estudio de la cinética de gelificación de sistemas wpi

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ESTUDIO DE LA CINÉTICA DE GELIFICACIÓN DE SISTEMAS
WPI/DEXTRANO CONJUGADOS MEDIANTE REACCIÓN DE
MAILLARD. INFLUENCIA DEL TIEMPO DE REACCIÓN
Spotti, María Juliaa,c*; Perduca, Martinaa,b,c; Santiago, Lilianab; Rubiolo, Ameliab; Carrara,
Carlosb
b
Grupo de Biocoloides, Instituto de Tecnología de Alimentos, Facultad de Ingeniería Química,
Universidad Nacional del Litoral, 1° de mayo 3250 (3000), Santa Fe, Argentina.
a
Facultad de Ingeniería, Universidad de la Cuenca del Plata, Lavalle 50 (3400), Corrientes,
Argentina
c
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas
* juliaspotti@yahoo.com.ar
Resumen
Se evaluaron las propiedades reológicas de soluciones mixtas y glicosiladas obtenidas con un aislado de proteína
de suero (WPI) y dextrano (DX) (15-25 kDa), en condiciones de gelificación de las proteínas. Las proteínas
glicosiladas se obtuvieron a 2, 5 y 9 días a 60 °C, y a una humedad relativa del 63%. Como indicadores de la
reacción de Maillard se evaluó el cambio de color mediante el sistema CIE Lab (a*, b* y L*) y los grupos amino
libres. Las determinaciones reológicas se realizaron en un reómetro oscilatorio dinámico de platos paralelos. La
cinética de gelificación se llevó a cabo a una frecuencia de 1 Hz y una deformación de 0,01%. El programa
térmico comprendió calentamiento desde 25 °C hasta 90 °C, mantención a 90 °C, enfriamiento a 25 °C y
mantención a 25 °C. Los resultados de color mostraron que el parámetro a* fue el que presentó mayor variación,
aumentando hacia el rojo a mayores tiempos de reacción. El parámetro b* presentó la misma tendencia que a*,
pero hacia el amarillo. Hubo una disminución de los grupos aminos libres con respecto al WPI a medida que
aumentaban los días de glicosilación. En los ensayos reológicos se observó que en los sistemas conjugados el
tiempo de gelificación (cruce de G´ y G´´) aumentó con respecto al sistema mixto (WPI/DX sin glicosilar). El
sistema mixto presentó aumento en el valor de G´ a 25°C con respecto al control (WPI), mientras que en los
sistemas conjugados G´ disminuyó con los días de glicosilación.
Palabras clave: Reacción de Maillard; Reología; WPI; Dextrano.
Introducción
La glicosilación o reacción de Maillard es una reacción de condensación entre un extremo
carbonilo reductor de un carbohidrato y una amina primaria de una proteína que usualmente toma
lugar en los procesos térmicos de alimentos. La reacción de Maillard ocurre naturalmente en
determinadas condiciones de temperatura y actividad de agua. Los mecanismos de la reacción son
complejos y en las últimas etapas se forma una amplia gama de productos, entre ellos los que se
conocen como melanoidinas que dan el típico color marrón-rojizo (1; 2; 3).
Debido a la unión covalente de una cadena de ázucar, las propiedades funcionales de las
proteínas (solubilidad, estabilidad térmica y propiedades emulsionantes) pueden ser modificadas
después de la reacción (4; 5; 6; 7). Es por esto que algunos años atrás se comenzó a estudiar la
utilización de la reacción de Maillard en la síntesis controlada de derivados conjugados de proteínas
para generar nuevos compuestos con propiedades funcionales mejoradas (8; 9; 10). Las propiedades
de las proteínas conjugadas dependieron tanto de la conformación de la proteína como de las
características del polisacárido (hidrofobicidad, viscosidad, longitud de cadena y número de uniones)
(11; 12). Se pudo demostrar que los conjugados tuvieron mejores propiedades emulsionantes (13; 14),
espumantes (15), solubilidad proteica (16) y estabilidad al calor que las proteínas precursoras (5).
