBRICH M., SEVER S., KUNZEK H. (2005). Formation of milk protein pectin conjugates with improved emulsifying properties by controlled dry heating. Food Hydrocolloids, 19, 329-340. 14) OLIVER , C. M., MELTON, L. D. STANLEY, R. A. (2006). Creating protein with novel functionality via the Maillard reaction: A review. Critical review in Food Science and Nutrition, 46, 337-350. 15) DICKINSON, E., IZGI, E. (1996). Foam stabilization by protein-polysaccharide complexes. Colloids and Surfaces A:Physicochem Eng Aspects, 113, 191–201. 16) KATAYAMA, S., SHIMA, J., SAEKI, H. (2002). Solubility improvement of shellfish muscle proteins by reaction with glucose and its soluble state in low-ionicstrength medium. J. Agric. Food Chem., 50, 4327–4332. 17) KINSELLA, J. E. (1976). Functional properties of proteins in food: A survey. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 7(3), 219–280. 18) PERSSON, K. M., & GEKAS, V. (1994). Factors influencing aggregation of macromolecules in solution. Process Biochemistry, 29(2), 89–98. 19) CAYOT P., & LORIENT, D. (1997). Structure-function relationships of whey proteins. In S. Darmodaran and A. Parraf (Eds.), Food proteins and their applications (pp. 225-256). New York: Marcel Dekker. 20) FOEGEDING, E. A., DAVIS, J. P., DOUCET, D., & MCGUFFEY, M. K. (2002). Advances in modifying and understanding whey protein functionality. Trends in Food Science and Technology, 13(5), 151–159. 21) FOEGEDING, E. A., BOWLAND, E. L., & HARDIN, C. C. (1995). Factors that determine the fracture properties and microstructure of globular protein gels. Food Hydrocolloids, 9 (4), 237–249. 22) LANGTON, M., & HERMANSSON, A. (1992). Fine-stranded and particulate gels of β-lactoglobulin and whey protein at varying pH. Food Hydrocolloids, 5(6), 523–539. 23) SUN, YU YANG, WANG, ZHANG AND ZHENG (2011). Study on the rheological properties of heat-induced whey protein isolate–dextran conjugate gel. Food Research International, vol. 44, pp 3259–3263. 24) STADING, M. AND HERMANSSON, A. (1992). Inhomogeneous fine-stranded β-lactoglobulin gels. Food Hydrocolloids, vol 5, pp 455-470. 25) WOOSTER, T. J., AUGUSTIN, M. A. (2007) Rheology of whey protein–dextran conjugate films at the air/water interface. Food Hydrocolloids, 21, 1072–1080.16 26) CLARK, A. H. (1992). Gels and gelling. En: H. G. Schwartzberg, & R. W. Hartel, Physical chemistry of foods (pp. 263305). New York: Marcel Dekker 27) OULD ELEYA, M. M., & TURGEON, S. L. (2000). Rheology of κ-carrageenan and β-lactoglobulin mixed gels. Food Hydrocolloids, 14, 29-40. 28) TAVARES, C., & LOPES DA SILVA, J. (2003). Rheology of galactomannan-whey protein mixed systems. International Dairy Journal, 13 (8), 699-706.