Las proteínas de suero son obtenidas como el sub-producto del suero de quesería. Representan
el 20% del total de las proteínas de leche y están compuestas de -lactoglobulina ( -lg) (50%), lactoalbúmina (20%), seroalbúmina (BSA), inmunoglobulinas y proteínas menores (17; 18, 19). Las
proteínas de suero son muy usadas en la industria alimentaria por su alto valor nutricional y sus
buenas propiedades funcionales (emulsificante, gelificante, espumante, etc) (20).
Los dextranos son polisacáridos compuestos principalmente por una cadena lineal de residuos
de glucosa unidos por enlaces -1,6. Han sido usados para conjugar proteínas, ya que son de
naturaleza reductora y al ser neutros se inhibe la formación de complejos electrostáticos. La estructura
de los dextranos es muy flexible cuando está en solución acuosa, lo que lo hace incapaz de formar un
gel. Esta propiedad es apropiada para estudios de gelificación de proteínas.
La gelificación térmica de proteínas globulares, como las proteínas de suero, está basada en la
desnaturalización y agregación de las moléculas, provocada por el cambio conformacional inducido
por el calor. Los geles térmicos formados están estabilizados por los nuevos puentes disulfuro intra e
intercatenarios que se forman en la desnaturalización-agregación. La gelificación y el tipo de gel
formado depende de muchos factores, tales como la fuerza iónica, pH, temperatura, tiempo de
calentamiento, así como el tipo y la concentración de proteína (21; 22). Por otro lado, el
comportamiento de gelificación puede ser modificado por la presencia de polisacáridos y por su unión
covalente a las proteínas mediante la Reacción de Maillard. Sin embargo, hay muy pocos trabajos
orientados a estudiar la influencia de esta reacción en la gelificación de proteínas. Es por esto, que el
objetivo del presente trabajo fue investigar el efecto de la reacción de Maillard en las propiedades
reológicas del WPI.
Materiales y Métodos
2.1. Materiales.
Se utilizó un aislado de proteínas de suero lácteo (WPI) provisto por Davisco Foods
Internacional Inc. (Minnesota, Estados Unidos). La composición centesimal informada del mismo es:
97,9% de proteínas en base seca, 0,2% de grasa, 1,9% de cenizas y 4,8% de humedad. El dextrano
(DX) de 15-25 kDa fue obtenido de Sigma-Aldrich.
2.2. Obtención de Conjugados WPI-DX.
Para obtener las soluciones glicosiladas, se mezcló WPI (12% p/p) y DX (7.2 % p/p). A estas
soluciones se le agregó azida de sodio al 0,2% como bactericida, y se reguló a pH 7,0. Luego se
liofilizaron las mezclas WPI/DX, y los polvos resultantes se colocaron 2, 5 o 9 días a 60°C y 0,63 de
aw, obteniendo los polvos conjugados. Para obtener las soluciones glicosiladas, se reconstituyeron las
soluciones a su concentración original con agua ultrapura. Las soluciones mixtas se obtuvieron
mezclando WPI y DX en la misma concentración que las glicosiladas. En todos los casos se uso WPI
al 12% p/p como control. Todas las muestras se conservaron a 4°C hasta su uso.
2.3. Determinación de color de los polvos conjugados.
En el ensayo se utilizó un colorímetro triestímulo Minolta modelo 508d, que aplica el sistema
CIELAB, definido en coordenadas rectangulares (L*, a*, b*). Se utilizó un iluminante de 65º, y un
ángulo de observador de 10º. A los polvos conjugados obtenidos en el punto anterior (previo tamizado
con malla ASTM 40 (420 m)) se les evaluaron los parámetros: L* (luminosidad), a* (+ rojo, - verde)
y b* (+ amarillo, - azul).
2.4. Detección de grupos amino libres mediante la técnica del O-ftaladialdehído.
Las muestras se diluyeron hasta el 0.8 % p/p de WPI equivalente. A 1 ml de muestra y se le
agregó 100 l de 2-mercaptoetanol y 100 l de SDS al 20%. Luego, las muestras fueron incubadas 5
min a 90°C. El reactivo de OPA se preparó según Sun y col. (23). A 100 l de muestra tratada se le
agregó 2 ml de reactivo de OPA y se incubó 2 min a 35°C. Como patrón se utilizó L-leucina (0.54mM). Se midió su absorbancia a 340 nm con un espectrofotómetro Genesis V (Milton Roy). Para
calcular la disminución en los grupos amino libres de las muestras glicosiladas se tomó como
referencia (100%) el WPI control.
2.5. Reología Dinámica oscilatoria.
Las determinaciones se realizaron en un reómetro oscilatorio dinámico Phaar Physica MCR
300 con esfuerzo de corte controlado, utilizando un sistema de platos parelelos (PP30/S) con un gap
de 1 mm. La temperatura del plato inferior fue controlada mediante un sistema Peltier y un baño
termostatizado (Viscotherm VT2, Phaar Physica).
Para realizar cinética de gelificación se utilizó una frecuencia de 1 Hz y una deformación de
0.01% (región viscoelástica lineal). La rampa de temperatura utilizada fue un aumento desde una
temperatura inicial de 25 °C hasta 90 °C a una velocidad de 5 °C/min, se mantuvo a 90 °C durante 10
minutos, se disminuyó la temperatura de 90 °C a 25 °C a una velocidad de 25 °C/min y por último se
mantuvo otros 10 minutos a 25 °C. Durante las mediciones se registró la evolución del módulo
elástico (G’) y el módulo viscoso (G’’) en función del tiempo y la temperatura. Luego se determinó el
el “punto gel”, es decir el punto de cruce entre el módulo viscoso (G’’) y el elástico (G’) donde se da
la transición de una estructura viscosa a una viscoelástica durante el calentamiento.
Luego de la medición y antes de sacar la muestra del sistema, se realizó un barrido de
frecuencia a una deformación de 1 %, entre 0,01 y 10 Hz. La dependencia del módulo elástico con la
frecuencia da información sobre el tipo de estructura que presenta el gel (24).
2.7. Análisis estadístico.
Las determinaciones se hicieron al menos por triplicado y los resultados se presentan como la
media error estándar. Se aplicó ANOVA de una variable para determinar diferencias significativas
entre las distintas condiciones de ensayos (Statgraphics Centurion XV).
Resultados y Discusión
El cambio en los grupos amino libres es comúnmente usado para estimar el progreso de la
reacción de Maillard. En la Figura 1 se muestran la cuantificación de los grupos amino libres tomando
como referencia el WPI control. En la misma puede observarse que hay una disminución de estos
grupos conforme aumentan los días de reacción. El sistema conjugado que presentó menos grupos
aminos libres fue el conjugado de 9 días. Esto es esperable teniendo en cuenta que a mayor tiempo de
reacción, más progreso tiene la misma. Resultados similares fueron encontrados por Wooster y
Augustin (25).
Figura 1. Cuantificación de grupos aminos libres para los sistemas WPI/DX conjugados según los días de
reacción, tomando como 100% de grupos amino libres al WPI control.
Los parámetros de color Cielab de los sistemas WPI no incubado (0 días), incubado (2, 5 y 9
días) y WPI/DX conjugados (2, 5 y 9 días) se muestran en la Figura 2 A, B y C. Podemos observar
que los parámetros a* (A) y b* (B) de los sistemas WPI/DX conjugados aumentan a medida que
aumentan los días de reacción, siendo el aumento mayor para el conjugado de 9 días. Sin embargo, los
parámetros a* y b* de los correspondientes WPI incubados no desarrollaron color con respecto al
WPI control (WPI no incubado). Debido al aumento en los parámetros a* y b* de los sistemas
WPI/DX conjugados a medida que aumentan los días de reacción, hay una disminución en la
luminosidad L (C), mientras que para los sistemas WPI incubados sin DX la luminosidad permanece
casi constante. El desarrollo de color marrón-rojizo indicado por los parámetros a* (+, rojo) y b*(+,
amarillo) estarían indicando que se produce un avance de la reacción de Maillard. Estos resultados
concuerdan con los obtenidos mediante el ensayo de OPA.
Figura 2. Parámetros CIE Lab para WPI () incubado 0, 2, 5 y 9 días y sistemas WPI/DX () incubados 2, 5 y
9 días.
Los reogramas obtenidos mediante reología oscilatoria con rampa de calentamiento se pueden
observar en la Figura 3. En esta figura podemos apreciar la dinámica de gelificación de soluciones de
WPI al 12 % p/p con o sin agregado de DX (7.2% p/p) según los días de glicosilación. El cruce de los
módulos elástico (G’) y viscoso (G’’) indica el punto de gelificación; a partir del mismo se obtienen
los valores de tiempo y temperatura de gelificación (tgel y Tgel, respectivamente) (26). En algunos
casos se observó que la gelificación ocurría durante la etapa de calentamiento entonces pudo
obtenerse la temperatura de gelificación (Tgel), sin embargo hubo casos en los que el cruce de G’ y
G’’ ocurrió en la etapa de temperatura constante (90°C), entonces el parámetro obtenido fue el tiempo
de gelificación (tgel) a esa temperatura. Luego del punto gel, en todos los sistemas se observa un gran
incremento del valor de G' y G'' al aumentar la temperatura hasta 90 ºC, seguido por un leve aumento
mientras la temperatura se mantiene a 90 °C. Durante el enfriamiento de 90 a 25 °C se observa un
gran incremento en estos dos parámetros, sobre todo en G´ (Figura 3). Este incremento tiende a ser
constante en el tiempo de permanencia a 25°C. El incremento de los módulos G’ y G’’ durante el
enfriamiento se ha observado para muchas proteínas entre ellas para proteínas del lactosuero y de soja
(27) y se debe a una reducción en la entropía, que consolida las fuerzas de atracción (puentes de
hidrógeno, fuerzas de van der Waals) entre las partículas proteicas en el gel.
Para mayor claridad, la evolución del módulo G´ con respecto al tiempo y la temperatura para
los sistemas de WPI sin DX y con DX a los distintos días de incubación se observa en la Figura 4 A y
B, respectivamente. El mayor valor alcanzado por el módulo G´ (25°C) es para el sistema WPI/DX no
incubado, siendo considerablemente mayor al del sistema WPI no incubado. Estos resultados estarían
indicando que la presencia de DX refuerza la red del gel. Resultados similares fueron encontrados por
Tavares y col. (28) en sistemas mixtos de WPI con galactomananos (polisacáridos neutros). Por otra
parte, los sistemas WPI/DX conjugados 2, 5 y 9 días tienen un valor del módulo G´ mucho menor que
el WPI/DX no incubado (mixto). Así mismo, todos los sistemas de WPI a 2, 5 y 9 días de incubación
tienen un valor mayor de G´ en comparación con los geles WPI/DX a esos mismos días de incubación.
Todos estos resultados estarían indicando que la formación de los productos de la reacción de
glicosilación disminuye la fuerza de gel. Resultados similares fueron encontrados por Sun y col. (23),
donde un sistema WPI/DX de 150 Kda conjugado tuvo un valor de G´ 10 veces menor al del WPI
control.
Figura 3. Evolución de G´( ), G´´(O) y tan (+)durante la gelificación inducida por calor de: una solución de
WPI al 12 % p/p (A) y soluciones de WPI al 12% previamente glicosiladas 2 días (B), 5 días (C) y 9 días (D); y
soluciones WPI/DX (DX al 7.2% p/p) mixtas (E) y previamente glicosiladas 2 días (F), 5 días (G), y 9 días (H).
En todos los casos también se indica el perfil de temperatura (–).
Los valores de G´ a 25°C y tan , así como el tiempo (t gel) y la temperatura (T gel) del punto
de cruce de G´ y G´´ que fueron obtenidos de las gráficas 3 y 4 se observan en la Tabla 1. El aumento
de los valores de G´ en la etapa de enfriado y mantención a 25°C (Tabla 1) da idea de la diferencia en
la dureza de los geles. El G´ disminuye a medida que aumentan los días de glicosilación, es decir a
medida que la reacción tiene un progreso mayor. Si bien para los sistemas WPI esta diferencia existe,
es menor que para los sistemas WPI/DX. En cuanto a la tan (que da idea de la viscosidad relativa) se
observa que para los sistemas WPI/DX conjugados (incubados), la viscoelasticidad relativa es menor
a la del mismo sistema sin conjugar (WPI/DX no incubado). A su vez, los sistemas WPI/DX
incubados presentaron menor viscoelasticidad relativa que los sistemas de WPI a los mismos días de
incubación.
Figura 4. Evolución de G’ durante la gelificación inducida por calor de soluciones de WPI al 12% a distintos
días de glicosilación (A) y de soluciones WPI/DX con 7.2% p/p de DX a distintos días de glicosilación (B). En
ambos casos: ( ) 0, ( ) 2, ( ).5 y ( ) 9 días; y (–) perfil de temperatura.
En cuanto a los valores de tiempo (t gel) y temperatura (T gel) de gelificación obtenidos a
partir de los reogramas se observa que para un mismo sistema, a medida que aumentan los días de
glicosilación, tanto el tiempo como la temperatura a la cual se lleva a cabo la formación del gel
aumentan. Este fenómeno se ve intensificado cuando el sistema está compuesto por WPI y DX,
coincidiendo con que en estos sistemas el avance de la reacción de glicosilación es mucho mayor en
relación a los sistemas de WPI (ver Figura1). Esto daría un indicio de que el aumento de los productos
de reacción en el medio retarda la formación del gel.
Tabla 1. G´ a 25°C para geles WPI al 12% con y sin agregado de DX según los días de glicosilación.
Temperatura y tiempo de gelificación para soluciones de WPI al 12 %p/p y para soluciones WPI/DX al 7.2% a
distintos días de glicosilación.
9 días 5 días 2 días 0 días
DX
Glicosilación (%p/p)
G´ a 25°C
a
tan
Tiempo gel
(min)
a 25°C
0.119 ± 0.009
a
12.0 ± 0.0
ab
Temp gel (°C)
85 ± 0.0 a
0
3220 ± 88
7.2
16500 ± 200 c
0.111 ± 0.005 a
11.7 ± 0.3 a
83.3 ± 1.7 a
0
1185 ± 86 b
0.143 ± 0.011 ab
12.3 ± 0.3 bc
88.4 ± 0.0 b
7.2
1281 ± 44 b
0.204 ± 0.035 c
13.7* ± 0.0 d
90.0* ± 0.0 b
0
2634 ± 478 a
0.118 ± 0.001 a
12.7 ± 0.0 c
88.4 ± 0.0 b
7.2
1781 ± 61 b
0.129 ± 0.001 ab
14.2* ± 0.1 d
90.0* ± 0.0 b
0
1775 ± 430 b
0.141 ± 0.002 ab
12.7 ± 0.0 c
88.4 ± 0.0 b
7.2
1213 ± 148 b
0.165 ± 0.007 bc
14.8* ± 0.1 e
90.0* ± 0.0 b
Los valores con las mismas letras no arrojaron diferencias significativas al aplicar la prueba de Duncan con
0,05.*Temperatura y tiempo obtenidos en la parte isotérmica de la curva.
Los barridos de frecuencia de geles mixtos y conjugados se observan en la Figura 7. Podemos
observar que todos son geles verdaderos y que hay una leve disminución de G´ a medida que aumenta
la frecuencia aplicada en todos los sistemas. También se puede observar que los valores de G´ son
menores en el caso de los sistemas WPI/DX conjugados con respecto al sistema WPI/DX no
incubado, coincidiendo con los resultados obtenidos anteriormente.
Figura 7. Barridos de frecuencia de soluciones de WPI al 12% a distintos días de glicosilación (A) y de
soluciones WPI/DX con 7.2% p/p de DX a distintos días de glicosilación (B). En ambos casos: () 0, () 2,
().5 y () 9 días.
Conclusiones
La reacción de glicosilación se llevó a cabo en todas las condiciones estudiadas en los
sistemas WPI/DX, según los ensayos de cuantificación de grupos amino libres y OPA. Esta reacción
afectó en gran medida las propiedades de gelificación de estos sistemas. Mediante los ensayos de
reología oscilatoria se puedo determinar que tanto el tiempo como la temperatura de gelificación se
vieron afectados por la reacción de glicosilación, siendo este efecto mayor en sistemas WPI/DX.
También se pudo determinar que la firmeza de los geles disminuyó a medida que aumentaba el tiempo
de incubación.
Agradecimientos
CAI+D. PI-57283. Desarrollo de biomateriales a partir de proteínas de suero lácteas y
polisacáridos.
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